Báo cáo thực tập sinh học phân tử

Mỗi nhóm tiến hành đặt phản ứng PCR vào eppendorf 0,2ml kèm theo mẫu chứng âm biết nồng độ dung dịch mẹ và nồng độ cuối cùng của các hóa chất trong phản ứng như sau: Hóa chất Nồng độ cuố

BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ THỰC NGHIỆM

I QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM CHUNG

II NGUYÊN TẮC VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Bước 1: PCR thu nhận gen EPN

1 Mỗi nhóm tiến hành đặt phản ứng PCR vào eppendorf

0,2ml (kèm theo mẫu chứng âm) biết nồng độ dung dịch

mẹ và nồng độ cuối cùng của các hóa chất trong phản

ứng như sau:

Hóa chất Nồng độ cuối Mạch khuôn 2 µl

Taq polymerase 0.5 µl

Tổng thể tích 50 µl

2 Đậy chặt nắp eppendorf, trộn kỹ bằng cách búng nhẹ

hay huyền phù bằng pipet, spin kéo mẫu xuống và đặt

vào máy PCR Chu kỳ nhiệt:

- PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa dựa trên mạch khuôn

- Các thành phần cần thiết:

• DNA mạch khuôn

• Mồi F (mồi xuôi) và R (mồi ngược)

• dNTPs

• MgCl2 chứa ion Mg2+ là cofactor của DNA polymerase

• DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase)

• Buffer giúp ổn định môi trường

- Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp mồi, tổng hợp mạch mới

- Giai đoạn biến tính

+ Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần khác được đun nóng đến 95⁰C

+ Nhiệt độ cao làm liên kết hydro giữa các base trong hai chuỗi DNA khuôn bị phá vỡ, 2 sợi sẽ tách rời và hoạt động như các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới Nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng các sợi DNA đã tách hoàn toàn

- Giai đoạn bắt cặp mồi

+ Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 55°C trong 30s để mồi gắn vào sợi DNA đơn

+ Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được

- Giai đoạn tổng hợp

+ Trong bước này, nhiệt độ được tăng lên 72⁰C để các chuỗi DNA mới được tạo

ra nhờ DNA polymerase bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu

+ DNA polymerase tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung

- Sau khi kết thúc chu kì cuối cùng vẫn phải duy trì ở nhiệt độ khoảng 72oC trong

10 phút để đảm bảo rằng tất cả DNA sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn Sau đó chuyển sang 4oC để bảo quản sản phẩm của phản ứng

Bước 2: Tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS

kiềm

1 Thu nhận toàn bộ sinh khối vào eppendorf bằng ly tâm

dịch nuôi cấy ở 10000v/p trong 5 phút

2 Cho vào eppendorf chứa sinh khối 100ul dung dịch I,

vortex đến khi sinh khối huyền phù đều

3 Thêm 200ul dung dịch II, đảo nhẹ eppendorf 6-8 lần

Sau đó thêm tiếp 150 ul dung dịch III, đảo 6-8 lần

4 Li tâm 13000v/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng

5 Thu dịch nổi từ eppendorf trên vào một eppendorf mới

chứa sẵn 7ul RNAse, đảo nhẹ, ủ ở 37oC trong 2 giờ Ước

tính thể tích của dịch nổi

6 Cho vào mỗi eppendorf 1V phenol bão hòa trong TE pH

8:chloroform (tỉ lệ 1:1), đảo 6-8 lần, li tâm 10000v/phút,

5 phút, to phòng Thu dịch nổi vào eppendorf khác Ước

tính thể tích dịch nổi

7 Cho vào eppendorf trên 1V chloroform, đảo 6-8 lần, li

tâm 10000v/phút, 5 phút, nhiệt độ phòng Thu dịch nổi

vào eppendorf khác Ứớc tính thể tích V của dịch nổi thu

được

- Sol I chứa:

+ 50mM glucose: tạo áp suất thẩm thấu giúp tế bào không bị vỡ + 25mM Tris HCl: giúp ổn định pH

+ 10mM EDTA: có vai trò bắt giữ Mg2+ khiến DNAse không hoạt động được

→ Sol I có chức năng huyền phù tế bào, giúp cho sol II tiếp xúc đều với các tế bào

để phá màng tế bào

- Sol II chứa 0,2N NaOH và 1% SDS có vai trò phá màng tế bào, làm biến tính DNA và protein

