Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu tràm (melaleuca alternifolia)

TÓM LƯỢC Lần đầu tiên, thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu Tràm trà Melaleuca alternifolia thu hái tại tỉnh Long An được khảo sát.. Bằng phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Lê Thanh Khang

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN THỰC VẬT

CỦA TINH DẦU TRÀM TRÀ (Melaleuca alternifolia)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SỸ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương

PGS TS Lê Thị Thủy Tiên Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 01 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS TS Nguyễn Thúy Hương

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Nguyễn

Thị Thu Hương, Nguyên Giám đốc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh,

Viện Dược liệu và PGS TS Lê Thị Thủy Tiên, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học,

Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình thực hiện luận văn, em đã luôn nhận được sự phối hợp và giúp

đỡ của các cá nhân ở nhiều cơ quan và đơn vị khác nhau Em xin chân thành cảm ơn

thầy Nguyễn Vũ Phong, Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học

Nông lâm TP Hồ Chí Minh đã hướng dẫn em đánh giá hình thái tế bào nấm sợi, cô

Nguyễn Kim Minh Tâm, Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật hóa

học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh và chị Lê Thị An Nhiên, Trung tâm

Ứng dụng công nghệ sinh học Đồng Nai đã hỗ trợ em các dòng nấm sợi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Trong quá trình thực hiện luận văn vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ

bảo tận tình của chị Trần Nguyễn Mỹ Châu và các anh chị Bộ môn Công nghệ sinh

học, Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu, những người đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn của mình

Em cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới quý anh chị Viện Nghiên cứu Dầu và Cây

có dầu đã tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành luận văn này

Bên cạnh đó, em xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ em cả về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành bản luận văn này

Chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 12 năm 2019

TÓM LƯỢC

Lần đầu tiên, thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật

của tinh dầu Tràm trà (Melaleuca alternifolia) thu hái tại tỉnh Long An được khảo sát

Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu Tràm trà được xác định là hợp chất eucalyptol với hàm lượng 31,54% Hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả thử hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật cho thấy tinh dầu Tràm trà có khả

năng ức chế sự tăng trưởng của năm dòng nấm: Aspergillus niger, Corynespora

cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum và Pyricularia oryzae với giá trị

MIC từ 6 – 8 μL/mL

Từ khóa: Hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên thực vật, Melaleuca alternifolia, tinh dầu Tràm trà.

ABSTRACT

The chemical composition and plant pathogenic antifungal activity of tea tree

essential oils (Melaleuca alternifolia) collected in Long An, Vietnam was surveyed

By gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS), the main chemical composition in tea tree essential oils was identified to be eucalyptol with a concentration of 31.54% Plant antifungal activity of tea tree essential oils was evaluated with many kinds of dissolvent to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) The results showed that tea tree essential oils had the ability to

inhibit the growth of five phytopathogenic fungal strains: Aspergillus niger,

Corynespora cassiicola, Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum and Pyricularia oryzae with the minimum inhibitory concentrations (MICs) were in the range of 6 – 8

μL mL-1

Keywords: Melaleuca alternifolia, plant pathogenic antifungal activity, tea tree essential oils

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và cán bộ hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

TP Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 01 năm 2020 Cán bộ hướng dẫn Học viên thực hiện

PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương Lê Thanh Khang

PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

MỤC LỤC

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây Tràm trà 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Phân loại và mô tả thực vật 3

1.2 Tổng quan về tinh dầu và tinh dầu Tràm trà 4

1.2.1 Tinh dầu 4

1.2.2 Tính chất vật lý của tinh dầu 4

1.2.3 Thành phần hóa học của tinh dầu 5

1.2.4 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu 6

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích tinh dầu 8

1.2.6 Tinh dầu Tràm trà 9

1.3 Giới thiệu về một số nấm sợi gây bệnh trên thực vật 12

1.4 Cơ chế kháng vi sinh vật của tinh dầu 15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 16

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 18

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Khảo sát hiệu quả ly trích của tinh dầu Tràm trà 28

3.2 Khào sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích tinh dầu 28

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian ly trích 28

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối NaCl 29

3.2.3 Ảnh hưởng của thể tích dung dịch NaCl 30

3.3 Khảo sát việc ly trích tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp ứng dụng enyme 31

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/Tràm trà 31

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý Tràm trà với enzyme 32

3.4 Đánh giá chất lượng tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp phân tích GC-MS 33

3.5 Khảo sát in vitro và in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên nấm gây bệnh ở thực vật 36

3.5.1 Khảo sát in vitro hiệu quả ức chế của tinh dầu Tràm trà trên nấm gây bệnh ở thực vật 36

3.5.2 Đánh giá hình thái tế bào nấm sợi 40

3.5.3 Khảo sát in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên ớt 42

3.6 Khảo sát in vitro và in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà được phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp trên nấm gây bệnh ở thực vật 45

3.6.1 Khảo sát in vitro hiệu quả ức chế của tinh dầu Tràm trà được phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp trên nấm gây bệnh ở thực vật 45

3.6.2 Khảo sát in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà được phối hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp trên nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên ớt 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

Amu Atomic mass units

DĐVN Dƣợc điển Việt Nam

GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (sắc ký khí ghép khối phổ)

M Khối lƣợng phân tử

MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MFC Minimum fungicidal concentration (Nồng độ ức nấm chế tối thiểu) PDA Potato Dextrose Agar

ppm part per million (phần triệu)

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Cây Tràm trà (Melaleuca alternifolia) 3

Hình 1.2 Vết bệnh trên lá mầm lạc với rất nhiều bào tử của nấm Aspergillus niger 12

Hình 1.3 Triệu chứng điển hình của bệnh rụng lá Corynespora 13

Hình 1.4 Quả ớt bị bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây ra 13

Hình 1.5 Thối rễ Fusarium oxysporum ở cây lạc 14

Hình 1.6 Vết bệnh trên lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra 15

Hình 2.1 Nguyên liệu Tràm trà 16

Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu 19

Hình 2.3 Quy trình chiết xuất tinh dầu Tràm trà 20

Hình 3.1 Tinh dầu lá Tràm trà 31

Hình 3.2 Đường kính tản nấm ở các nồng độ tinh dầu Tràm trà khác nhau 38

Hình 3.3 Hình dạng của sợi nấm được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét SEM 40 Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ của tinh dầu Tràm trà đối với bệnh thán thư trên ớt chỉ thiên ở thời điểm 5 ngày sau khi lây bệnh 44

