Khảo sát tình hình nhiễm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm da tại bệnh viện da liễu TP HCM

Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường chọn lọc dermatophytes test medium DTM, định danh bằng hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketocon

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2018

Tên đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm da tại bệnh viện Da liễu TPHCM

Số hợp đồng: 2018.01.44

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 06/2018 – 02/2019

TP Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2019

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 201

Tên đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm da tại bệnh viện Da liễu TPHCM

Số hợp đồng: 2018.01.44

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến

Đơn vị công tác: Khoa Dược

Thời gian thực hiện: 06/2018 – 02/2019

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 2

ĐẶT VẤN ĐỀ 3

TÓM TẮT 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM DA GÂY BỆNH 5

1.2.1 Lịch sử phát hiện nấm da 5

1.2.2 Tổng quan về nấm da 5

1.2.3 Phân loại nấm da 6

1.2.4 Các bệnh nấm da ở người 9

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm da 11

1.2 CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM DA 14

1.2.1 Xác định sự có mặt của nấm da từ mẫu bệnh phẩm 14

1.2.2 Nuôi cấy và phân lập nấm da 15

1.2.3 Phương pháp định danh nấm da 17

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái khóm nấm 17

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái hiển vi 17

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC KHÁNG NẤM 18

1.3.1 Phương pháp pha loãng 18

1.3.2 Phương pháp khuếch tán 19

1.3.3 Phương pháp khuếch tán dùng để xác định mức độ nhạy của các chất kháng nấm trên nấm da 19

1.4 TỔNG QUAN MỘT SỐ THUỐC KHÁNG NẤM VÀ ĐIỀU TRỊ 20

1.4.1 Thuốc kháng nấm ketoconazole 20

1.4.2 Thuốc kháng nấm terbinafine 22

1.4.3 Một số phác đồ điều trị nấm da 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25

2.1.4 Hóa chất và thiết bị 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Sàng lọc và định danh nấm da 26

2.2.2 Phương pháp thử độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ 33

3.1.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 33

3.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo độ tuổi 33

3.1.2.2 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo giới tính 34

3.1.2.3 Tỷ lệ nhiễm nấm theo vị trí trên cơ thể bệnh nhân 35

3.1.2 Sàng lọc và định danh vi nấm 36

3.1.2.1 Soi tươi trực tiếp 36

3.1.2.2 Sàng lọc nấm da bằng môi trường DTM 37

3.1.2.3 Đặc điểm hình thái khóm nấm và đặc điểm hình thái hiển vi 37

3.1.2.4 Định danh bằng các phản ứng khác 41

3.1.3 Độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm 45

3.2 THẢO LUẬN 51

3.2.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 51

3.2.2 Định danh nấm da 52

3.2.3 Độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tiếng Việt 55

Tiếng Anh 56 PHỤ LỤC PL1

nấm

NCCLS National Committee for Clinical

Laboratory Standards

Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Lâm sàng

MIC Minium inhibited concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction

Fragment Length Polymorphism

Phản ứng khuếch đại gen

và sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

Bảng 1.3 Phân bố chi nấm Trichophyton ở người và ở động vật [19], [20], [27] 8

Bảng 1.4 Sinh thái học nấm da 9

Bảng 1.5 Tiêu chuẩn về mức độ nhạy của nấm da theo Neo-Sensitabs [30] 20

Bảng 1.6 Cấu trúc và tính chất của ketoconazole 21

Bảng 2.1 Đặc điểm khóm nấm [38] 27

Bảng 2.2 Đặc điểm quan sát dưới kính hiển vi của nấm da [19], [20], [27] 29

Bảng 2.3 Kết quả thử nghiệm ure ở một số chủng nấm da [14] 30

Bảng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy của vi nấm với ketoconazole và terbinafine [30] 32

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo độ tuổi 33

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm da theo giới tính và nhóm tuổi 34

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo vị trí và giới tính 35

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khóm nấm và đặc điểm hiển vi 38

Bảng 3.5 Hình ảnh khóm nấm và hình thái hiển vi 40

Bảng 3.6 Kết quả định danh các vi nấm phân lập từ bệnh phẩm 45

Bảng 3.7 ĐKVKN đối với chủng nấm T rubrum 45

Bảng 3.8 ĐKVKN trên T mentagrophytes 46

Bảng 3.9 ĐKVKN trên T tonsurans, T verrucosum và T violaceum 47

Bảng 3.10 ĐKVKN trên M canis và M gypseum 48

Bảng 3.11 Mức độ nhạy cảm của nấm da với ketoconazole và terbinafine 50

Hình 3.1 Sợi nấm quan sát được khi soi tươi dưới vật kính 40X 37

Hình 3.2 Kết quả trên môi trường DTM 37

Hình 3.3 Microsporum canis phát triển trên môi trường cháo hoa 38

Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm môi trường ure 42

Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm môi trường BCP-MS-G 42

Hình 3.6 Kết quả thử nghiệm trên môi trường CMDA 43

Hình 3.7 Thử độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm terbinafine bằng phương pháp khuếch tán 49

Hình 3.8 ĐKVKN của ketoconazole trên T mentagrophytes 49

Hình 3.9 Phân bố mức độ nhạy cảm của nấm da với ketoconazole theo loài 51

Sơ đồ 3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo giới tính 35

Sơ đồ 3.3 Tỷ lệ nhiễm nấm phân bố theo vị trí nhiễm bệnh trên cơ thể 36

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ định danh vi nấm da [38] 44

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Số liệu về tình hình phân bố các chi/ loài

Chí Minh (Đã duyệt đăng tháng 3/2019)

Kỷ yếu Hội nghị ĐH Nguyễn Tất Thành hoặc 1 tạp chí chuyên ngành trong nướcTham gia đào tạo 2 Dược sĩ Đại học

- Tôn Hoàng Diệu (13DDS07)

- Nguyễn Lê Phương Uyên

(13DDS01)

Tham gia đào tạo 2 Dược sĩ Đại học

Thời gian đăng ký: từ ngày 06/2018 đến ngày 11/2018

Thời gian nộp báo cáo: ngày 16/11/2018

MỞ ĐẦU

Mở đầu: Bệnh nấm da khá phổ biến tại các vùng khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, mặc dù

bệnh chỉ khu trú ở da nông nhưng ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống Thời gian điều trị dài tác động lớn đến sự tuân thủ trị liệu của bệnh nhân, cũng là cơ hội phát sinh

đề kháng với thuốc kháng nấm

Đối tượng: Bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm nấm (da, tóc) điều trị tại bệnh viện Da liễu

TP HCM với các tiêu chuẩn chọn mẫu:

- Bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Da liễu từ 11-12/2017

- Bệnh nhân có kết quả soi tươi dương tính với hình ảnh “Sợi nấm có vách ngăn”

- Vị trí nhiễm bệnh có nhiều vảy

Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường chọn lọc

dermatophytes test medium (DTM), định danh bằng hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketoconazole, terbinafine theo hướng dẫn CLSI M44-A2, thay đổi theo Nweze

và cs (2010)

Kết quả: Từ 104 mẫu cho kết quả nhiễm "sợi nấm có vách ngăn”, phân lập trên DTM thu

được 55 mẫu thuần trong đó: Có 7 loài nấm da: T rubrum (36,36%), T mentagrophytes (32,73%), T tonsurans (14,55%), T verrucosum (3,64%), T violaceum (3,64%), M canis (5,45%) và M gypseum (3,64%) Nam mắc bệnh cao hơn nữ (65,38% so với 34,62%) Độ

tuổi 16 – 25 chiếm có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (41,35%),  15 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất (3,85%) Về vị trí nhiễm nấm, bẹn là vị trí nhiễm bệnh cao nhất (25,96%) sau đó đến đầu (1,92%) Về mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm, có 52,7% chủng nhạy cảm với ketoconazole; 21,8% nhạy cảm trung gian và có 25,5% chủng đã bị đề kháng với ketoconazole Tất cả các chủng nấm da ly trích từ bệnh nhân đều nhạy cảm với terbinafine (2 µg/ đĩa)

Kết luận: Hầu hết các chủng nấm da thuộc chi Trichophyton, 100% chủng nhạy cảm

terbinafine, có 52,73% chủng nhạy cảm với ketoconazole

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh về da và rối loạn về da ở người thường không đe dọa đến tính mạng nhưng gây cho bệnh nhân cảm giác ngứa ngáy và khó chịu, có thể biến dạng vùng da nhiễm bệnh và đặc biệt là ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống trong trường hợp các tổn thương lan rộng