- Sol III chứa 5M CH3COOH, CH3COONa có vai trò trung hòa Sol II, giúp DNA hồi tính Đồng thời sol III làm các DNA có kích thước lớn (DNA genome) bị kết tủa, còn DNA plasmid vẫn tan trong dịch nổi

- Thu nhận dịch nổi, lúc này trong dịch là hỗn hợp gồm DNA plasmid, protein, RNA va2 RNAse Để thu được DNA plasmid ta tiếp tục tiến hành loải bỏ tạp chất còn lại bằng phenol và chloroform:

+ DNA tích điện âm do các nhóm photphat nên tan trong nước mà không tan trong phenol do phenol ít phân cực như nước

+ Phenol có vai trò biến tính protein và tách protein ra khỏi nước bằng cách làm protein bộc lộ các vùng kị nước để tan trong phenol

+ Kết quả là khi li tâm, dung dịch thu được sẽ tách thành 2 lớp: lớp trên là pha nước chứa DNA plasmid, lớp dưới là pha dung môi hữu cơ có chứa protein các sản phẩm cần loại bỏ khác

8 Thêm vào eppendorf trên 2.5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ

tối thiểu 30 phút ở -30oC, li tâm 13000v/phút, 10 phút,

4oC Đổ bỏ dịch nổi (lưu ý dung giấy thấm miệng

eppendorf)

9 Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh, li tâm

13000v/phút, 10 phút, 4oC Đổ bỏ dịch nổi (lưu ý thấm

dịch còn sót lại trong eppendorf), phơi khô tự nhiên hay

ủ 50oC

Hòa tủa vào 20µl nước cất vô trùng Giữ ở -20oC

+ Chloroform ít tan trong nước, giúp hỗ trợ phenol biến tính protein đồng thời trung hòa lượng phenol còn dư

- Thu nhận dịch nổi phía trên có chứa plasmid nhưng với nồng độ thấp Để tăng nồng độ plasmid ta dùng ethanol ủ lạnh Ethanol tạo liên kết hydro với nước làm khả năng liến kết của DNA plasmid với nước giảm tạo kết tủa Thu tủa hòa với 20µl nước ta nhận được dung dịch có nồng độ plasmid cao hơn ban đầu

Bước 3: Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di

Nạp mẫu vào gel

1 Trộn 5µl of DNA với 1µl loading dye (6X) (đã được nhỏ

sẵn lên một tấm paraffin), trộn đều bằng pipet (tránh tạo

bọt khí)

2 Nạp 6 µl mẫu vào giếng trên gel

3 Mỗi gel chạy sản phẩm PCR chứa 1 thang DNA và 1

mẫu chứng dương (do TG chuẩn bị) Mỗi gel chạy sản

phẩm tách chiết plasmid chứa 1 thang DNA, 1 mẫu

chứng dương plasmid chưa cắt và 1 mẫu plasmid cắt mở

vòng (do TG chuẩn bị)

4 Chạy điện di ở 135V trong 30-45 phút

5 Ghi chú lại vị trí mẫu của nhóm mình trên miếng gel

nào

Phân tích gel

1 Ngâm gel trong ethidium bromide trong 10 phút, rửa lại

bằng nước

2 Đặt gel lên bàn đèn soi UV

3 Quan sát, chụp hình gel

- Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các đoạn DNA dựa trên kích thước và điện tích của chúng trong điện trường

- Hỗn hợp cần phân tách được đổ vào giếng của gel agarose Gel này được đặt trong dung dịch điện di là TAE (Tris - Acetic acid - EDTA), trong đó:

+ Tris - Acetic acid có khả năng tách mạch DNA và giúp cân bằng pH của môi trường

+ EDTA liên kết với các ion như Mg2+ là cofactor của DNAse giúp bảo vệ DNA

- Dưới tác dụng của điện trường, do DNA chứa các nhóm photphat tích điện (-) nên chúng sẽ di chuyển từ cực (-) sang cực (+) của máy điện di tạo thành các vạch khác nhau Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào

kích thước, cấu trúc và điện tích của phân tử DNA đó So sánh các vạch này với vạch trong thang DNA giúp nhận biết sự có mặt của DNA trong mẫu hay không

*Kết quả điện di sản phẩm PCR của nhóm

+ Vị trí 1: Mẫu chứng dương + Vị trí 2: Mẫu chứng âm: xuất hiện 1 vạch tương tự như chứng dương