Hình 3.5 Đường kính tản nấm ở các tỷ lệ nồng độ tinh dầu Tràm trà:carbendazim khác nhau 46

Hình 3.6 Hiệu quả phòng trừ của tinh dầu Tràm trà kết hợp với thuốc diệt nấm carbendazim đối với bệnh thán thư trên ớt chỉ thiên ở thời điểm 5 ngày sau khi lây bệnh 49

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Một số thành phần chính của tinh dầu Tràm trà 9

Bảng 1.2 Một số thông số vật lý đặc trưng của tinh dầu Tràm trà 10

Bảng 1.3 Dữ liệu về khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm trà 11

Bảng 3.1 Hiệu suất ly trích tinh dầu Tràm trà (%) 28

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ly trích lên hiệu suất ly trích tinh dầu tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hiệu suất ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 29

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thể tích dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 30

Bảng 3.5 Điều kiện tối ưu cho quá trình ly trích tinh dầu lá Tràm trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 31

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/Tràm trà đến sự gia tăng hàm lượng tinh dầu 31 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian xử lý Tràm trà với enzyme đến sự gia tăng hàm lượng tinh dầu 32

Bảng 3.8 Điều kiện tối ưu cho quá trình ly trích tinh dầu lá Tràm trà bằng phương pháp ứng dụng enzyme 32

Bảng 3.9 Các hợp phần có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu Tràm trà Long An 33

Bảng 3.10 Thành phần hóa học chính của tinh dầu Tràm trà ở Long An 34

Bảng 3.11 Hiệu suất kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu Tràm trà 37

Bảng 3.12 Hiệu quả tinh dầu Tràm trà qua hai biện pháp xử lý trước và sau khi lây bệnh qua các thời điểm khảo sát 42

Bảng 3.13 Hiệu suất kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu Tràm trà kết hợp với carbendazim 45

Bảng 3.14 Hiệu quả tinh dầu Tràm trà kết hợp với thuốc diệt nấm carbendazim qua hai biện pháp xử lý trước và sau khi lây bệnh qua các thời điểm khảo sát 48

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Tràm trà (Melaleuca alternifolia), tên tiếng Anh là “Tea tree” từ lâu đã

được nghiên cứu trên thế giới như một nguồn tinh dầu và dược liệu có giá trị Năm

1924, loài cây này được mô tả khoa học chính thức bởi Maiden và Betche Chee [1] Tinh dầu Tràm trà được xác định ngày một cụ thể và chính xác hơn về cả thành phần

và hàm lượng Từ 12 chất/nhóm chất được phát hiện năm 1968 [2], một thập kỷ sau, khoảng 48 thành phần trong tinh dầu Tràm trà đã được khám phá [3] Với sự phát triển của sắc ký khí, Brophy cùng nhóm nghiên cứu của mình đã khảo sát trên 800 mẫu tinh dầu và đã xác định được khoảng 100 thành phần hiện diện trong tinh dầu Tràm trà [4] Qua đó cho thấy tinh dầu Tràm trà chứa các thành phần chủ yếu là terpinen-4-ol (≥ 30%); γ-terpinene (10 – 28%); α- terpinene (5 – 13%); 1,8-cineole (≤ 15%) [4], [5] với hàm lượng cao hứa hẹn đây là một loại tinh dầu sẽ có nhiều hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng cao

Tinh dầu Tràm trà đã được chứng minh có hoạt tính kháng nấm Alternaria spp.,

Aspergillus flavus, A fumigatus, A niger [6], Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, C glabrata, C parapsilosis, C tropicalis [7], Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Epidermophyton floccosum, Fusarium spp., Malassezia furfur, M sympodialis, Microsporum canis, M gypseum [8], Penicillium spp., Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Trichophyton mentagrophytes, T rubrum, T tonsurans [9], Trichosporon spp [10], [11] [12], kháng virus Nicotiana glutinosa [13]

Các nghiên cứu trong nước về loài cây này vẫn còn rất khiêm tốn: năm 2003,

Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Tiền Giang tiến hành dự án: “Sản xuất, chế biến thử

nghiệm tinh dầu cây Tràm trà (Melaleuca alternifolia) trồng ở vùng Đồng Tháp Muời

– Tiền Giang” Năm 2010, Kiều Tuấn Đạt đã nghiên cứu kỹ thuật giâm hom cây Tràm

trà (Melaleuca alternifolia) lấy tinh dầu [14] Các nghiên cứu trên đều thuộc lĩnh vực

nông nghiệp tuy đã góp phần đưa cây Tràm trà vào trồng và thích nghi với điều kiện nước ta nhưng vẫn chưa xác định cụ thể được thành phần tinh dầu cũng như phương

pháp chiết xuất và hướng ứng dụng của tinh dầu Tràm trà từ đó chưa nâng cao được giá trị tinh dầu của loài cây này tại nước ta

Biện pháp phòng trừ các bệnh trên thực vật do nấm gây ra hiện nay chủ yếu dựa vào thuốc hóa học, tuy nhiên để tránh mầm bệnh hình thành chủng kháng thuốc cũng như giảm ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, cần có biện pháp phòng trừ hiệu quả Do đó, biện pháp sử dụng các dịch chiết từ thực vật được xem như một hướng đi mới đang được các nhà khoa học nghiên cứu và áp dụng, đặc biệt sử dụng tinh dầu trong phòng trừ các bệnh do nấm gây ra

Do đó, với mục đích nhằm tìm ra những hợp chất tự nhiên mới thân thiện với

môi trường và có hiệu quả phòng trừ nấm gây bệnh trên thực vật, đề tài “Khảo sát

khả năng kháng nấm gây bệnh trên thực vật của tinh dầu Tràm trà (Melaleuca

alternifolia)” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng ức chế một số nấm gây bệnh

trên thực vật của tinh dầu Tràm trà trong điều kiện in vitro và trong điều kiện in vivo

2 Mục tiêu nghiên cứu

Ly trích tinh dầu Tràm trà và đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh ở thực vật

3 Nội dung thực hiện

1 Tối ưu hóa việc ly trích tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và bằng phương pháp ứng dụng enzyme

2 Đánh giá chất lượng tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp phân tích GC-MS