Ngày nay, mức sống và kiến thức thường nhật của người dân Việt Nam đã được nâng cao nhưng vẫn còn thiếu sót về kiến thức điều trị bệnh nói chung cũng như bệnh nấm da nói riêng Điều đó dẫn đến hậu quả rất đáng lo ngại từ việc sử dụng thuốc không hợp lý Cụ thể

là, bệnh nhân thường lạm dụng corticoid khiến tình trạng nhiễm nấm nặng và cũng trở nên khó điều trị hơn Không những thế, đối với các bệnh nhân dùng đúng thuốc ngay từ khi phát hiện bệnh thường cũng mắc phải một sai lầm chính là không tuân thủ phát đồ điều trị của thầy thuốc, tự ý dừng thuốc hoặc không đủ kiện nhẫn điều trị làm bệnh diễn tiến mạn tính

và phức tạp Từ những lý do đã nêu, bệnh nhiễm nấm da và việc đề kháng với thuốc kháng nấm của các vi nấm da ngày càng lan rộng và cũng là một trong những vấn đề được nhiều người quan tâm Các thuốc kháng nấm thường được sử dụng như ketoconazole, clotrimazol dần bị đề kháng khi xuất hiện càng nhiều bệnh nhân điều trị thất bại Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm nấm và mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm da tại bệnh viện Da liễu TpHCM” từ tháng 11 – 12/2017, nhằm thực hiện các mục tiêu sau:

1 Khảo sát tình hình bệnh nhiễm nấm da trên đối tượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Da liễu Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 11 – 12/2017

2 Phân lập và định danh các chủng vi nấm ly trích từ bệnh phẩm bằng phương pháp

lý

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Bệnh nấm da khá phổ biến tại các vùng khí hậu nóng ẩm như Việt Nam, mặc

dù bệnh chỉ khu trú ở da nông nhưng ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống Thời gian điều trị dài tác động lớn đến sự tuân thủ trị liệu của bệnh nhân, cũng là cơ hội phát sinh đề kháng với thuốc kháng nấm

Mục tiêu: Xác định thành phần loài và tính nhạy cảm với ketoconazole, terbinafine của các

chủng nấm da phân lập từ bệnh phẩm tại Bệnh viện Da liễu TP Hồ Chí Minh từ tháng 11/2017 – 12/2017

Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Phân lập nấm da từ bệnh phẩm trên môi trường

chọn lọc dermatophytes test medium (DTM), định danh bằng hình thái học và sinh hoá, xác định tính nhạy cảm với ketoconazole, terbinafine theo hướng dẫn CLSI M44-A2, thay đổi theo Nweze và cs (2010)

Kết quả: Trong các mẫu thu thập từ bệnh phẩm trong tháng 11-12/2017 của bệnh nhân biểu

hiện lâm sàng nấm da, có 104 mẫu da dương tính với xét nghiệm KOH, phân lập trên môi

trường chọn lọc thu được 55 chủng, trong đó chi Trichophyton chiếm ưu thế (90,91%) so với chi Microsporum (9,09%) và không có chi Epidermophyton Về mức độ nhạy cảm với

thuốc kháng nấm, có 52,7% chủng nhạy cảm với ketoconazole; 21,8% nhạy cảm trung gian

và có 25,5% chủng đã bị đề kháng với ketoconazole Tất cả các chủng đều nhạy cảm với terbinafine

Kết luận: Hầu hết các chủng nấm da thuộc chi Trichophyton, có 52% chủng nhạy cảm với

ketoconazole và 100% chủng nhạy cảm terbinafine

Từ khóa: nấm da, ketoconazole, terbinafine, mức độ nhạy cảm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM DA GÂY BỆNH

1.2.1 Lịch sử phát hiện nấm da

- Năm 1841, David Gruby – một bác sĩ người Hungary khi làm việc tại Paris đã mô tả một cách cẩn thận một số loại nhiễm trùng da liễu khác nhau Đến năm 1843, ông phát hiện và

đặt tên cho chi nấm da Microsporum và mô tả loài Microsporum audouinii dựa trên sự xuất

hiện của loài nấm này trên lâm sàng

- Năm 1845, chi nấm da Trichophyton được phát hiện và mô tả bởi Per Henrik Malmsten,

một nhà điều tra viên người Thụy Điển

- Năm 1910, chi Epidermophyton được biết đến nhờ công của nhà khoa học Raymond

Sabouraud, đây là chi nấm cuối cùng được tìm ra trong tổng số 3 chi nấm da [12]

1.2.2 Tổng quan về nấm da

Bệnh nấm da là một bệnh truyền nhiễm phổ biến gây ra bởi các vi nấm ưa keratin ký sinh trong các mô cơ thể người như lớp biểu bì, tóc và móng [25] Nấm da thuộc họ Gymnoascaceae và cho đến nay đã có khoảng 40 loài nấm da được biết đến, chúng thuộc 3

chi: Trichophyton, Microsporum và Epidermophyton [10]

Chu kỳ sinh sản của nấm da gồm hai giai đoạn, vì vậy một loài được biết với hai tên riêng biệt nhau, một tên để chỉ giai đoạn sinh sản vô tính (anaphorm) và một tên để chỉ giai đoạn

sinh sản hữu tính (teleomorph) Tên gọi cho giai đoạn sinh sản hữu tính của Microsporum là Nannizzia và của Trichophyton là Arthroderma sống trong đất

Bảng 1.1 Giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính của nấm da [10]

Tên ở giai đoạn sinh sản vô tính Tên ở giai đoạn sinh sản hữu tính

Trichophyton simii

Arthroderma benhamiae Arthroderma simii

Nấm da chỉ xâm nhập vào tổ chức sừng Tùy vào mức độ xâm nhập của nấm và đáp ứng miễn dịch của cơ thể mà có biểu hiện viêm hạn chế hoặc viêm rõ trên lâm sàng [5] Chúng

có khuynh hướng gây nhiễm ngoài da ở các vị trí khác nhau trên cơ thể, tạo ra một hoa văn giống hình vòng - do đó được gọi với thuật ngữ là “Ringworm” Các bệnh do nấm da gây ra thường được điều trị thành công nhưng sự thành công phụ thuộc vào vị trí nhiễm bệnh và sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân [23]

Bệnh nấm da rất phổ biến, có ít nhất 10% dân số thế giới bị nhiễm nấm da Bệnh lây nhiễm chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với các đối tượng đã nhiễm nấm Ở môi trường thích hợp, vi nấm có thể sống ngoài cơ thể ký chủ ít nhất một năm Do vi nấm có mặt khắp nơi, rất khó xác định được nguồn lây nhiễm Nấm gây bệnh cho người khác nhau tùy thuộc vị trí bệnh trên cơ thể và theo vùng địa lý, tuy nhiên trên phạm vi toàn thế giới có hai loài nấm da thường

được ly trích từ bệnh phẩm là Trichophyton rubrum (T rubrum) và Trichophyton mentagrophytes (T mentagrophytes) chiếm 60 - 90% trong tổng số ca bệnh nấm da

1.2.3 Phân loại nấm da

Có thể phân loại nấm da dựa vào:

− Dựa theo đặc điểm bào tử đính lớn, nấm da được chia thành ba chi chính:

Trichophyton (gây nhiễm trùng trên da, tóc và móng), Epidermophyton (gây nhiễm trùng da và móng) và Microsporum (gây nhiễm trùng trên da và tóc) [10], [19]

− Dựa trên phương thức lây truyền, một số nấm da nhiễm trên người (được gọi là Anthropophilic) và thường được lây truyền từ người sang người Một số nấm da ưa thú (gọi là Zoophilic) lây nhiễm từ động vật sang người và các nấm da ưa đất (được gọi là Geophilic) [10]

− Dựa theo vị trí nhiễm bệnh, nấm da được chia thành nấm da ở vùng đầu, mặt, râu, cơ thể, tay, bẹn, chân và móng Ngoài ra các biến thể trên lâm sàng gặp phải bao gồm nấm Tinea imbricata, Tinea pseudoimbricata và u hạt Majocchi [21]

Người: hiếm Heo: chủ yếu

Người: hiếm Gia cầm: chủ yếu

Nhiễm trùng ở người: 1% (bẹn, chân và móng tay) Hiếm thấy ở động

vật Khóm

khoảng cách gần nhau

Chủ yếu là màu vàng nâu-vàng sẫm với viền trắng Sợi nấm phát triền rất nhanh

Khóm nấm dạng bột từ trắng đến vàng sẫm (màu vàng-nâu)

Khóm nấm dạng nhung

từ trắng đến hồng

Màu xanh lá cây ô liu đến màu vàng-mù tạt Khóm nấm gấp lại và sấn sùi (tạo thành rãnh) Mặt sau Vàng chuyển sang nâu theo độ tuổi