+ Vị trí 3: Mẫu sản phẩm PCR: xuất hiện vạch tương tự như chứng dương nhưng khá mờ, chứng tỏ nồng độ DNA thu được không cao

- Mẫu chứng âm cũng xuất hiện vạch DNA có thể là do trong quá trình thao tác để PCR đã bị nhiễm DNA mạch khuôn

Bước 4: Cắt hạn chế plasmid

Thực hiện phản ứng cắt như sau:

Tổng thể tích phản ứng 20 µl

1 Bổ sung đầy đủ thành phần phản ứng Trộn đều bằng

búng nhẹ hay huyền phù đều bằng pipet và spin mẫu

xuống

2 Ủ ở 37oC, trong 2 giờ

- Plasmid pBluescript được cắt bởi enzyme cắt giới hạn EcoRV có 1 vị trí cắt trong

vùng MCS

- Đây là enzyme cắt đầu bằng, nó sẽ cắt plasmid tại vị trí xác định tại ra đầu dính tương ứng với gen mục tiêu cần nối vào

Bước 5: Phân tích sản phẩm cắt plasmid bằng điện di

1 Nạp 5 µl mẫu sản phẩm cắt sau khi trộn với loading dye

vào gel agarose

2 Chạy điện di ở 135V trong 30-45 phút, nhuộm ethidium

bromide và xem dưới bàn đèn soi UV

3 Hình chụp bản điện di được gửi qua email cho nhóm

kèm thông tin vị trí mẫu các nhóm

Ghi chú lại kết quả

- Nguyên tắc tương tự như điện di sản phẩm PCR ở bước 3

- Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid:

+ Vị trí 1 (Chưa cắt): xuất hiện 2 vạch là plasmid dạng vòng và dạng xoắn

+ Vị trí 2 (đã cắt): xuất hiện 1 vạch ở giữa 2 vạch của vị trí số 1 là plasmid dạng thằng

- Kết quả cho thấy plasmid đã được cắt hết thành dạng thẳng, hiệu suất cắt cao nhưng nồng

độ sản phẩm còn thấp nên vạch khá mờ

Bước 6: Tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt

1 Mỗi nhóm nhận lại 01 eppendorf chứa sản phẩm PCR

(bài 1)

2 Hút chuyển sản phẩm PCR sang epp 1.5ml Sau đó, bổ

sung nước cất hai lần vào epp trên để đạt được tổng thể

tích 100μl

3 Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1V, đảo 6-8 lần

4 Li tâm 10000rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

5 Chuyển phần dịch nổi sang một epp 1.5ml mới

6 Bổ sung 1/10 V dung dịch NaOAC 3M, pH 5.2, đảo đều

7 Bổ sung 1 ml ethanol tuyệt đối, lạnh, đảo đều và ủ ở

-30oC trong ít nhất 30 phút

8 Li tâm 13,000rpm trong 10 phút ở 40C

9 Nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa

10 Bổ sung 500l ethanol 70%, lạnh Li tâm 13,000 rpm

trong 5 phút ở 4oC

11 Nhanh chóng, nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa và

làm khô tủa

12 Hòa tan tủa trong 15l TE Bảo quản ở -20oC Nếu dùng

ngay, hoà trong 15l nước Milli-Q và giữ ở nhiệt độ

phòng

Thực hiện tương tự đối với sản phẩm cắt

- Dịch sản phẩm PCR bao gồm enzyme Taq, DNA khuôn, mồi, muối, gen EPN

- Dịch plasmid cắt bao gồm plasmid cắt, plasmid chưa cắt, plasmid đứt gãy,

EcoRV

- Để loại bỏ các thành phần khác và giữ lại plasmid cắt, ta tiến hành tinh sạch nhờ chloroform và NaOAc, các chất này làm giảm tính tan của DNA plasmid, tạo tủa

- Ethanol có ái lực với nước mạnh hơn DNA cũng làm giảm tính tan của DNA và tạo tủa

Bước 7: Thực hiện phản ứng nối

1 Chuẩn bị phản ứng nối biết thành phần như sau:

Plasmid cắt mở vòng 12 µl

T4 DNA ligase buffer (10X) 2 µl

T4 DNA ligase (1U/µl) 1 µl

- Plasmid cắt được ủ với gen cần chuyển và được nối với nhau nhờ enzyme nối T4 ligase, enzyme này xúc tác để hình thành liên kết phosphodiester ở các đầu sợi đôi hoặc đơn giữa nhóm 3′-OH và 5′-phosphate