3 Khảo sát in vitro và in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên một

số dòng nấm gây bệnh ở thực vật

4 Khảo sát in vitro và in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà được phối

hợp với thuốc diệt nấm nguồn gốc tổng hợp trên một số dòng nấm gây bệnh ở thực vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây Tràm trà

1.1.1 Giới thiệu chung

Cây Tràm trà thường được biết đến với tên gọi tiếng Anh là Tea Tree hay

Autralian Tea Tree Tên này được sử dụng phổ biến vì Tràm trà từng được sử dụng

như một nguyên liệu làm một loại trà thơm Ngoài ra nó còn được gọi với các tên khác

như: Narrow – leaf paperbark, narrow – leaf teatree, teoljebuske

Tên khoa học: Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel

Đây là loài được biết đến phổ biến và có giá trị kinh tế nhất trong hơn 150 loài

thuộc nhóm “Tea tree” thuộc họ Tràm (Myrtaceae) [15] Loài này được mô tả lần đầu

tiên bởi Joseph Maiden và Ernst Betche vào năm 1905 với hai tên khoa học là

Melaleuca alternifolia và Melaleuca linariifolia và được thống nhất tên gọi thành

Melaleuca alternifolia vào năm 1925 bởi Edwin Cheel

1.1.2 Phân loại và mô tả thực vật

Tên họ: Myrtaceae

Tên nhóm: Melaleuceae

Tên chi: Melaleuca.

Tên loài: Melaleuca alternifolia

Tham khảo từ: Germplasm Resources

Information Network (GRIN). Hình 1.1 Cây Tràm trà (Melaleuca alternifolia)

(Nguồn: http://tinhdautram.vn/cach-phan-biet-cac-loai-tram-lay-tinh-dau-hien-co-o-viet-nam)

Melaleuca alternifolia là một cây thân gỗ nhỏ, thường xanh, cao khoảng 7 mét có

vỏ gồm nhiều lớp mỏng Lá được sắp xếp dạng vòng, tuyến tính, dài khoảng 10 – 35

mm, rộng khoảng 1 mm, cuống lá dài khoảng 1 mm, phiến lá nhẵn Hoa màu trắng nở

vào mùa xuân mọc thành chùm từ 3 – 5 cm, mỗi hoa đơn có cánh hoa rộng, dài khoảng

2 – 3 mm Nhị hoa dạng bó gồm từ 30 – 60 nhị đơn dạng sợi dài từ 6 – 12 mm, vòi

nhụy dài 3 – 4 mm Quả hình chén, đường kính từ 2 – 3 mm có lỗ ở giữa đường kính

1,5 – 2,5 mm [16]

Tại Autralia Tràm trà sống chủ yếu trong các vùng trũng ngập nước hoặc trong các đầm lầy nhỏ có khí hậu cận nhiệt đới thuộc vùng ven biển Đông Bắc New South Wales [17]

Cây Tràm trà được du nhập vào nước ta từ năm 1986, còn được gọi (theo nguồn gốc và sinh thái cây) là Tràm úc, Tràm lá kim, Tràm dầu,… và được trồng tại các địa phương như: Hà Nội, Hà Tây, Quảng Bình, Phú Yên,… với số lượng cây rất ít

1.2 Tổng quan về tinh dầu và tinh dầu Tràm trà

1.2.1 Tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp dạng lỏng của nhiều chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Phần lớn tinh dầu thiên nhiên

có nguồn gốc từ thực vật và số ít từ động vật Hệ thực vật có tinh dầu chiếm khoảng

3000 loài, trong đó có từ 150 đến 200 loài có ý nghĩa thực tiễn Các hợp chất thuộc nhóm terpenoid và phenylpropanoid có trong tinh dầu là những thành phần chính tạo nên hương thơm đặc trưng và hoạt tính sinh học cho tinh dầu Từ xa xưa, tinh dầu đã được xem là một nguồn dược liệu quý và đã được nhắc đến trong các tài liệu y học cổ truyền của các quốc gia từ hàng ngàn năm trước [18]

1.2.2 Tính chất vật lý của tinh dầu

Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng Tinh dầu có tính chất dễ bay hơi, ít tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, chloroform, diethyl ether, hexane,… Tinh dầu thường không có màu hoặc có màu vàng Đặc biệt, có một số tinh dầu có màu xanh (tinh dầu Dương cam cúc), màu đỏ (tinh dầu Thymus) hay màu nâu thẫm (tinh dầu Quế) Vị thường cay và hắc

Tỷ trọng của đa số tinh dầu nằm trong khoảng 0,85 – 0,95; một số tinh dầu có

tỷ trọng lớn hơn 1 (nặng hơn nước) như tinh dầu Đinh hương, Quế Tỷ trọng của tinh dầu thay đổi phụ thuộc vào thành phần hóa học của nó Nếu thành phần chính trong tinh dầu chủ yếu là các hydrocarbon và monoterpene thì tỷ trọng tinh dầu thấp Nếu trong thành phần chứa các các hợp chất dẫn xuất phenol, các hợp chất có chứa dị nguyên tố thì tỷ trọng tinh dầu sẽ lớn hơn Đa số tinh dầu làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực, có thể hữu triền (tinh dầu Long não) hoặc tả triền (tinh dầu Bạc hà)

Chỉ số khúc xạ: nằm trong khoảng 1,45-1,56 Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy thuộc vào thành phần no, không no hay có vòng thơm trong cấu trúc của các hợp chất

có trong tinh dầu Mỗi tinh dầu có các hằng số vật lý đặc trưng như tỷ trọng (d), chỉ số khúc xạ (n), độ quay cực (α) và các chỉ số hóa học như chỉ số acid, chỉ số iod, chỉ số ester, chỉ số xà phòng hóa,… Qua các chỉ số này, có thể đánh giá sơ bộ tinh dầu Ở nhiệt độ thấp, một số tinh dầu có thể kết tinh được, phần kết tinh gọi là stearopten (anethol trong tinh dầu Hồi, menthol trong tinh dầu Bạc hà), phần lỏng gọi là oleopten Một số thành phần trong tinh dầu có thể phát quang dưới ánh sáng đèn tử ngoại (eugenol, aldehyde cinnamic…) [19]