Màu kem, thuộc da màu

đỏ nâu

Ban đầu màu cam, sau

đó màu đỏ-nâu

Sắc tố màu đỏ khuếch tán vào môi trường

Nhiều, hình chùy Thường cong, vách mỏng trơn, từ 4-10 vách ngăn

Hình chùy đầu cùn Thành mỏng mịn, đính chùm từ 2, từ 2-6 tế bào

Không có

T mentagrophtes T tonsurans T rubrum T verrucosum T equinum

Chỉ nhiễm bệnh ở người:

45% (thường ở da đầu, cũng có ở da và móng)

Chỉ nhiễm ở người: 41%

(thường ở da, chân, tay, móng, bẹn) Hiếm gặp ở động vật

Gia súc: thường gặp nhưng ở người, ngựa, cừu: thỉnh thoảng

Người: rất hiếm Ngựa: thường thấy

Trắng đến vàng sẫm, mịn mượt và phủ lông tơ

Trắng, đôi khi màu vàng hoặc xám Bề ngoài mịn mượt, có thể có nếp gấp, khóm nhỏ

Màu kem cho đến màu

da và mượt như nhung

Màu đỏ đậm, rượu vang, đôi khi màu nâu, màu vàng hoặc không màu

Trắng, đôi khi vàng Vàng đến đỏ nâu

2-8 tế bào, các cạnh song song Hiếm gặp

Hiếm, thành dài, mỏng, trơn, chuỗi chlamydospore

Hiếm, hình chùy, thành mỏng và mịn

Thú (nhím) Thú (chuột) Thú (bò) Người

Người Người

Người Thú (ngựa) Người Người Thú (khỉ) Người Người

Khắp thế giới

Khắp thế giới Khắp thế giới Châu Âu, châu Phi Khắp thế giới Khắp thế giới Châu Âu, châu Phi, Châu Á

Khắp thế giới Các đảo Thái Bình Dương

Châu Âu, châu Phi Khắp thế giới Châu Phi Châu Âu, châu Phi

Ấn Độ Châu Phi Châu Phi

Thường gặp

Thường gặp Thường gặp Thỉnh thoảng Hiếm

Thường gặp Thường gặp

Thường gặp Vùng nội dịch

Vùng nội dịch Hiếm

Vùng nội dịch Vùng nội dịch Thỉnh thoảng Vùng nội dịch Vùng nội dịch

Người Người Đất Thú (gà)

Khắp thế giới

Mỹ Khắp thế giới Khắp thế giới Khắp thế giới Châu Âu, châu Á Khắp thế giới Khắp thế giới

Thường gặp Hiếm Hiếm Thỉnh thoảng Thường gặp Vùng nội dịch Thỉnh thoảng

M nanum

M persicolor

Thú (heo) Thú (chuột đồng)

Khắp thế giới Châu Âu, Mỹ

Hiếm Hiếm Hiếm

Epidermophyton sp

1.1.3.1 Bệnh nấm tóc

Bệnh nấm tóc hay còn gọi là chốc đầu (Tinea Capitis) là bệnh nhiễm trùng liên quan đến da

đầu do các chi nấm Microsporum và Trichophyton gây ra Sự nhiễm trùng có thể chỉ từ nhẹ

với ban đỏ và một vài chỗ bị lốm đốm hay những nốt tóc màu xám xỉn đến các phản ứng viêm nặng hơn như viêm nang lông, hình thành kerion và sẹo rộng, gây hói, đôi khi kèm theo sốt, mệt mỏi và bệnh bạch huyết khu trú Cả 2 vùng da và tóc đều bị ảnh hưởng Sự nhiễm nấm có thể được miêu tả như ectothrix - nhiễm nấm kiểu phát ngọai (bào tử hình thành ở bên ngoài của sợi tóc) hoặc endothrix - nhiễm nấm kiểu phát nội (bào tử hình thành

bên trong sợi tóc) Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh là T tonsurans (endothrix) thay vì Microsporum audouinii (M audouinii) hay Microsporum canis (M canis) (ectothrix) [35]:

− Nhiễm nấm kiểu phát nội (Endothrix): bào tử nấm được hình thành trong thân sợi tóc Biểu hiện của bệnh biến đổi từ các mảng tóc rụng có giới hạn rõ, kèm với nổi ban đỏ và bong vảy da Thường tóc gãy ngang mức vảy da, sự viêm giới hạn, hoặc tóc gãy, da đầu viêm bờ gồ cao cộng với viêm nang lông trong dạng chốc đầu chấm đen Các dạng tóc nhiễm nấm này rất khó chuẩn đoán

− Nhiễm nấm kiểu phát ngoại (Ectothrix): bào tử nấm bao quanh sợi tóc Tóc gãy ở bất kỳ điểm nào nhưng thường cách da đầu vài milimet Da đầu thường viêm và cho những vùng rụng tóc giới hạn Da đầu viêm nặng hoặc kerion có thể xảy ra ở tóc nhiễm phát nội lẫn phát ngoại, nhưng thường gặp ở phát ngoại

1.1.3.2 Bệnh ở da nhẵn

− Hắc lào: tổn thương hình vòng tròn lan rộng, bờ hơi gồ cao có vảy và có mụn rộp, ở giữa

có màu hơi nhạt Một số trường hợp kích thước và hình dạng của tổn thương cao thể thay đổi tùy vào mức độ viêm Thường viêm mạnh hơn trong trường hợp nhiễm trùng do nấm

ưa thú như M canis Khi nhiễm T rubrum phản ứng viêm ít hơn và vết thương lan rộng,

bờ ít giới hạn

− Vảy rồng: nấm bắt đầu mọc ở một điểm rồi lan rộng có khi cả thân mình trừ mặt và đầu,

do bệnh kéo dài lâu năm Da không viêm nhưng tróc vảy tạo thành nhiều vòng đồng tâm

1.1.3.3 Bệnh nấm bẹn

Bệnh thường gặp ở vùng khí hậu nóng ẩm, chủ yếu ở nam giới Nấm nhiễm ở vùng háng,

quanh hậu môn và đáy chậu và đôi khi xuất hiện ở đùi trên T rubrum và Epidermophyton floccosum (E floccosum) là các nguyên nhân thường gặp nhất Tổn thương hồng ban đỏ nâu

và phủ vảy khô Chúng thường có hai mặt và đối xứng, kéo dài xuống hai bên của đùi bên

trong và có đường viền nổi rõ, thường thấy nổi mụn nhỏ đối với nhiễm E floccosum Nếu nhiễm Trichophyton sp., tổn thương thường không đối xứng hai bên bẹn và có khuynh hướng

lan lên trên thân mình [38]

1.1.3.4 Bệnh nấm chân

Bàn chân, đặc biệt là lòng bàn chân và các kẽ ngón chân, là những vị trí thường xuyên xuất hiện bệnh lý liên quan đến nấm da Biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất là da bị sần sùi, bong tróc và nứt, chủ yếu ở khoảng cách giữa các ngón chân thứ tư và thứ năm Những biểu hiện thường gặp khác là tăng sừng mạn tính dẫn đến các vảy bạc phủ lên da làm da nhợt nhạt ở lòng bàn chân, gót và cạnh bàn chân Đối với tình trạng viêm cấp tính, đặc trưng bởi sự hình

thành các mụn ghẻ, mụn mủ, và đôi khi là chất nhầy, thường xuyên nhất là do T mentagrophytes Các tác nhân khác cũng gây nấm chân là T rubrum, T mentagrophytes var interdigitale và E floccosum

− Bệnh bắt đầu từ mặt trên của móng (nấm móng trắng ở mặt trên), vi nấm gây bệnh thường

là T mentagrophytes var interdigitale

Bệnh nhân nhiễm nấm móng thường bị ở những vị trí khác như lòng bàn chân, kẽ chân Ở

Việt Nam, vi nấm gây nhiễm thường gặp là T rubrum, T mentagrophytes và

E floccosum [1], [10]

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm da

1.1.4.1 Ngoài nước

Bệnh nấm da có xu hướng ngày càng gia tăng trong những năm gần đây Tỷ lệ mắc bệnh nấm da so với các bệnh ngoài da ở Đông Nam Á là 40 - 60%, còn ở Việt Nam là 5 - 15% Ở Việt Nam, khí hậu, điều kiện vệ sinh, tập quán còn thấp là điều kiện lý tưởng cho bệnh nấm

da phát triển, kéo dài và phát sinh chủng đề kháng thuốc Trên thế giới, đã có các nhà khoa học nghiên cứu về vấn đề này, có thể kể đến như:

− Một nghiên cứu tại bệnh viện trường đại học Bari (Italia) trong khoảng thời gian từ 2005