- Nếu quá trình nối chính xác, gen mục tiêu sẽ được nối vào vị trí trong vùng MCS (nằm giữa gen mã hóa enzyme β-galactosidase)

Tổng thể tích phản ứng 20 µl

Ủ ở 22°C trong 1 giờ

Bước 8: Tạo tế bào có tính khả nạp

1 Hút dịch nuôi cấy vào eppendorf, tiến hành li tâm 6000

vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

2 Lặp lại bước trên thêm 2 lần nữa Sau đó, thu tủa, cho

CaCl2 vào epp, tiến hành li tâm, thu tủa

3 Cho CaCl2 vào hòa tan tủa, đảo đều và thêm glycerol

20%, ủ lạnh

- Màng tế bào và plasmid đều tích điện âm (do có nhóm photphat) nên cần sử dụng

Ca2+ để nó liên kết với plasmid và đưa plasmid lại gần màng tế bào giúp tăng khả năng DNA được đưa vào tế bào

- CaCl2 giúp thành tế bào vi khuẩn tăng khả năng thấm DNA ngoại lai

- Glycerol được bổ sung giúp tế bào không bị vỡ trong điều kiện nhiệt độ thấp

Bước 9: Biến nạp E coli

1 Chuẩn bị 1 epp ký hiệu “+” cùng tên nhóm, chuyển

100µl tế bào khả nạp vào (huyền phù đều trước khi hút)

Epp chứa phần tế bào khả nạp còn lại ký hiệu “-“ cùng

tên nhóm

2 Cho toàn bộ sản phẩm nối vào epp “+”, trộn đều

3 Để trên đá trong 5 phút, sau đó sốc nhiệt ở 45oC trong

60 giây, tiếp tục để lạnh trên đá trong 5 phút

4 Cho 1ml môi trường LB vào eppendorf, lắc ở 37oC trong

30 phút

5 Trãi 50µl dung dịch X-gal 20 mg/ml lên 02 đĩa LB

ampicillin

6 Ly tâm eppendorf biến nạp 6000rpm, 5 phút, hút bỏ 1ml

dịch nổi để loại bớt môi trường

7 Huyền phù sinh khối trong môi trường còn lại rồi trải

toàn bộ lên mỗi đĩa môi trường LB có ampicillin-X-gal

Lưu ý ghi chú đĩa “+” và “-“ cùng tên nhóm và ngày

thực hiện lên mặt dưới của đĩa

- Khi tế bào bị sốc nhiệt ở nhiệt độ cao, màng tế bào bị lỏng tạo ra các lỗ hổng, lúc này các DNA plasmid sát màng có thể lọt vào trong tế bào Sau đó chuyển qua nhiệt độ thấp, các lỗ hổng khép lại giữ plasmid ở trong

- Các tế bào biến nạp được chuyển vào môi trường dinh dưỡng trong 30 phút để gen được chuyển có thời gian phiên mã dịch mã

- Trong đĩa môi trường trải có bổ sung ampicillin Plasmid pBluescript có chứa gen kháng ampicillin và gen mã hóa enzyme β-galactosidase (có chức năng phân giải Xgal tạo thành khuẩn lạc màu xanh)

→ những tế bào nhận plasmid nhưng không có gen mục tiêu hoặc có gen mục tiêu nhưng cát/nối không đúng vị trí sẽ có khuẩn lạc màu xanh

- Vị trí cắt của EcoRV là ở giữa gen mã hóa β-galactosidase nên những tế bào nhận

được plasmid chuyển gen thành công thì khung đọc của gen β-galactosidase bị phá

vỡ dẫn đến không tạo được enzyme này → khuẩn lạc có màu trắng

- Những tế bào không nhận được plasmid sẽ không kháng được ampicillin nên không mọc được khuẩn lạc

*Kết quả biến nạp của nhóm:

- Đĩa (-): không có khuẩn lạc nào

- Đĩa (+): chỉ có 2 khuẩn lạc trắng chứng tỏ biến nạp thành công và hiệu suất cao

8 Chồng 2 đĩa (úp ngược) lên nhau và gói lại Ủ ở 37oC,

18-24 giờ

Phân tích sản phẩm biến nạp

Đếm số khuẩn lạc trắng và xanh trên mỗi đĩa, phân tích hiệu

suất biến nạp