1.2.3 Thành phần hóa học của tinh dầu

Thành phần hóa học của tinh dầu rất đa dạng, có hơn 300 hợp chất khác nhau

đã được tìm thấy trong tinh dầu Thành phần hóa học của tinh dầu thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau nhưng có đặc điểm chung đều là những hợp chất hữu cơ có phân

tử khối nhỏ, dễ bay hơi (< 300 amu) Một số nhóm hợp chất điển hình được tìm thấy trong hầu hết các tinh dầu được liệt kê sau đây:

 Nhóm terpene (terpenoid): các cấu tử trong tinh dầu thuộc nhóm hợp chất này thường có cấu trúc monoterpene (C10H16) hoặc sesquiterpene (C15H24), không nhiều hợp chất diterpene (C20H32) hiện diện trong tinh dầu Terpenoid là những dẫn xuất của terpene mà trong cấu trúc hóa học của nó có chứa một hoặc nhiều nhóm chức hóa học (như alcol, aldehyde, ketone, ester, carboxylic acid,…)

 Nhóm các hợp chất thơm (nhóm phenylpropene): là những dẫn xuất của phenylpropane, được sinh tổng hợp từ tiền chất là amino acid phenylalanine nên trong công thức cấu tạo của nhóm hợp chất này có vòng thơm benzene Nhóm này ít phong phú hơn so với nhóm terpenoid, nhưng là thành phần chính tạo nên những hoạt tính sinh học quý cho tinh dầu

 Nhóm hợp chất có chứa sulfur và nitrogen: nhóm này ít phổ biến hơn, chỉ hiện diện trong tinh dầu của một số loài đặc trưng, tuy nhiên nhóm hợp chất có chứa sulfur

và nitrogen cũng có hoạt tính kháng khuẩn, điển hình là hai hợp chất allicin và allyl isothiocyanate Ngoài ra, trong tinh dầu còn tìm thấy các hợp chất alkane hoặc alkene phân tử khối nhỏ nhưng chỉ hiện diện ở dạng vết [20]

1.2.4 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu

Tinh dầu từ thực vật có thể chiết xuất hay ly trích bằng nhiều phương pháp, các phương pháp tuy khác nhau về cách thực hiện nhưng có thể được xếp vào hai loại sau:

 Phương pháp cổ điển: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và gián tiếp; phương chiết bằng dung môi hữu cơ; phương pháp cơ học (vắt, ép,…)

 Phương pháp hiện đại: phương pháp dùng chất lưu siêu tới hạn, chất lỏng dưới tới hạn (H2 và CO2); phương pháp chiết có sự hỗ trợ của vi sóng, của sóng siêu âm,… [21]

Nhưng dù có tiến hành theo bất cứ phương pháp nào thì cũng phải đáp ứng được các yêu cầu sau: tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên; quy trình chiết xuất phải phù hợp với nguyên liệu; tinh dầu phải được trích kiệt ra khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất có thể

Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc điểm sau của tinh dầu: dễ bay hơi; nhiệt độ sôi thấp, lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ phù hợp; hòa tan dễ dàng trong các dung môi hữu cơ; dễ bị hấp thụ ngay ở thể khí

 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Nguyên lý chung

Chưng cất có thể được định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suất hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần bách phân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại [19], [22]

Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước dựa trên nguyên lý của

sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những chất hữu cơ có trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán dễ dàng khi các tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một khoảng thời gian nhất định Có thể dùng muối để hỗ trợ sự khuếch tán của tinh dầu vào nước [19], [22]

- Sự khuếch tán: có vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất tinh dầu Khuếch tán là quá trình chuyển động ngẫu nhiên của chất tan từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp trong dung môi Nguyên nhân của sự khuếch tán là do gradient nồng độ, do đó chất tan có xu hướng khuếch tán để cân bằng nồng độ [19], [22]

- Sự thẩm thấu: có vai trò mang các phân tử tinh dầu lên bề mặt mô tiết Trong sự thẩm thấu, các phân tử dung môi dễ dàng chuyển động từ một nơi có nồng độ thấp do chuyển động phân tử Các tế bào đẩy các phân tử tinh dầu từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp, quá trình này cần hấp thu năng lượng nên cần cung cấp một lượng nhiệt nhất định Lúc này trong tế bào còn ít phân tử tinh dầu, nồng độ nước bên ngoài tế bào lớn, do đó, nước có xu hướng di chuyển vào bên trong tế bào, quá trình này diễn ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng hai bên màng [19], [22]

- Sự hòa tan: các phân tử tinh dầu được phân bố vào trong nước, dưới tác dụng của nhiệt độ, nước bốc hơi kéo theo tinh dầu qua bộ phận làm lạnh, hỗn hợp bắt đầu ngưng tụ và phân ly thành hai lớp chất lỏng dầu và nước không tan vào nhau và do đó

dễ dàng thu lấy tinh dầu [19], [22]

Ưu và khuyết điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Ưu điểm

Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

Thiết bị gọn, dễ chế tạo

Không đòi hỏi nhiều vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ

Thời gian tương đối nhanh

Khuyết điểm

Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị) Trong nước chưng cất luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn Tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Nguyên tắc của sự chiết lỏng - lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh [23]

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước [23]

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: Ether dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol,… Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, đuổi dung môi thu được dịch chiết Điều cần lưu ý là quá trình chiết lỏng - lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi [23]

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích tinh dầu

1.2.5.1 Thời gian chưng cất

Thời gian chưng cất càng dài, hiệu suất thu nhận tinh dầu càng cao, nhưng đến một ngưỡng thời gian nhất định thì lượng tinh dầu thu được tăng thêm cũng không đáng kể, mà ngược lại có thể ảnh hưởng xấu đến chất lượng tinh dầu

1.2.5.2 Nồng độ và thể tích dung dịch NaCl

Sau khi ngưng tụ, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối ăn vào hỗn hợp chưng cất sẽ giúp tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần ít phân cực có trong tinh dầu vào nước Ngoài ra, muối NaCl là một chất điện ly mạnh, làm tăng tỷ trọng và độ phân cực của nước giúp tinh dầu và nước dễ tách lớp hơn Tuy nhiên, đến một ngưỡng nồng độ nào đó, lượng tinh dầu thu được có thể giảm nếu tiếp tục tăng nồng độ của muối, do khi sử dụng muối ở

nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu bị co lại, ngăn cản sự thoát tinh

dầu ra ngoài [24]