- 2010 đã khảo sát 6133 bệnh nhân với kết quả cho thấy tỉ lệ cao nhất là bệnh nấm móng với 39,2%, tiếp theo là bệnh nấm thân với 22,7%, nấm bàn chân với 20,4% Đồng thời

kết quả từ quá trình định danh bằng phương pháp cổ điển cho thấy tỷ lệ nhiễm T rubrum

là 64%, T mentagrophytes là 10%, và M canis chiếm 14% [22]

− Maria Elisabete da Silva Barros, Daniel de Assis Santos (2007) thử tính nhạy cảm của 4 thuốc kháng nấm (fluconazole, itraconazole, terbinafine và griseofulvin) trên 2 chủng

thường gặp là T mentagrophytes và T rubrum Kết quả cho thấy các chủng đều nhạy

cảm với terbinafine, itraconazol, sau đó đến ketoconazole, đối với griseofulvin thì mức

độ nhạy cảm không ổn định [17]

− Gadangi Indira (2014) tiến hành nghiên cứu trên 119 bệnh nhân nhiễm nấm da trên đối

tượng bệnh nhân tại Ấn Độ với tỉ lệ phân bổ theo loài tập trung chủ yếu ở T rubrum (n=40), T mentagrophytes (n=19), T violaceum (n=15), M gypseum (n=12), E flocossum (n=9), còn lại là các loài khác Giá trị MIC của terbinafine là thấp nhất so với

ketoconazole, itraconazole, griseofulvin và fluconazole Như vậy, terbinafine có hiệu quả trị liệu tốt nhất so với các thuốc khác [24]

− Mona Fattouh Mohamed Shalaby và cộng sự (2016) khảo sát bệnh nhiễm nấm da trên

110 bệnh nhân, cho thấy tỉ lệ nhiễm nấm da M canis (52,7%), M.gypseum (20,9%), T mentagrophytes (16,4%), và M audouinii (10%) Tỉ lệ nhạy cảm với clotrimazole là

95,5% và miconazole là 84,5% [33]

Tình hình nghiên cứu dịch tễ về sự phân bố các loài vi nấm và sử dụng thuốc kháng nấm trên bệnh nhân từ các công bố quốc tế vẫn chưa nhiều Qua các bài báo, có thể thấy rằng tình hình bệnh nhiễm nấm ngày càng tăng, cũng như bắt đầu có sự xuất hiện tình trạng đề kháng thuốc kháng nấm và tăng dần theo thời gian Cần thêm các nghiên cứu trong lĩnh vực này để cập nhật kịp thời các thông tin dịch tễ học cũng như thông tin về hiệu quả sử dụng thuốc kháng nấm

1.1.4.2 Trong nước

Tính đến nay, chưa có nhiều các đề tài trong nước nghiên cứu về nấm da ở người và độ nhạy cảm của các chủng nấm này với thuốc kháng nấm đang dùng Dưới đây là các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này:

− Năm 2012, Lê Chuyển, Lê Thanh Hải, Trần Thanh Tường tiến hành khảo sát 252 người

bị nhiễm nấm với tình hình nhiễm nấm: tỷ lệ nhiễm nấm cao nhất ở độ tuổi

21 - 40 chiếm 55,95% (141/252); làm nông chiếm tỷ lệ cao nhất 46,04%, lao động phổ thông chiếm 22,61%; cao nhất là nhiễm nấm da nhẵn 39,28%, tiếp đến là nấm sinh dục

34,88% Về tình hình sử dụng thuốc kháng nấm: tỷ lệ dùng thuốc kháng nấm không theo

đơn 67,46% so với theo đơn 32,54% [3]

− Cũng trong năm này, Nguyễn Vũ Giang Bắc, Huỳnh Thể Hà, Nguyễn Đinh Nga đã khảo

sát sự phân bố của nấm da ly trích từ bệnh nhân cho thấy chi Trichophyton vẫn là chi nấm gây bệnh chiếm ưu thế (95,31%), T rubrum/T tonsurans (76,56%), T mentagrophytes (12,5%), M canis (1,56%), M gypseum (1,56%), M audouinii (1,56%) Kết quả MIC

(Minimum Inhibitory Concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu) đánh giá mức độ đáp ứng với ketoconazole gia tăng trong quần thể nấm da khảo sát cho thấy cần có những khuyến cáo cần thiết trong việc sử dụng ketoconazole hợp lý [6]

− Năm 2013, Tôn Nữ Phương Anh và cộng sự đã nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 181 bệnh nhân có kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp dương tính với các bệnh phẩm da, tóc, móng

để khảo sát tình hình phân bố các loài nấm da theo thể bệnh Kết quả cho thấy nấm da (dermatophytes) là 90,64%, bao gồm [2]:

+ Chi Trichophyton là 82,91%, trong đó: T rubrum (58,01%),

T mentagrophytes (14,36%), T tonsurans (3,31%), T violaceum (2,76%),

T erinacei (1,66%), T schoenleini (1,10%), T soudanense (0,55%) và T verrucosum (1,10%)

+ Chi Microsporum là 7,18%, trong đó: M gypseum (4,42%), M canis (2,21%) và

M persicolor (0,55%)

+ Chi Epidermophyton là 0,55%, trong đó chỉ có duy nhất loài E floccosum (0,55%)

− Bùi Tố Quyên (2013) đánh giá tình hình sử dụng thuốc điều trị bệnh nấm da tại bệnh viện

Da liễu Hà Nội, khi điều trị với một số thuốc như ketoconazole, terbinafine, clotrimazol

có tỉ lệ khỏi bệnh chiến 87,6%, tiến triển bệnh khá chiếm 8,8% và xuất hiện tỷ lệ 3,6% bệnh nhân điều trị kém đáp ứng [11]

− Năm 2016, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thái Dũng và cộng sự xác định thành phần

nấm da phổ biến nhất là T rubrum (67,2%) tiếp theo là các loài Trichophyton khác và Microsporum sp.; sử dụng terbinafine dạng kem bôi có tác dụng với nấm da thể nhẹ và

vừa, còn thể nặng cần phối hợp thêm với dạng uống [15]

− Quách Thị Hồng Dung (2016) khảo sát tình hình nhiễm nấm ngoại biên, kết quả cho thấy

tất cả các chủng nấm da ly trích từ bệnh nhân đều nhạy cảm với terbinafine, xuất hiện một số chủng nấm chỉ ở mức độ nhạy cảm trung gian và đã có chủng đề kháng (2/52) với ketoconazole [4]

Như vậy, các nghiên cứu trong nước vẫn còn tập trung nhiều ở dịch tễ phân bố nấm da hay các yếu tố liên quan đến bệnh và hiệu quả điều trị của các phát đồ trên lâm sàng Bên cạnh

đó, số liệu từ các đề tài mang tính chất địa phương Nghiên cứu về đề kháng thuốc kháng nấm vẫn chưa nhiều mặc dù các số liệu về đề kháng thuốc của vi nấm càng lúc càng tăng

Do đó, cần có thêm những nghiên cứu về mức độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm của nấm

da để cập nhật thông tin về tình hình bệnh nhiễm nấm da hiện nay

1.2 CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM DA

Thực hiện các thử nghiệm nhằm xác định sự có mặt của nấm da trong mẫu bệnh phẩm, sau

đó tiến hành nuôi cấy, phân lập ở các bước tiếp theo Để định danh các chi nấm da thường dựa trên đặc điểm khóm nấm nuôi cấy trên thạch và đặc điểm hình thái quan sát dưới kính hiển vi Để định danh đến mức loài thường cần nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt hoặc một số phản ứng sinh hóa như phản ứng ure, phản ứng BCP,…

1.2.1 Xác định sự có mặt của nấm da từ mẫu bệnh phẩm

Sử dụng phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp với dung dịch KOH 10 - 20% Các bệnh phẩm

là sợi tóc, mẫu vụn móng tay, vảy da được đặt lên lam kính có sẵn 1 - 2 giọt dung dịch KOH

10 - 20%, hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới tác dụng của kiềm và nhiệt độ sẽ làm các tế bào tách rời nhau ra và lớp keratin trong suốt, để dễ dàng quan sát hình ảnh vi nấm trong các vảy da dưới kính hiển vi Đối với bệnh phẩm có nhiễm nấm sẽ dễ dàng quan sát thấy những sợi nấm và những bào tử đốt dễ phân biệt với tế bào động vật Tuy nhiên phải lưu ý phân biệt giữa những hạt dạng sợi, dạng mỡ, những tế bào sừng với tế bào nấm cần quan sát Trường hợp da và móng: trên nền tế bào biểu bì của da và móng có những sợi tơ

nấm phân nhánh, có vách ngăn, đôi khi sợi tơ nấm đứt khúc thành chuỗi bào tử đốt Trường hợp tóc: dựa vào vị trí nhiễm nấm ở sợi tóc có thể quan sát được hai kiểu tóc nhiễm phát nội

và tóc nhiễm phát ngoại [26]

