Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)

Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)Bài 1: Đánh giá khả năng kháng khuẩn (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

Môn học: Thực tập Nghiên cứu trong Phòng thí nghiệm

Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Thị Diệu Trang

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1 – Sáng thứ 4

Ngô Khánh Linh 20126786

Võ Sông Hương 20126254 Phạm Thị Kiều My 18126096

Tháng 06 năm 2022

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 3

1 Đặt vấn đề 3

2 Mục tiêu nghiên cứu 4

3 Nội dung nghiên cứu 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI KIỆU 5

1 Đông trùng hạ thảo 5

1.1 Phân loại 5

1.2 Nguồn gốc 5

1.3 Đặc điểm hình thái 6

1.4 Đặc điểm sinh học 6

1.4.1 Sự phân bố của đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 6

1.4.2 Cấu tạo hình thái của một số loài nấm thuộc chi Cordyceps 7

1.5 Ứng dụng 8

1.5.1 Chất chống oxy hóa 8

1.5.2 Kháng tế bào ung thư 9

1.5.3 Chống mệt mỏi và stress 9

1.5.4 Cải thiện hệ hô hấp 9

1.5.5 Chống sợi hóa gan 9

1.5.6 Kích thích hệ miến dịch 9

2 Vi khuẩn Salmonella sp 10

2.1 Phân loại 10

2.2 Nguồn gốc 10

2.3 Đặc điểm hình thái 10

2.4 Đặc điểm sinh học 11

3 Kháng sinh Cephalexin 11

3.1 Tính chất hóa học 11

3.1.1 Tính acid 11

3.1.2 Phân tích thay đổi cấu trúc để tăng độ bền với acid 12

3.1.3 Dược động học 12

3.2 Ứng dụng 13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

1 Vật liệu nghiên cứu 14

1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

1.2 Dụng cụ và thiết bị 14

1.3 Hóa chất 14

2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.1 Kiểu bố trí thí nghiệm 14

2.2 Các bước thực hiện: 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

1 Kết quả 16

2 Thảo luận 16

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 17

1 Kết luận 17

2 Kiến nghị 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ước tính trên toàn thế giới, có hàng chục triệu trường hợp nhiễm khuẩn Salmonella được báo cáo hàng năm Bệnh nhiễm khuẩn Salmonella (ngộ độc thực phẩm) là một bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa khá phổ biến hiện nay, ảnh hưởng đến lớp niêm mạc của ruột non, xảy ra khi vi khuẩn salmonella xâm nhập vào cơ thể Hầu hết các trường hợp ngộ độc nhẹ có thể tự hết mà không cần điều trị, nhưng trong một số trường hợp nặng hơn, bạn cần phải đi đến bệnh viện Bên cạnh đó, nhiễm Salmonella có thể đe dọa tính mạng

Salmonellae chủ yếu là nguyên nhân gây ra viêm dạ dày ruột, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng khu trú Các triệu chứng có thể là tiêu chảy, sốt cao với mệt lả hoặc triệu chứng nhiễm trùng khu trú Trẻ em có nhiều khả năng bị nhiễm trùng hơn người lớn Ngoài trẻ nhỏ, người lớn tuổi và những người có hệ miễn dịch yếu có nhiều khả năng bị nhiễm bệnh nhất

Từ hàng ngàn năm trước Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis – Ophiocordyceps sinensis) đã được ghi lại trong các cuốn y dược kinh điển như là một vị dược liệu nổi tiếng

quý hiếm và tốt cho sức khỏe con người.Theo y học cổ truyển, đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ấm, đi vào kinh phế, thận, mang đến rất nhiều công dụng cho sức khỏe con người như bổ phổi, trừ đàm, bình suyễn, ích thận, bồi bổ sức khỏe, trị lao lực, tăng cường sức khoẻ, nâng cao thể trạng, phòng tránh ung thư, tốt cho đường huyết, tịm mạch, huyết áp, Ngày nay những nghiên cứu khoa học hiện đại cũng đã chỉ ra, thành phần dưỡng chất quan trọng có trong đông trùng hạ thảo như Cordycepin, Adenosine, nhóm HEAA (Hydroxyethyl Adenosine Analogs), protein, vitamin và khoáng chất có tác dụng kháng ung thư, kháng vi sinh vật, ức chế quá trình di căn của các tế bào ung thư, nâng cao khả năng miễn dịch cho cơ thể, tăng cường sức khỏe Ngoài ra còn có tác dụng tăng cường các hoạt động miễn dịch, điều tiết phản ứng đáp tế bào lympho, ngăn cản các virus, vi khuẩn gây bệnh xâm cực kỳ hiệu quả

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đông trùng hạ thảo

3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đông trùng hạ thảo dựa trên phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch (Kirby Bauer)