1.2.6 Tinh dầu Tràm trà

1.2.6.1 Thành phần hóa học và đặc tính hóa lý của tinh dầu Tràm trà

Quá trình phân lập, xác định và và định lƣợng các thành phần tinh dầu Tràm trà gắn liền với quá trình cải tiến và phát triển của kỹ thuật sắc ký khí Những thành phần đầu tiên của tinh dầu Tràm trà đƣợc công bố bởi Guenther với 12 thành phần [2] Tiếp

đó Swords và Hunter đã công bố về 48 thành phần hiện diện trong loại tinh dầu này [3] Cùng với sự tiến bộ của máy sắc ký khí, gần 100 thành phần có trong tinh dầu Tràm trà đã đƣợc xác định bởi Brophy và các cộng sự [4]

Thành phần của loại tinh dầu này gồm các hydrocarbon terpene, chủ yếu là monoterpene, sesquiterpene và các dẫn xuất ancol Terpene trong tinh dầu Tràm trà là các hợp chất dễ bay hơi, các hydrocarbon thơm có thể đƣợc xem là polymer của isoprene có công thức tổng quát là (C5H8)n Trong các thành phần trên, terpinen-4-ol đƣợc xem là thành phần chính trong tinh dầu Tràm trà Hàm lƣợng của terpinen-4-ol trong tinh dầu dao động từ 30% đến 48% Đây cũng là chất tạo nên hoạt tính kháng sinh mạnh của loại tinh dầu này Các thành phần chủ yếu trong tinh dầu Tràm trà đƣợc thể hiện trong Bàng 1.1 [25]

Bảng 1.1 Một số thành phần chính của tinh dầu Tràm trà [25]

Tên hợp chất Loại của hợp chất Công thức Độ hòa tan (ppm) Log K OW

Kết quả của nhiều khảo sát cho thấy các thành phần trong tinh dầu Tràm trà có sự khác biệt khá lớn về hàm lượng tùy vào đặc điểm của nguyên liệu [4] Điều này có thể

do sự ảnh hưởng của đất trồng, tuổi của nguyên liệu cũng như điều kiện thời tiết và khí hậu của các vùng Các chỉ số hóa lý của tinh dầu thường được quan tâm là các chỉ tiêu cảm quan (màu sắc, mùi, độ trong), tỷ trọng tương đối với nước, độ quay cực, khả năng hòa tan trong ethanol Các chỉ số hóa lý của tinh dầu Tràm trà được thể hiện trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số thông số vật lý đặc trưng của tinh dầu Tràm trà

(ISO 4730:2004) Tính chất vật lý Giá trị nhỏ nhất Giá trị lớn nhất

1.2.6.2 Hoạt tính sinh học của tinh dầu Tràm trà

Khả năng kháng nấm: các công bố khoa học về khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm trà đã chứng minh loại tinh dầu này có khả năng ức chế một số loại nấm men, nấm sợi, nấm da Tinh dầu Tràm trà ở dạng bay hơi cũng cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm [26], [27] cũng như sự hình thành bào tử [27] Dữ liệu về khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm trà được thể hiện cụ thể qua Bảng 1.3 [25]

Bảng 1.3 Dữ liệu về khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm trà [25]

Khả năng kháng virus: hoạt tính kháng virus của tinh dầu Tràm trà lần đầu tiên

đƣợc ghi nhận trên virus gây bệnh khảm trên cây thuốc lá (Nicotiana glutinosa) Trong

các thử nghiệm với Nicotiana glutinosa, cây bị bệnh đã được phun dịch chứa tinh dầu

Tràm trà với nồng độ 100, 250 và 500 ppm và điều trị bằng phương pháp thông thường (đối chứng) Sau 10 ngày, các tổn thương trên lá của cây đã giảm đi đáng kể khi được điều trị bằng tinh dầu Tràm trà so với nhóm đối chứng [28]

1.3 Giới thiệu về một số nấm sợi gây bệnh trên thực vật

Nấm sợi Aspergillus niger: là một loại nấm sợi hiếu khí, sinh trưởng trên các vật

chất hữu cơ, có màu đen khi quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử đính màu đen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp Chúng

có hai bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu hơi đen và có gai Bọng và sợi

cuốn thường có màu nâu bóng Nấm sợi Aspergillus niger thường phát triển mạnh ở

khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới do có các điều kiện phù hợp về nhiệt độ và độ ẩm

Trong quá trình sinh trưởng nấm sợi Aspergillus niger có khả năng sinh ra độc tố Cho đến nay, đã biết có hơn 300 loại độc tố nấm được sinh ra chủ yếu bởi Aspergillus niger [29] Aspergillus niger gây hiện tượng mốc đen trên một số loại ngũ cốc, gia vị như

hành tỏi Theo tổ chức Nông lương Thế giới (FAO), ước tính mỗi năm có khoảng 1 tỉ

tấn thực phẩm trên toàn cầu bị hỏng do độc tố nấm Aspergillus niger sinh ra trong quá

trình bảo quản [30]

Hình 1.2 Vết bệnh trên lá mầm lạc với rất nhiều bào tử của nấm Aspergillus niger

[51]

Nấm sợi Corynespora cassiicola: nấm Corynespora cassiicola lây nhiễm trên

530 loài thực vật [31] trong 53 họ Nấm Corynespora cassiicola phổ biến nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [31] Nấm Corynespora cassiicola được biết đến như một

tác nhân gây bệnh của nhiều loại cây trồng nông nghiệp, đặc biệt là đậu đũa, dưa

chuột, đu đủ, cao su, đậu tương và cà chua Nấm Corynespora cassiicola đã gây ra thất

mùa dẫn đến thiệt hại kinh tế cao ở hơn 70 quốc gia [31] Trên một số loài thực vật,

chẳng hạn như cà chua, nấm Corynespora cassiicola gây ra một căn bệnh gọi là đốm

lá

Hình 1.3 Triệu chứng điển hình của bệnh rụng lá Corynespora [31]