1.2.2 Nuôi cấy và phân lập nấm da

1.2.2.1 Môi trường cơ bản Sabouraud 4%

1.2.2.2 Phương pháp xét nghiệm trực tiếp (soi bệnh phẩm dưới kính hiển vi) chỉ cho biết có nấm da trong mẫu bệnh phẩm hay không nhưng không thể biết

đó là loài nấm gì, vì vậy cần phải tiếp tục nuôi cấy để phân lập và định danh

vi nấm Môi trường hay dùng nhất là môi trường Sabouraud, thường nuôi cấy

ở nhiệt độ phòng, sau 1 - 2 tuần quan sát sự phát triển của vi nấm có thể giúp xác định chi/loài Trên thực tế tỷ lệ giữa triệu chứng lâm sàng, kết quả soi trực tiếp và nuôi cấy là 3 : 2 : 1 (3 trường hợp có triệu chứng lâm sàng thì có 2 trường hợp soi trực tiếp cho kết quả dương tính và khi nuôi cấy thì có 1

trường hợp vi nấm mọc trên môi trường) Môi trường Sabouraud có kháng

sinh

Khi phân lập nấm da thường có các vi khuẩn và nấm mốc hoại sinh phát triển do vậy có thể

sử dụng môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh thích hợp để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và các nấm mốc khác, chỉ cho nấm da phát triển Môi trường Sabouraud bổ sung penicilin, streptomycin và cycloheximide: tiệt trùng môi trường trong nồi hấp ở nhiệt độ

1200C, 1 atm trong 10 - 15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn khoảng 500C bổ sung vào 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg cycloheximide vào khuấy đều, đổ vào ống nghiệm hoặc đĩa petri Môi trường này được dùng để phân lập, quan sát hình thái khóm nấm

da

1.2.2.3 Môi trường DTM

Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium) dùng để sàng lọc cơ bản, giúp xác định sự

có mặt của nấm da trong mẫu bệnh phẩm Khi nuôi cấy nấm da trong môi trường này ở nhiệt

độ phòng trong 2 tuần, nấm da (nếu có) sẽ phát triển và chuyển màu môi trường từ vàng sang

đỏ [37] Môi trường DTM được phát triển trên nền môi trường Sabouraud có bổ sung cycloheximid và kháng sinh chloramphenicol ức chế sự tăng trưởng của nấm mốc hoại sinh

và vi khuẩn, cùng với chỉ thị đỏ phenol Nấm da phát triển trên môi trường DTM sẽ sử dụng hợp chất nitơ tạo ra kiềm đổi màu chỉ thị đỏ phenol từ vàng sang đỏ (khi pH > 7)

1.2.2.4 Phương pháp nuôi cấy trên lam kính

Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính để nghiên cứu cơ quan sinh sản

vô tính cũng như các thành phần khác của vi nấm nói chung Khi nuôi cấy, vi nấm phát triển trên lam nên hình thái vi nấm rõ ràng, đầy đủ và không bị dập nát Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại xác định các loài nấm da Hệ thống bao gồm: đĩa petri chứa que chữ U và lam đã hấp tiệt trùng 121oC trong 15 phút ở 1 atm, sau đó dùng dao mũi mác cắt thạch thành hình vuông đặt lên lam Tiến hành cấy vi nấm lên bốn cạnh thạch, đặt lamell đã tiệt trùng lên mặt thạch, để ở nhiệt độ phòng Sau 7 - 10 ngày, vi nấm sẽ phát triển, lan ra xung quanh và phát triển trên lam Nhấc nhẹ nhàng khối thạch ra khỏi lam, nhỏ thuốc nhuộm nấm lên lam, đậy lamell và rồi đem soi dưới kính hiển vi

Hình 1.1 Mô tả quy trình nuôi cấy vi nấm trên lam

1.2.3 Phương pháp định danh nấm da

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái khóm nấm

Các đặc điểm khóm cần quan sát bao gồm: Màu sắc của khóm nấm ở mặt trên và mặt dưới, tính chất bề mặt khóm (dạng bột, dạng nhung, dạng bông hay nhẵn, độ cao khóm, kiểu mọc của sợi, hình dạng rìa khóm v.v.) và tốc độ mọc [26]

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái hiển vi

Tiêu bản nấm trong nước cất: Trong một số trường hợp có thể soi hình dạng nấm trong giọt

nước Lợi ích của phương pháp này là chỉ số khúc xạ của ánh sáng đi qua tiêu bản và chỉ số khúc xạ của nước khác nhau ít nên hình ảnh của nấm được nhìn rõ Mặt khác do sự chênh lệch về nồng độ giữa trong và ngoài tế bào nấm nên nước khuếch tán vào trong tế bào, làm

tế bào nấm tăng kích thước, dễ dàng quan sát Trường hợp cần đo kích thước thì không ứng dụng được phương pháp này

Tiêu bản nấm trong dung dịch glycerin: Nhược điểm của tiêu bản trong nước là không giữ

tiêu bản được lâu vì nước dễ bay hơi, làm khô tiêu bản Tiêu bản trong glycerin giữ được lâu hơn vì glycerin hạn chế sự bay hơi và hình ảnh quan sát vẫn rõ

Tiêu bản nhuộm: Để nhận biết và phân biệt các cơ quan hay các bộ phận của nấm như bào

tử đính lớn, bào tử đính nhỏ, thành tế bào, bề mặt của bào tử hay vách ngăn của nấm người

ta thường nhuộm nấm với thuốc nhuộm Lactophenol coton blue (LPCB)

1.2.3.3 Định danh bằng môi trường CMDA

Môi trường CMDA (Cornmeal Dextrose Agar) là môi trường nuôi cấy nấm da và nghiên

cứu các loài Candida sản xuất chlamydospore Việc bổ sung dextrose làm tăng khả năng tạo sắc tố của một số loài Trichophyton [24] CMDA được dùng để phân biệt các chủng T mentagrophytes với T rubrum dựa trên sự tạo thành sắc tố Các chủng T rubrum sẽ cho sắc

T mentagrophytes sẽ cho nhiều màu sắc khác nhau từ không màu cho đến nâu đỏ [16], [32]

1.2.3.4 Định danh bằng môi trường BCP-MS-G

Môi trường BCP-MS-G (Bromocresol Purple – Milk Solid – Glucose) hay còn gọi là môi trường thạch sữa rắn được tìm thấy bởi Fischer và Kane (1971) để xác định nấm da mà không

cần ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm men T mentagrophytes khi tăng trưởng sẽ làm thay đổi pH kiềm sau 7 ngày trên môi trường BCP-MS-G, trong khi đó T rubrum tăng trưởng

hạn chế và không làm thay đổi pH của môi trường ở cùng một khoảng thời gian Năm 1988,

Summerbell cùng cộng sự đánh giá độ tin cậy của BCP-MS-G agar và môi trường này cho

thấy hiệu quả cao trong việc phân biệt T rubrum và T mentagrophytes Khi được sử dụng

chung với môi trường khác (như thạch ure, agar bột ngô…) BCP-MS-G có thể được dùng

để xác định các chủng nấm da lâm sàng trong vòng 7 - 10 ngày [29]

1.2.3.5 Định danh bằng phản ứng ure

Phản ứng này giúp phân biệt các chủng nấm trong chi Trichophyton, không có tác dụng định danh một chủng nấm cụ thể Phản ứng dương tính với T mentagrophytes và T tonsurans,

âm tính với T rubrum Dấu hiệu nhận biết phản ứng dương tính là môi trường ure chuyển

từ màu cam sang màu hồng tím sau khi cấy khoảng 2 - 4 ngày [34]

1.2.3.6 Các phương pháp định danh khác

− Kỹ thuật định danh nấm bằng PCR-RFLP với mồi ITS1-ITS4, phân cắt giới hạn bằng enzyme MvaI và HaeIII

− Kỹ thuật định danh vi nấm bằng phương pháp giải trình tự

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC KHÁNG NẤM

Phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán là hai phương pháp chính dùng để xác định tác dụng kháng nấm của các chất hay chế phẩm Các phương pháp chuẩn của CLSI có thể được biến đổi để phù hợp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng chủng vi nấm khác nhau hay các dạng bào chế của các chế phẩm khác nhau của chất thử nghiệm, hoặc thuận tiện hơn, kinh tế hơn, dễ thực hiện và nhanh hơn với điều kiện phương pháp biến đổi cho kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn, có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng [9]