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI KIỆU

1 Đông trùng hạ thảo

1.1 Phân loại

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Họ: Ophiocordycipitaceae

Bộ: Hypocreales

Chi: Ophiocordyceps

Hình 1: Nấm đông trùng hạ thảo 1.2 Nguồn gốc

Vị thuốc này thực chất là hiện tượng ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm thuộc chi Ophiocordyceps và/hoặc Cordyceps ký sinh Đó là một dạng ký sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học là Ophiocordyceps sinensis với sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes Thường gặp nhất là sâu non của loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus Ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Ophiocordyceps sinensis ký sinh Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á

và châu Úc với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á, đó là các cao nguyên cao hơn mặt biển

từ 4.000 đến 5.000 m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam

Cơ chế xâm nhiễm của loài nấm này vào cơ thể sâu hiện giờ vẫn chưa rõ Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh

từ các lỗ thở Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu Đến một giai đoạn nhất định thường

là vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử

Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy vào mùa hè vùng núi cao trên 4.000m ở cao nguyên Thanh Tạng (Thanh Hải-Tây Tạng) và Tứ Xuyên (Trung Quốc) Tuy nhiên, hiện

nay nhiều loài nấm thuộc chi Ophiocordyceps và Cordyceps được nuôi trồng trên quy mô

công nghiệp để tinh chế các cơ chất có dược tính

1.3 Đặc điểm hình thái

Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non

mà thành Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3–5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8

cm Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả tám cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà

1.4 Đặc điểm sinh học

Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng Loài nấm đầu tiên các nhà khoa học Trung Quốc xác định trên vùng núi trên cao

nguyên Tây Tạng thuộc chi Cordyceps là C sinensis ký sinh vào ấu trùng của loài bướm thuộc chi Thitarodes Năm 1878, các nhà khoa học phát hiện ra loài C militaris cũng ký sinh trên ấu trùng của các loài côn trùng thuộc chi Thitarodes

1.4.1 Sự phân bố của đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chi Cordyceps phụ thuộc

vào nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng của môi trường Chúng thường phân bố ở vùng núi có độ cao từ 2000-3000m so với mực nước biển Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm

về thông tin di truyền, các loài nấm thuộc họ này bao gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps

Nấm Đông trùng hạ thảo dùng để sản xuất dược liệu được xác định gồm hơn 680 loài khác nhau, chỉ riêng Trung Quốc đã tìm thấy hơn 60 loài Trong công bố của các nhà khoa

học Hàn Quốc, 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn Quốc được mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh bao gồm: C adaesanensis, C agriota Kawamura, C bifisispora, C crassispora, C discoideocapiata, C formicarum, C gemiculata, C gracilis, C heteropoda, C ishikariensis, C kyushuensis, C martialis, C militaris, C nutans, C ochraceostromata, C ophioglossoides, C oxycephala, C pentatoni, C pruinosa, C rosea,

C scarabaeicola, C sinensis, C sphecocephala, C tricentri, C yongmoonensis

Theo một số nghiên cứu cho thấy, các loài của chi nấm Cordyceps còn được tìm thấy

ở Thái Lan, Nhật Bản và Việt Nam Như vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông trùng

hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài có phạm vi phân

bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng

1.4.2 Cấu tạo hình thái của một số loài nấm thuộc chi Cordyceps

Trong tự nhiên, nấm Cordyceps để hoàn thành chu kỳ sinh trưởng của mình chúng

phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển phức tạp, từ giai đoạn sống trong đất tới sau khi lây nhiễm vào cơ thể ấu trùng, chúng chịu sự cạnh tranh với các vi khuẩn khác, thậm chí cạnh

tranh với các loài trong chi Cordyceps

Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps

C sinensis

Phần cơ thể ấu trùng giống như nhộng tằm, có chiều dài từ 3-5

cm, đường kính từ 3-8 mm, màu vàng đậm tới vàng nâu

Quả thể hình trụ mảnh, 4-7 cm chiều dài và khoảng 3 mm, với đỉnh nhọn

C gunnii

Phần cơ thể ấu trùng giống như nhộng tằm, dài từ 3 – 6 cm, đường kính 3 – 10 mm, vàng nâu đến nâu

Quả thể hình trụ, mập và thô, chiều dài 4-12 cm, đường kính 4

mm, với phần đầu phình ra hoặc phân nhánh ở đỉnh

C gracilis

Cơ thể ấu trùng giống như một con tằm, mảnh,chiều dài 2 – 4

cm và đường kính 2 – 5 mm;

màu vàng nâu, tím, nâu hoặc nâu đỏ

Quả thể như sợi chỉ, 2-3 cm chiều dài và khoảng 2 mm đường kính, với phần phình ra ở đỉnh, có hình cầu Quả thể bám không chắc

C barnesii

Cơ thể ấu trùng cong hình thận, ngắn, 1,5-2 cm chiều dài, đầu nhỏ, với một cặp răng

Chỉ có 1 quả thể, mảnh và cong, 2- 6 cm chiều dài và khoảng 2 mm đường kính

C

liangshanensis

Cơ thể ấu trùng giống con tằm, dày, chiều dài 3-6 cm, đường kính 6-10 mm; Bề mặt bên ngoài với màu nâu để màng màu nâu sẫm