Nấm sợi Colletotrichum sp.: nấm Colletotrichum sp gây hại rất phổ biến và

nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng, từ cây rau màu như ớt, cà chua, bầu bí, dưa,… đến các loại cây ăn trái như xoài, sầu riêng, đu đủ, chuối, thanh long Một loài nấm

Colletotrichum có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng và ngược lại, một loại cây trồng có thể bị tấn công bởi nhiều loài nấm Colletotrichum

Hình 1.4 Quả ớt bị bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây ra [51]

Nấm sợi Fusarium oxysporum: đây là loại nấm có thành phần rất phong phú và

đa dạng, trong đó sự biến động của một số loài phụ thuộc cơ bản vào đặc điểm khí hậu

ở các vùng khác nhau trên thế giới Loài nấm này gây hại nhiều loại cây trồng trên tất

cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây: bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ, thối

thân, thối trái và hạt Nấm F oxysporum sống phổ biến trong đất, lưu tồn dưới dạng

bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ Một

số loài tạo bào tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân gây ra những bệnh

trên thân, lá và bông Nấm F oxysporum là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất

trên diện rộng ở đậu và cà chua [32]

Hình 1.5 Thối rễ Fusarium oxysporum ở cây lạc [51]

Nấm sợi Pyricularia oryzae: nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa là tác nhân nguy hiểm nhất đối với lúa trên thế giới cũng như ở Việt Nam Nấm P oryzae là

một quần thể không đồng nhất Dựa trên các phân tích phân tử, nhìn chung nấm được phân nhóm trên cở sở phân bố địa lý [33] Các quần thể nấm thuộc các khu vực khởi nguyên cây lúa (chẳng hạn ở khu vực dãy Hymalaya, hoặc Đông Nam Á) đã được khẳng định có mức độ đa dạng cao hơn các khu vực khác [34], [35], [36]

Hình 1.6 Vết bệnh trên lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra

1.4 Cơ chế kháng vi sinh vật của tinh dầu

Cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu đã được một số nhà khoa học trên thế giới đề xuất [37] Màng bao vi khuẩn Gram (+) không có các phân tử lipopolysaccharide để ngăn cản sự xâm nhập của các thành phần ưa béo như tinh dầu Chính vì thế, các thành phần kị nước của tinh dầu có khả năng kếp hợp trực tiếp với lớp phospholipid kép của màng tế bào tăng tính thấm ion gây rối loạn trao đổi chất hai bên màng tế bào và rò rỉ của các thành phần trong tế bào vi khuẩn, hoặc làm suy giảm hệ thống enzyme của vi khuẩn [38] Hợp chất cinnamaldehyde có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) nhờ ức chế quá trình tổng hợp ATP và gây ra sự giảm việc sản xuất ATP nội bào Các thành phần với hàm lượng thấp trong tinh dầu Bạc hà, Hương nhu như là α - pinene, β - pinene, thymol, γ -terpinen, terpinolene, perillence cũng là tác nhân kháng khuẩn chủ yếu của tinh dầu đó

Cơ chế kháng nấm của tinh dầu Tràm trà cũng đã được khảo sát Đa phần các

nghiên cứu được tiến hành trên chủng nấm Candida albicans Cơ chế của tinh dầu

Tràm trà (0,25%) lên chủng nấm này chủ yếu do làm thay đổi tính thấm dẫn đến làm tăng lưu động qua màng tế bào của nấm Cơ chế ức chế hô hấp tế bào cũng đã được

chứng minh khi sử dụng tinh dầu Tràm trà trên các chủng nấm Candida albicans và

Fusarium solani Ở nồng độ 0,25% tinh dầu Tràm trà ức chế hô hấp 40% trên chủng Candida albicans, tỷ lệ này là 95% khi nồng độ tinh dầu Tràm trà sử dụng là 1% [39]

Đối với Fusarium solani tỷ lệ bị ức chế hô hấp là 50% khi sử dụng tinh dầu Tràm trà ở

nồng độ 0,23% [40]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

Corynespora cassiicola (phân lập từ lá cây cao su thuộc dòng vô tính RRIV 4

được thu hái tại Nông trường cao su Cẩm Đường - tỉnh Đồng Nai, có các biểu hiện

đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora

Colletotrichum sp (được phân lập bởi Trần Quốc Phú (2015), Đại học Cần Thơ) Fusarium oxysporum (M42)

Pyricularia oryzae (được phân lập từ những lá lúa nhiễm bệnh tự nhiên thu thập

tại một số tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Sóc Trăng và được nuôi cấy trên môi trường oatmeal agar)

Hạt giống ớt hiểm F1 số 01 mua từ công ty TNHH Hạt giống Thành Nông Thu hoạch ớt khi trái già chuyển màu có vết đỏ (bắt đầu chín) sau khi trổ hoa 35 ngày

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Dung môi hữu cơ thông thường: ethanol tuyệt đối (Et) (99,7%), methanol (Me), diethyl ether Các dung môi này đều là hóa chất của hãng Chemsol

Hóa chất khác: muối Na2SO4 khan, muối NaCl (Trung Quốc), nước cất

Carbendazim (97%), Sigma Aldrich

Thiết bị

Bếp điện Blacker

Máy cô quay chân không Heidolph

Cân điện tử SATORRIUS 210 g ± 0,0001 g

 Bình cầu cô quay loại 1000 mL

 Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Hệ thống chưng cất tinh dầu Clevenger (loại dùng cho tinh dầu nhẹ hơn nước)

Hệ thống máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) của THERMO SCIENCTIFIC Trace GC Ultra-ISQ

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Xử lý nguyên liệu

Tràm trà Xác định độ ẩm nguyên liệu

Khảo sát hiệu quả ly trích tinh dầu

Tràm trà

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

đến quá trình ly trích tinh dầu

- Ảnh hưởng của thới gian ly trích: 60; 120; 180 và 240 phút

- Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối NaCl: 0; 5; 10; 15 và 20%

- Ảnh hưởng của thể tích dung dịch NaCl: 200; 300; 400 và 500 mL

Tối ưu hóa việc ly trích

Khảo sát in vitro và in vivo

hiệu quả phòng/trị của tinh

dầu Tràm trà trên nấm gây

bệnh ở thực vật

- Khảo sát in vitro hiệu quả ức chế của tinh dầu Tràm trà trên nấm gây bệnh ở thực vật với các nồng độ: 0; 2; 4; 6; 8 và 10 µL/mL