1.3.1 Phương pháp pha loãng

Nguyên tắc: Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ theo cấp số nhân trong

môi trường đã cấy nấm Độ đục của môi trường thử được xác định bằng mắt thường hoặc bằng quang phổ kế, thường được dùng làm điểm dừng khi đọc kết quả Ở những nồng độ chất thử có tác dụng ức chế vi nấm, các ống thử sẽ trong; khi chất thử không

có tác dụng ức chế vi nấm thì vi nấm vẫn phát triển bình thường làm môi trường trở nên đục [9]

Kết quả xác định được bằng phương pháp pha loãng mang ý nghĩa định lượng Mức

độ ức chế của chất thử nghiệm được xác định thông qua nồng độ tối thiểu ức chế sự

phát triển vi nấm của chất thử (MIC) Trị số MIC càng thấp, chất thử (chế phẩm) càng có tác dụng mạnh

Các phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:

− Phương pháp pha loãng (macrodilution) và phương pháp vi pha loãng (microdilution) theo CLSI M27-A2 (2008) dùng cho nấm men

− Phương pháp pha loãng cho nấm sợi (nấm mốc, nấm da) theo CLSI M38-A2 (2008) [9]

1.3.2 Phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: Tác dụng kháng nấm của một chất thử (chế phẩm) được xác định dựa trên khả

năng ức chế vi nấm của chất thử khuếch tán từ một đĩa giấy đặt trên mặt thạch, một lỗ cắt từ thạch hay một ống trụ đặt trên mặt thạch đã cấy nấm, thể hiện qua vòng kháng nấm Đường kính vòng kháng nấm dùng để đánh giá hoạt lực kháng nấm So với phương pháp pha loãng, phương pháp khuếch tán đơn giản dễ thực hiện, giúp phát hiện vi sinh vật kháng thuốc dễ dàng và giá thành rẻ hơn [9], [36]

Các phương pháp khuếch tán hiện đang được sử dụng:

− Phương pháp khuếch tán dành cho nấm men theo CLSI M44-A2 (2009)

− Phương pháp khuếch tán dành cho nấm sợi (nấm mốc, nấm da) theo CLSI M51-A (2010) [9]

1.3.3 Phương pháp khuếch tán dùng để xác định mức độ nhạy của các chất kháng nấm trên nấm da

Vào thập niên 90, NCCLS (hiện nay là CSLI - Clinical and Laboratory Standards Institute)

đã công bố các phương pháp để đánh giá mức độ nhạy của các thuốc kháng nấm cho nấm men (NCCLS M27-A; M44-A) và nấm mốc (M38-P; M38-A) Tuy nhiên, các phương pháp thử này không bao gồm nấm da cũng như vẫn chưa có một hướng dẫn chính thức nào để đánh giá mức độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm

CLSI M38-A2 (2008) đã công bố một phương pháp thử mức độ nhạy của nấm sợi bao gồm

các nấm mốc gây bệnh nhiễm nấm xâm nhập và nấm da (Trichophyton sp., Microsporum

sp và Epidermophyton sp.) đối với các thuốc kháng nấm Tuy nhiên, các phương pháp pha

loãng và vi pha loãng của CLSI khó áp dụng như các phương pháp thường qui ở các phòng thí nghiệm Từ 2002, Neo-Sensitabs đã đưa ra thị trường và hướng dẫn sử dụng phương pháp khuếch tán để xác định mức độ nhạy cảm của nấm da với các thuốc kháng nấm, được phát

triển bởi Rosco® (Taastrup, Đan Mạch) Năm 2005, A Esteban và cộng sự đã sử dụng sản phẩm của Neo-Sensitabs®, áp dụng phương pháp khuếch tán để thử độ nhạy của nấm da đối với clotrimazol, itraconazol và terbinafine, sử dụng môi trường PDA và SDA Dựa vào sự tương đồng giữa giữa giá trị MIC của phương pháp pha loãng (theo CLSI M38 – A2) và đường kính vòng kháng nấm khảo sát được của 59 mẫu nấm da lâm sàng, nhóm nghiên cứu

đã đề nghị chủng nấm da được cho là nhạy cảm khi đường kính vòng kháng nấm ít nhất là

20 mm với clotrimazol và terbinafine và 15 mm với itraconazol [13]

Keyvan Pakshir và cộng sự (2009) cũng đã dùng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn

và tiêu chuẩn của Neo – Sensitabs để đánh giá mức độ nhạy cảm của 39 chủng lâm sàng và đánh giá phương pháp này đơn giản, thuận tiện, không đắt tiền và dễ thực hiện hơn M38 – A2, có thể áp dụng cho nấm da [30]

Bảng 1.5 Tiêu chuẩn về mức độ nhạy của nấm da theo Neo-Sensitabs [30]

Thuốc

kháng nấm

Nồng độ (µg/đĩa giấy)

Bảng 1.6 Cấu trúc và tính chất của ketoconazole

Tên khoa học

1-acetyl-4-[4-[[(2RS,4SR)-2-(2,4-diclorophenyl)-2-

(1H-imidazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl] piperazin Công thức cấu tạo

Công thức phân tử C26H28Cl2N4O4

Hằng số vật lý Điểm chảy: 148 – 1520C

Tính chất Bột kết tinh màu trắng Thực tế không tan trong

nước, dễ tan trong dicloromethan, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%

- Điểm chảy 148 – 1520C

- Sắc kí lớp mỏng

- Phản ứng hóa học Ketoconazole là một dẫn chất imidazole dioxolane tổng hợp, có khả năng ức chế sinh tổng hợp ergosterol ở nấm và làm thay đổi cấu trúc các thành phần lipid khác trong màng Ketoconazole thường tác dụng rất nhanh trên triệu chứng ngứa, là triệu chứng thường thấy

ở các nhiễm nấm ngoài da và nấm men Ketoconazole có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với

các vi nấm ngoài da như Trichophyton sp., E floccosum và Microsporum sp và đối với các nấm men, bao gồm Malassezia sp và Candida sp Đặc biệt hiệu quả trên Malassezia sp rất

rõ rệt, giảm triệu chứng được ghi nhận trước khi thấy các dấu hiệu lành bệnh đầu tiên Chỉ định: Ức chế P450 ít chọn lọc hơn các triazol mới nên độc tính cao hơn và tương tác thuốc nhiều hơn nên ngày nay ít dùng để điều trị nhiễm nấm nội tạng, thường dùng trị nấm da

- Dạng tại chỗ: Kem trị nhiễm nấm ngoài da và nhiễm Candida Thuốc gội đầu trị

viêm da do tiết bả nhờn

- Dạng uống: Trị nhiễm nấm biểu bì, Microsporum và loài Trichophyton Trị lang

ben đáp ứng tốt với liều duy nhất trong ngày và trong thời gian ngắn

- Liều dùng: 200 mg 1 – 2 lần/ngày, thời gian 2 – 3 tuần ở vùng da nhẵn hoặc 4 – 6 tuần ở gan bàn tay, lòng bàn chân

- Độc tính: Buồn nôn, ngứa (3%) Vú to đàn ông, viêm gan (1/10.000) liều ≥ 800 mg/ngày giảm testosterone huyết và cortisol huyết

1.4.2 Thuốc kháng nấm terbinafine

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của terbinafine

So với các thuốc nhóm azol, terbinafine ít được sử dụng phổ biến hơn, nhưng đây là nhóm thuốc khá nhạy cảm với nấm da lâm sàng Với cấu trúc nhân allylamine, terbinafine có tác dụng diệt nấm phổ rộng đối với nấm da, nấm móng và nấm lưỡng hình Tác dụng diệt hay

là kháng nấm phụ thuộc vào từng loại nấm

Về cơ chế tác dụng, terbinafine ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp các sterol của vi nấm Sterol là thành phần quan trọng của màng tế bào nấm và liên kết chúng với nhau, sự ảnh hưởng này làm suy yếu màng tế bào Terbinafine can thiệp chọn lọc vào giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng hợp ergosterol, dẫn đến sự thiếu hụt ergosterol và làm tăng sự tích tụ nồng độ squalene trong nội bào và làm chết tế bào nấm Ngoài ra, terbinafine còn có tác dụng ức chế squalene epoxidase trong màng tế bào nấm Đặc biệt hơn, terbinafine không gây ảnh hưởng tới sự chuyển hóa của các hormon hay các thuốc các

Chỉ định: terbinafine thường được chỉ định trong nhiễm nấm da gây ra bởi Trichophyton sp (T rubrum, T mentagrophytes, T verrucosum), M canis và E floccosum