Quả thể dạng sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, 10-30 cm chiều dài và đường kính 1-2 mm

cơ thể ấu trùng

Quả thể có kích thước to đều từ trên xuống dưới, hơi cong, chiều dài khoảng 5 cm, màu vàng cam đến màu đỏ da cam

1.5 Ứng dụng

Dựa theo tham khảo từ bài báo cáo phân tích xu hướng công nghệ về chuyên đề “Đông trùng hạ thảo – công dụng, xu hướng sản xuất và thương mại” (Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ TP HCM, 2014) Đông trùng hạ thảo có các ứng dụng theo y học hiện đại bao gồm những chức năng sau:

1.5.1 Chất chống oxy hóa

Trên thực nghiệm: dịch chiết bằng nước và rượu, cả cordyceps tự nhiên và nuôi cấy cho thấy tác dụng chống oxy hoá:

▪ Ức chế khả năng oxy hoá acid linoleic

▪ Khử hoạt tính của chất 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DDPH), hydrogen peroxide, gốc tự do hydroxyl, anion superoxide, hoạt tính bắt giữ kim loại

▪ Poly phenolic và flavonoid có trong Cordyceps là chất anti oxidants

1.5.2 Kháng tế bào ung thư

Nghiên cứu trên các loại tế bào ung thư khác nhau như: hạch, gan, đại tràng, tuyến

tiền liệt, và vú, cho thấy dịch chiết rượu từ Cordyceps có tác dụng chống tăng sinh của các loại tế bào ung thư này Một nghiên cứu khác cho thấy Cordyceps ức chế tăng sinh tế bào

ung thư đại tràng qua con đường ức chế sự thoái giáng của chất I-kappa B-alpha trong tế bào và ức chế hoạt tính của NF-Kappa B

1.5.3 Chống mệt mỏi và stress

Dịch chiết bằng nước nóng của Cordyceps sinensis có tác dụng chống mệt mỏi và

stress trên chuột ICR và chuột Sprague-Dawly

1.5.4 Cải thiện hệ hô hấp

Dịch chiết bằng cồn cho kết quả:

▪ Ức chế sự tăng sinh những tế bào BALF (Bronchoalveolar lavage fluids) được hoạt hóa bởi lipopolysaccharide (LPS)

▪ Ức chế sự sản xuất IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10 và INF – alpha trên BALF

1.5.5 Chống sợi hóa gan

Trên mô hình chuột Sprague –Dawly, gây sợi hóa gan bằng Dimethyl nitrosamine,

cho uống Cordyceps sinensis, kết quả cho thấy giảm đáng kể sợi hóa ở gan, bởi nó thúc đẩy

sự thoái giáng chất collagen như Hydroxyproline, ức chế metalloproteinase – 2 ở mô, collagen loại IV và loại I

1.5.6 Kích thích hệ miến dịch

Tính chất điều hòa hệ miễn dịch của polysaccharides từ Cordyceps sinensis đã được

khảo qua xét nghiệm máu ngoại vi Kết quả: dịch chiết có khả năng gây sản xuất yếu tố

2 Vi khuẩn Salmonella sp

2.1 Phân loại

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria

Họ: Enterobacteriaceae

Bộ: Enterobacteriales

Chi: Salmonella

Hình 2: Vi khuẩn Salmonella sp

2.2 Nguồn gốc

Năm 1874 nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi khuẩn

là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn

Năm 1880 Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người

Năm 1884, Georg Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi trường nuôi cấy thuần khiết

Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy

vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt theo tên của ông

2.3 Đặc điểm hình thái

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống Salmonella Salmonella là vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu hơi tròn, kích

thước 0,4 – 0,6 x 1 − 3 um, sống kị khí tùy nghi, không hình thành giáp mô và nha bào, có

khả năng di động nhờ lông mao có khoảng 7 đến 12 lông mao chung quanh thân, trừ S gallinarum và S pullorum gây bệnh cho gia cầm

Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 37⁰C trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng

phát triển các khuẩn lạc có đường kính 2 – 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất

2.4 Đặc điểm sinh học

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 x 0,5 – 1 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S gallimarum và S pullorum, không tạo bào tử, chúng phát triển

tốt ở nhiệt độ 6⁰C – 42⁰C, thích hợp nhất ở 35⁰C – 37⁰C, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở

pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 18⁰C – 40⁰C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày

Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển được trên các môi trường nuôi cấy

thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường

được dùng để phân lập Salmonella

Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có

tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu

đỏ Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi Thường không

lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường Simmons

Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong mỗi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác

3 Kháng sinh Cephalexin

3.1 Tính chất hóa học

3.1.1 Tính acid

Do có nhóm –COOH nên Cephalexin có tính acid, người ta vận dụng tính acid này vào điều chế các dạng:

▪ Muối với kim loại kiềm như với Na, K giúp dược chất dễ tan trong nước hơn