- Khảo sát in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên nấm gây bệnh ở thực vật với các nồng độ: 2; 4; 6; 8 và 10%

- Đánh giá hình thái tế bào nấm sợi: Xử lý với carbendazim và xử lý với tinh dầu Tràm trà

Khảo sát in vitro và in vivo

hiệu quả phòng/trị của tinh

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành sấy cốc sứ (bì đựng mẫu thử) trong 30 phút tại 105 °C ± 2 °C, sau đó cân khối lượng cốc sứ Cho vào cốc sứ đã sấy khoảng 3 g mẫu nguyên liệu Tràm trà còn tươi, dàn đều lớp nguyên liệu trong cốc Sấy cốc chứa mẫu tại 60 °C ± 2 °C cho đến khi khối lượng không đổi (chênh lệch khối lượng lần sấy trước và lần sấy sau cách nhau 1 giờ không quá 0,5 mg), ghi nhận khối lượng cốc sứ sau khi sấy Tiến hành thí nghiệm trên với số nghiệm thức là 3, tính toán lấy giá trị trung bình Độ ẩm nguyên liệu được xác định theo công thức:

100)

Trong đó:

w là độ ẩm của nguyên liệu, tính bằng phần trăm (%);

m1 là khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy, tính bằng gam (g);

m0 là khối lượng cốc sứ ban đầu, tính bằng gam (g);

m là khối lượng nguyên liệu ban đầu, tính bằng gam (g)

Nguyên liệu thô

Rửa sạch, loại tạp

Nguyên liệu sạch

Chưng cất lôi cuốn hơi nước

2.2.2.2 Tối ưu hóa việc ly trích tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước [19], [22]

Phương pháp chiết lỏng - lỏng [23]

Mục đích: chiết tinh dầu ra khỏi hỗn hợp gồm nước và tinh dầu sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước

Trong đề tài này, phương pháp chiết lỏng - lỏng được áp dụng để chiết tinh dầu

ra khỏi hỗn hợp gồm tinh dầu và nước sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước Dung môi được chọn để chiết tinh dầu là diethyl ether do có ưu điểm là hòa tan tốt các cấu tử trong tinh dầu, rất ít tan trong nước nên dễ dàng tách lớp, nhiệt độ sôi thấp (xấp xỉ 36

°C) nên dễ dàng thu hồi dung môi

Quy trình chiết xuất tinh dầu Tràm trà [24]

Hình 2.3 Quy trình chiết xuất tinh dầu Tràm trà

Nguyên liệu

Bình chưng cất NaCl + H2O

Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hỗn hợp tinh dầu và

nước Chiết 5 lần với diethyl ether Làm khan bằng Na2SO4Tinh dầu

Thử hoạt tính kháng

nấm in vitro và in vivo

Khảo sát thành phần

hóa học

Cân 50 g nguyên liệu tươi đã xay nhuyễn với kích thước bột nguyên liệu qua rây

có đường kính lỗ 0,6 mm và cắt nhỏ nguyên liệu từ 3 – 5 cm đối với nguyên liệu không xay, cho vào bình cầu chưng cất dung tích 1000 mL, thêm vào bình cầu 500 mL dung dịch NaCl, ngâm nguyên liệu khoảng 30 phút

Lắp bình cầu vào hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước, chưng cất để thu tinh dầu

từ hỗn hợp trên, bình cầu được đun nóng bằng bếp điện với nhiệt độ cố định là 100°C Khi hỗn hợp sôi, hơi nước tạo thành sẽ lôi cuốn hơi tinh dầu bay lên và đi vào hệ thống ngưng tụ Sau khi ngưng tụ sẽ thu được một hỗn hợp lỏng gồm nước và tinh dầu

Thu lấy hỗn hợp này và cho vào bình chiết, chiết 5 lần, mỗi lần chiết với 10 mL diethyl ether Sau đó, gom toàn bộ dịch chiết và làm khan dịch chiết bằng muối

Na2SO4 khan Dịch chiết sau khi làm khan được cô quay và thu hồi dung môi dưới áp suất kém, thu được sản phẩm tinh dầu

Sản phẩm tinh dầu được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C trong tủ lạnh cho đến khi tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học và phân tích GC-MS

Hiệu suất chưng cất tinh dầu H được tính theo công thức:

100150

Trong đó:

m là khối lượng tinh dầu thu được, tính bằng gam (g)

w là độ ẩm của nguyên liệu, tính bằng phần trăm (%)

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích tinh dầu

Mục đích: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu, từ đó

đề xuất các điều kiện tối ưu để tách tinh dầu Tràm trà ở quy mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất

Trong đề tài này, thời gian chưng cất tinh dầu được khảo sát lần lượt từ 60 phút đến 240 phút, mỗi lượt khảo sát tăng thêm 60 phút Thời gian được tính từ lúc giọt tinh

dầu đầu tiên ngưng tụ và nhỏ xuống ống hứng tinh dầu Cố định các yếu tố như khối lượng nguyên liệu, nhiệt độ chưng cất, thể tích và nồng độ dung dịch NaCl thêm vào Ghi nhận thể tích và tính toán hiệu suất ly trích tinh dầu theo từng khoảng thời gian khảo sát, từ đó xác định thời gian tối ưu mà tại đó hiệu suất ly trích tinh dầu cao nhất

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl

Với thời gian ly trích tối ưu đã lựa chọn, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối NaCl đến hiệu suất ly trích tinh dầu bằng cách tiến hành ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl lần lượt ở mỗi nồng độ từ 0 đến 20%, mỗi lượt khảo sát tăng nồng độ thêm 5% Sau đó, chưng cất để thu tinh dầu và ghi nhận hiệu suất ly trích tinh dầu tương ứng ở mỗi nồng độ Các yếu tố ban đầu như khối lượng nguyên liệu, thể tích dung dịch muối, nhiệt độ và thời gian chưng cất được cố định

Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung dịch NaCl

Với thời gian ly trích và nồng độ dung dịch muối tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định nhiệt độ và khảo sát quá trình ly trích tinh dầu lần lượt với những thể tích dung dịch NaCl từ 200 mL đến 500 mL, mỗi lượt khảo sát tăng thêm 100 mL Ghi nhận hiệu suất

ly trích tinh dầu ở mỗi thể tích khác nhau, từ đó lựa chọn thể tích tối ưu nhất mà tại đó hiệu suất ly trích tinh dầu cao nhất