Liều dùng: Người lớn 250 mg/ngày, thời gian điều trị: nấm da chân 2 - 6 tuần, nấm da thân

và đùi 2 - 4 tuần, bệnh Candida da 2 - 4 tuần Nấm da đầu 4 tuần, nấm móng 6 - 12 tuần

Tương tác thuốc: Rifampicin làm giảm nồng độ terbinafine trong máu, làm giảm đáng kể tác dụng của terbinafine Cimetidine làm tǎng nồng độ terbinafine trong máu

1.4.3 Một số phác đồ điều trị nấm da

Theo Quyết định số 75 của Bộ Y tế ban hành ngày 13 tháng 1 năm 2015 đã quyết định về việc ban hành tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh da liễu” như sau [1]:

− Về nguyên tắc điều trị cần (i) Xác định và loại bỏ các yếu tố thuận lợi cho nấm phát triển

và (ii) Sử dụng thuốc bôi tại chỗ hoặc toàn thân

− Về điều trị cụ thể cần thực hiện :

• Vệ sinh cá nhân, tránh mặc quần áo ẩm ướt

• Là quần áo thường xuyên hoặc phơi quần áo dưới ánh nắng mặt trời, nhất là quần áo lót

• Tránh tiếp xúc với các nguồn lây như chó, mèo

• Không dùng chung quần áo, chăn màn với người mắc bệnh

• Tránh tắm xà phòng

• Dùng các thuốc chống nấm bôi tại chỗ đơn thuần hoặc kết hợp thuốc bôi với thuốc uống đường toàn thân tùy thuộc vào mức độ thương tổn

− Về tiến triển và biến chứng:

Bệnh tiến triển lành tính, khỏi hoàn toàn nếu áp dụng các biện pháp điều trị đúng cách Các trường hợp tái phát thường do điều trị không triệt để Trong một số trường hợp, tổn thương

có thể lan rộng toàn thân do sử dụng các thuốc corticoid tại chỗ hoặc toàn thân hoặc ở những người bệnh suy giảm miễn dịch Biến chứng chủ yếu của nấm da là bội nhiễm và chàm hoá

do người bệnh gãi nhiều và vệ sinh không tốt

Bôi ngày 1 - 2 lần, thời gian bôi thuốc ít nhất từ 3 - 4 tuần

* Thuốc kháng nấm toàn thân

- Khi thương tổn lan rộng hoặc dai dẳng bôi lâu không khỏi

- Nên kiểm tra chức năng gan trước và trong quá trình điều trị

- Liều lượng và thời gian uống thuốc tùy thuộc từng bệnh

- Các thuốc kháng nấm toàn thân thông dụng:

+ Griseofulvin viên 500 mg: trẻ em dùng liều 10 – 20 mg/kg/ngày Người lớn 1 - 2 viên/ngày, thời gian điều trị 4 - 6 tuần

+ Hoặc terbinafine 250 mg/viên/ngày x 10 - 14 ngày, uống trước bữa ăn Chống chỉ định với phụ nữ có thai hoặc cho con bú, trẻ dưới 16 tháng, bệnh nhân suy gan, suy thận nặng + Hoặc itraconazol 100 mg/viên x 2 viên/ngày x 3 - 4 tuần, uống sau bữa ăn

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm nấm (da, tóc hoặc móng) điều trị tại bệnh viện Da liễu TpHCM trong thời gian từ tháng 11 - 12/2017 với các tiêu chuẩn chọn mẫu như sau:

− Bệnh nhân đến khám tại Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Da Liễu TpHCM

− Bệnh nhân có kết quả soi tươi dương tính với hình ảnh “Sợi nấm có vách ngăn”

− Vảy nấm da ở vị trí bệnh nhiều (loại trừ các trường hợp trẻ em có chỗ da bệnh mỏng và rất ít vảy)

2.1.2 Thiết kế nghiên cứu

Thực hiện nghiên cứu cắt ngang mô tả trên mẫu bệnh phẩm được thu thập từ tháng 11 - 12/2017 tại bệnh viện Da liễu TpHCM Nghiên cứu cắt ngang (Cross sectional study) là nghiên cứu được thực hiện tại một thời điểm hay trong khoảng một thời gian ngắn, mỗi đối tượng chỉ thu thập thông tin một lần và không theo dõi suốt theo thời gian như trong nghiên cứu đoàn hệ tương lai Các yếu tố phơi nhiễm và kết quả đều ghi nhận vào cùng một thời điểm vì vậy khó xác định được mối liên hệ nhân quả (bệnh và phơi nhiễm cái nào xảy ra trước) Tuy vậy, loại nghiên cứu này khá hữu dụng vì thực hiện nhanh, ít tốn kém

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại:

− Bộ môn Vi – ký sinh, khoa Dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành

− Khoa xét nghiệm Ký sinh trùng, Bệnh viện Da Liễu Tp HCM

2.1.4 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: Ketoconazole, Terbinafine, D-glucose, môi trường PDA, môi trường DTM, môi trường BCP– Milk Solids – Glucose Medium, môi trường SDA, glycerol, tween 80, NaCl, thuốc nhuộm LPCB, KOH 10%, Cycloheximide, Chloramphenicol…

Trang thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HVA-110, tủ cấy Memmert UNB-500, máy đo quang Genequant, tủ đông Alaska, máy vortex Labnet S0200 Model VX-200, tủ ấm Memmert INB-500, tủ sấy Memmert UN110, kính hiển vi 2 mắt OPTIKA - Ý B-192 Dụng cụ: Micropipet, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, bình erlen, pipet, que gỗ, cốc có mỏ, dao mũi mác, thanh chữ U, eppendorff, duran

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu

2.2.1 Sàng lọc và định danh nấm da

2.2.1.1 Kỹ thuật lấy mẫu

Để lấy được mẫu bệnh phẩm cần có các dụng cụ đã tiệt trùng để tránh ngoại nhiễm như lưỡi dao cạo phẫu thuật một lần, cán dao, nhíp vô trùng, hủ đựng sang thương đã tiệt trùng,… Mẫu lấy cần đủ để tiến hành soi tươi và nuôi cấy trên các môi trường thích hợp

Tiến hành lấy mẫu tại vị trí da bệnh, dùng dao phẫu thuật một lần đã gắn chặt vào cán cạo phần bờ vết thương để lấy các mảnh da bệnh chứa nấm, nên lấy phần bờ vì đặc tính nấm da mọc lan rộng sẽ giúp quan sát rõ hơn các sợi nấm khi soi trực tiếp và cũng là vị trí vi nấm phát triển mạnh nhất Với trường hợp sang thương ở da đầu và tóc, dùng nhíp đã vô trùng để nhổ lấy tóc và cho mẫu và hủ đựng sang thương đã tiệt trùng [12]

2.2.1.2 Phương pháp soi tươi trực tiếp

Tiến hành soi trực tiếp mẫu bệnh phẩm để đánh giá sơ bộ trên bệnh phẩm có phải nấm da hay không Cho một ít mẫu bệnh phẩm lên lam, thêm vài giọt KOH 10% để làm trong tế bào, đậy lam lại sau đó hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn và để một phút ở nhiệt độ phòng Đối với mẫu bệnh phẩm là tóc cũng thực hiện tương tự, đặt mẫu tóc lên lam, cho vài giọt KOH 10%, đậy lam lại nhưng đối với tóc tránh hơ nóng quá lâu sẽ làm hư cấu trúc tóc sẽ khó quan sát hơn trên kính hiển vi hoặc có thể không gia nhiệt

Nhận định kết quả bằng quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi vật kính 10X, 40X Dưới kính hiển vi có thể quan sát được những mảnh sợi nấm không màu, có vách ngăn, phân nhánh hay đứt khúc tạo thành chuỗi bào tử đốt

2.2.1.3 Phân lập và nuôi cấy nấm da

Sau khi soi tươi trực tiếp các mẫu bệnh phẩm cho kết quả “Sợi nấm không màu, có vách ngăn”, sẽ tiến hành cấy và ủ với môi trường DTM

Bệnh phẩm được cấy vào chai mẫu chứa môi trường DTM, ủ ở nhiệt độ phòng từ

10 – 20 ngày Môi trường chuyển từ vàng sang đỏ thì nấm gây bệnh là nấm da Nhuộm khóm nấm với thuốc nhuộm LBCP và quan sát ở kính hiển vi Những khóm nấm cho đặc điểm vi học của nấm da (đặc điểm của sợi nấm, bào tử đính lớn, bào tử đính nhỏ) được thuần khiết

và định danh tiếp theo

Các rãnh xuyên tâm có khoảng cách gần nhau

Mặt sau, màu vàng chanh đến vàng cam

1 tuần

Mặt trái màu vàng nâu đến màu nâu đỏ

7 - 10 ngày

Trichophyton

rubrum

Mặt trước, khóm nấm biến đổi từ dạng lông mịn trắng đến dạng bột màu hồng, thường có nếp gấp