2.2.2.3 Khảo sát việc ly trích tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp ứng dụng enzyme

Nguyên liệu sau sơ chế được bổ sung nước theo tỷ lệ nhất định Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt có khuấy cơ học bằng khuấy từ có điều nhiệt Khi nhiệt

độ trong bình thủy phân phù hợp với nhiệt độ enzyme (macerozyme) hoạt động thì bổ sung enzyme với tỷ lệ thích hợp Thời gian thủy phân được tính tại thời điểm bổ sung enzyme Sau thủy phân, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt đến 80oC để bất hoạt enzyme kết thúc quá trình thủy phân

Enzyme macerozyme có thành phần bao gồm Pectinase 0,5 U/mg, Cellulase 0,1 U/mg và Hemicellulase 0,25 U/mg

Mẫu thí nghiệm với 50 g nguyên liệu/mẻ trong cốc có mỏ 1000 ml, bổ sung thêm

500 ml nước Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt (Memmert- Đức), khuấy đảo hỗn hợp bằng máy khuấy cơ (IKA- Đức), tốc độ 120 vòng/phút

Sau thủy phân, hỗn hợp nguyên liệu được đem đi chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trên bộ cất Clevenger Sự gia tăng hàm lượng tinh dầu so với đối chứng không sử dụng enzyme được xác định theo công thức:

100(%)

Trong đó:

he: hàm lượng tinh dầu theo phương pháp enzyme hỗ trợ, tính bằng gam (g)

h0: hàm lượng tinh dầu không sử dụng enzyme, tính bằng gam (g)

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/Tràm trà

Phản ứng được tiến hành với các tỷ lệ khối lượng enzyme/Tràm trà thay đổi từ 1% đến khi hiệu suất thu hồi tinh dầu Tràm trà không đổi Các thông số cố định là Khối lượng nguyên liệu (50 g), nhiệt độ chưng cất (100 °C), nồng độ dung dịch NaCl, thể tích dung dịch và thời gian chưng cất được chọn từ thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý Tràm trà với enzyme

Hàm lượng tinh dầu của mẫu xử lý enzyme thu được sau 1h, 2h, 3h; được xác định Mẫu không enzyme cũng được tiến hành song song

2.2.2.4 Đánh giá chất lượng tinh dầu Tràm trà bằng phương pháp phân tích GC-MS

[24]

Trong đề tài này, thành phần hóa học của tinh dầu Tràm trà Long An được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS) của THERMO SCIENTIFIC Trace GC Ultra - ISQ, loại cột sắc ký sử dụng là cột TG - SQC (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang helium Chương trình nhiệt độ được khảo sát sao cho các mũi tín hiệu (tương ứng với mỗi cấu tử) tách rời nhau hoàn toàn trên sắc ký đồ

Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định như sau: Xác định thời gian lưu tương đối của các chất trên sắc ký đồ GC, sau đó đối chiếu với thời gian lưu của những chất đã biết trước Đối chiếu phổ khối lượng thu được với phổ gốc trong thư viện phổ NIST, từ đó định danh các cấu tử trong tinh dầu Tràm trà, đồng thời dựa trên tỷ lệ % diện tích peak của các cấu tử để xác định hàm lượng % của chúng trong tinh dầu

Điều kiện phân tích sắc ký khí GC

 Chương trình nhiệt độ cho máy sắc ký khí (Trace GC Ultra) được thiết lập như sau:

Ramp 1: nhiệt độ ban đầu 50°C, giữ 1 phút

Ramp 2: tăng lên 70°C với tốc độ 2°C/phút, giữ 2 phút

Ramp 3: tăng lên 150°C với tốc độ 2°C/phút, giữ 2 phút

Ramp 4: tăng lên 250°C với tốc độ 10°C/phút, giữ 10 phút

 Tiêm mẫu:

Chế độ tiêm mẫu chia dòng

Tỷ lệ chia dòng: 10

Thể tích mẫu tiêm: 10 µL

Điều kiện khối phổ MS

Kiểu ion hóa: bắn phá điện tử (EI)

Điện tích ion: dương

Nhiệt độ nguồn ion: 240°C

Nhiệt độ MS tranfer line: 275°C

Chế độ quét: fullscan

Khối quét: 35 – 400 amu

2.2.2.5 Khảo sát in vitro và in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên một

số dòng nấm gây bệnh ở thực vật

Khảo sát in vitro hiệu quả ức chế của tinh dầu Tràm trà trên một số dòng

nấm gây bệnh ở thực vật

Chuẩn bị nấm: các dòng nấm sợi thử nghiệm hoạt tính được nuôi cấy trên môi

trường PDA (Potato Dextrose Agar) - là môi trường thuận lợi cho các loài vi nấm phát

triển

Chuẩn bị tinh dầu: tinh dầu Tràm trà được pha loãng với Tween 80 để được các nồng độ 0 µL/mL, 2 µL/mL, 4 µL/mL, 6 µL/mL, 8 µL/mL và 10 µL/mL

Khảo sát hoạt tính kháng nấm: dùng thước thẳng có chia vạch để đo đường kính

của tản nấm sau thời gian ủ là 6 ngày, tính bán kính tản nấm phát triển theo thời gian

Trong đó: R: bán kính nấm phát triển ở mẫu đối chứng (cm)

r: bán kính nấm ở mẫu tinh dầu (cm)

Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần

Khảo sát in vivo hiệu quả phòng/trị của tinh dầu Tràm trà trên một số dòng

nấm gây bệnh ở thực vật

Bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 7 công thức, mỗi công thức 10 cây là đối tượng nhiễm bệnh nấm phổ biến, lặp lại 3 lần

NT1: xử lý với tinh dầu Tràm trà 2% trước và sau 24 giờ lây bệnh

NT2: xử lý với tinh dầu Tràm trà 4% trước và sau 24 giờ lây bệnh

NT3: xử lý với tinh dầu Tràm trà 6% trước và sau 24 giờ lây bệnh

NT4: xử lý với tinh dầu Tràm trà 8% trước và sau 24 giờ lây bệnh

NT5: xử lý với tinh dầu Tràm trà 10% trước và sau 24 giờ lây bệnh