Mặt trái màu vàng khi khóm nhóm còn trẻ, thường chuyển

đỏ rượu vang/ đỏ theo độ tuổi

Mặt sau màu vàng đến màu

da đến màu đỏ rỉ sét

7 - 14 ngày

Trichophyton

violaceum

Màu rượu đỏ đến mà tím đậm, có thể có nếp gấp hoặc phẳng với bề mặt mịn nhẵn không có lông, sắc tố có thể nhạt dần

2 - 3 tuần

Trichophyton

verrucosum

Khóm nấm màu trắng nhẵn không lông đến mịn như nhung, hiếm khi có khóm nấm màu vàng nâu, nhiều nếp gấp với khuynh hướng ăn sâu vào bề mặt thạch

2 - 3 tuần

b Đặc điểm hình thái hiển vi

Làm tiêu bản nấm da đã nuôi cấy từ 7 – 14 ngày, nhuộm một vài mảnh nhỏ nấm với thuốc nhuộm LPCB Quan sát đặc điểm và cấu trúc hình thể của sợi tơ nấm, bào tử đính lớn, bào

tử đính nhỏ [7]

Khác với M gypseum, M canis thường tạo rất ít bào tử đính lớn hình thoi, 6 – 8 vách ngăn trên môi trường SDA Trong trường hợp nếu nghi ngờ là M canis, cấy vi nấm lên môi trường

cháo hoa để kích thích tạo bào tử đính lớn rồi quan sát lại hình thái trên kính hiển vi và lưu chủng

Bảng 2.2 Đặc điểm quan sát dưới kính hiển vi của nấm da [19], [20], [27]

Các loài nấm da Mô tả hình thái quan sát dưới kính

Bào tử đính nhỏ: Rất ít, mọc dọc theo sợi nấm, hình quả lê đến tròn

Microsporum

gypseum

Bào tử đính lớn: Nhiều, có gai với thành mỏng, 3 đến 6 vách ngăn, đầu tròn

Bào tử đính nhỏ: Hình chùy Không có triệu chứng

Trichophyton

mentagrophytes

Bào tử đính lớn: Hình xì gà với những thành mỏng mịn

Bào tử đính nhỏ: Rất hiếm đến rất nhiều Hình tròn đến quả lê Thường

có sợi xoắn hoặc xoắn ốc

Trichophyton

rubrum

Bào tử đính lớn: 2-8 tế bào, các cạnh song song Hiếm gặp

Bào tử đính nhỏ: Mọc đơn lẻ trên sợi nấm nhỏ, hình quả lê

Trichophyton

tonsurans

Bào tử đính lớn: Thành mỏng, mịn, hình dạng không đều Không chẩn đoán

Bào tử đính nhỏ: Phân nhánh và hình giọt nước, hình chùy hoặc hình bong bóng

Trichophyton

verrucosum

Bào tử đính lớn: Hiếm, thành dài, mỏng và trơn Nhiều chuỗi chlamydospore

Bào tử đính nhỏ: Hiếm, hình quả lê đến hình chùy Không có chuẩn đoán

Trichophyton

violaceum

Bào tử đính lớn: phân nhánh, chuỗi ngoằn ngoèo, sợi nấm hẹp, sắp xếp thành các chuỗi chlamydoconidia [38]

c Định danh bằng các phản ứng khác

Phản ứng thủy phân ure

Vi nấm được cấy lên canh ure có bổ sung glucose Canh thang ure cho kết quả thử tương tự thạch ure nhưng nhanh hơn, đọc kết quả sau 2 - 4 ngày thử bằng cách quan sát sự thay đổi màu của môi trường

Phản ứng này giúp phân biệt các chủng nấm trong chi Trichophyton, không có tác dụng định

danh một chủng nấm cụ thể Dấu hiệu nhận biết phản ứng dương tính là môi trường ure chuyển từ màu cam sang màu hồng tím sau khi cấy khoảng 2 - 4 ngày

Bảng 2.3 Kết quả thử nghiệm ure ở một số chủng nấm da [14]

Trichophyton mentagrophytes dương tính

Trichophyton tonsurans dương tính

Trichophyton terrestre dương tính

Trichophyton verrucosum âm tính

Epidermophyton floccosum dương tính

Cấy trên môi trường BCP-MS-G

Môi trường thạch sữa rắn là môi trường hữu hiệu để phân biệt giữa T rubrum và T mentagrophytes hay T mentagrophytes và M persicolor Theo đó, T rubrum mọc hạn chế

và không tạo phản ứng kiềm trên môi trường thạch này, trong khi đó T mentagrophytes mọc tốt và cho phản ứng kiềm M persicolor mọc tốt nhưng không cho phản ứng kiềm [16], [18],

[39]

Cơ chế tạo màu của môi trường BCP-MS-G: Một số loài nấm da làm tăng độ pH của môi trường bằng cách phá vỡ các protein để tạo ra các hợp chất kiềm Ở một số loài, hoạt động phân giải protein này trong casein sữa bị ức chế khi môi trường cũng chứa glucose như một

nguồn cung cấp cacbon Quá trình phân giải kiềm của T rubrum và hầu hết các Microsporum

sp bị ức chế mạnh trên BCP-MS-G Mặt khác, T mentagrophytes và một số loài khác như

E floccosum, T tonsurans nhanh chóng làm thay đổi màu sang màu tím xanh đậm

Cấy trên môi trường thạch CMDA

Thạch bột ngô thường được sử dụng nuôi cấy và nghiên cứu các loài Candida sản xuất

chlamydospore Thạch bột ngô bổ sung glucose thường được sử dụng cho việc nuôi cấy các chủng nấm gây bệnh Việc bổ sung glucose làm tăng khả năng tạo sắc tố của một số loài

Trichophyton [31]

Môi trường CMDA được dùng để phân biệt các chủng T mentagrophytes với T rubrum dựa trên sự tạo thành sắc tố Các chủng T rubrum sẽ cho sắc tố đỏ rượu đậm ở mặt trái của khóm

trong khi T mentagrophytes sẽ cho nhiều màu sắc khác nhau từ không màu cho đến nâu đỏ

2.2.2 Phương pháp thử độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm

Thực hiện thử độ nhạy cảm của nấm da với thuốc kháng nấm terbinafine bằng phương pháp khuếch tán theo hướng dẫn và tiêu chuẩn của Neo – Sensitabs để đánh giá mức độ nhạy cảm của các chủng vi nấm lâm sàng [13]

Chuẩn bị:

− Hoạt hóa nấm da: Cấy hoạt hóa nấm da trên ống thạch nghiêng SDA đã hấp tiệt trùng,

để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày

− Chuẩn bị nước muối sinh lý: Cho nước muối sinh lý có chứa 0,05% Tween 80 và hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút

− Chuẩn bị đĩa giấy thẩm kháng sinh

o Terbinafine: Pha dung dịch thuốc kháng nấm terbinafine với nồng độ 200 µg/ml

và lọc qua màng lọc millipore 0,45 m Hút 10 l dung dịch kháng sinh tẩm vào các đĩa giấy kháng sinh đã hấp tiệt trùng, nồng độ kháng sinh mỗi đĩa là 2 g/ đĩa

o Ketoconazole: Cân 30 mg ketoconazole pha trong 20 ml cồn ta được dung dịch

có nồng độ 1,5 mg/ml, lọc qua màng lọc millipore 0,45 m Dùng pipet nhỏ 5 𝜇l ketoconazole đã pha vào đĩa giấy đã được vô trùng, đợi đĩa giấy khô rồi lặp lại lần 2 Ta thu được nồng độ kháng sinh là 15 𝜇g/đĩa

− Cách thực hiện: Cho dung dịch nước muối sinh lý vào ống nghiệm SDA sao cho ngập khóm nấm trong ống, cà nhẹ bề mặt để lấy bào tử, cho dịch treo vi nấm vào các eppendorf

vô trùng và vortex, để lắng từ 3 – 5 phút rồi hút lấy phần dịch phía trên Tiến hành đo độ truyền qua của dịch treo vi nấm tại bước sóng 530 nm và điều chỉnh về khoảng giá trị từ

65 - 82% độ truyền qua

− Trải dịch nấm lên mặt thạch: dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch treo vi nấm đã đạt yêu cầu, ép que trên thành ống nghiệm cho ráo rồi trải đều trên mặt thạch Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa petri 60o Đối với nấm da, thử nhạy cảm với thuốc kháng nấm thực hiện trên môi trường SDA được ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 - 5 ngày

Bảng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy của vi nấm với ketoconazole và terbinafine