chương 5 các vecto và sự tạo dòng

Vector PlasmidVector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DN

Các vector & sự tạo dòng CHƯƠNG 5

rDNA không phải là nhân bản động vật

Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là

công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức

năng, và sự điều hòa của các

gene và sản phẩm của gene.

• Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm:

– Xác định các gene mã hóa và sản phẩm của

chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis)

– Điều trị các bệnh do gene ( cystic fibrosis, rheumatoid arthritis,

vascular disease, và certain cancers )

– Sản xuất lượng lớn hormones, vaccines, và các

growth hormone, follicle-stimulating hormone )

Vector Plasmid

Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào

chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai.

Đặc trưng chính của các vector tạo dòng:

• Có trình tự cho phép sự tự sao chép trong vi khuẩn hay nấm men

• Có vị trí để chèn DNA ngoại lai Hầu hết các vector có trình tự cắt duy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn (MCS)

• Một phương pháp để nhận biết tế bào có chứa vector, thường là các marker chọn lọc tính kháng kháng sinh.

Các loại vector

• Plasmid – DNA dạng vòng tự sao chép nhân đôi trong tế bào vi

khuẩn Khả năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb)

• Phage – dẫn xuất của bacteriophage lambda; phân tử DNA thẳng có

thể được thay thế bằng DNA ngoại lai mà không làm gián đoạn vòng đời của nó Khả năng dòng hóa: 8-20 Kb

• Cosmids – DNA dạng vòng kết hợp các tính năng của plasmid và

phage Khả năng dòng hóa: 35-50 Kb

• Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) – dựa trên mini-plasmid F

của vi khuẩn Khả năng dòng hóa: 75-300 Kb

• Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) – một nhiễm sắc thể nhân

tạo có chứa telomeres, nguồn gốc của sao chép (ori), centromere của nấm men, và marker để lựa chọn xác định các tế bào nấm men Khả năng dòng hóa: 100-1000 Kb

Plasmid Vectors

Điện di trên gel agarose plasmid tự nhiên Plasmid nhân tạo đầu tiên pBR322

(High-Copy-Number)

Plasmid tự nhiên ColE1 Plasmid tự nhiên (low copy number) pSC101

The pUC 18 or 19 Cloning Vector

(Very high copy number)

RE Sites in blue occur only once in the plasmid

Lac Z α

Origin of

Replication

Multiple Cloning Site

Promotor Site

Antibiotic

Resistance

Gene

MCS – Multi Cloning Site

 Các vị trí cắt duy nhất

Chức năng sao chép không được mã hóa trên plasmid Nó sử dụng chức năng từ các DNA polymerase I và III, DNA-RNA polymerase của tế bào chủ.

Có thể ức chế sự tổng hợp protein với thuốc kháng sinh (chloramphenicol, spectinomycin) Vậy

sự sao chép của plasmid có xảy ra không khi chloramphenicol hiện diện trong tế bào?

Replicons kiểm soát khả năng

tương thích của plasmid

• Khả năng tương thích của plasmid: khả năng của hai plasmid khác nhau cùng tồn tại trong cùng một TB chủ

• Plasmid sử dụng các hệ thống sao chép giong nhau không thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào vi khuẩn

• Các plasmid mang cùng replicon thuộc nhóm không tương thích

Sự không tương thích của plasmids

Khi 2 plasmid cùng chia sẽ các yếu tố cùa cùng 1

bộ máy sao chép

Sẽ có sự cạnh tranh

Không thể cùng tồn tại khi không có sự chọn lọc

trong môi trường nuôi vi khuẩn

không thể duy trì trong cùng 1 vi khuẩn

Hơn 30 nhóm không tương thích được biết

pSC101 and its derivatives pSC101 ~5

Sự an toàn của plasmid

Một số plasmid tự nhiên có thể được chuyển giao cho TB khác bằng conjugation Conjugation đòi hỏi ba yếu tố:

– Một gen linh động trans-acting (mob)

– Một yếu tố cis-acting (bom)

– Một vị trí cụ thể bị đứt mạch (nicked) bởi mob (nic)

Một số plasmid cũ như pBR322 bị thiếu mob Một số vector mới hơn như pUC thiếu nic / bom và không thể linh động

Người ta tin rằng "an toàn" của các chủng vi khuẩn, vi rút và vectơ có thể được thực hiện trong một vài tuầnNIH thành lập Ban tư vấn về DNA tái tổ hợp (RAC)

Phải mất năm 1 (1976) trước khi dòng "an toàn" E.coli

Năm đó, RAC phát hành một bộ nguyên tắc đòi hỏi việc sử dụng các vi khuẩn an toàn

Asilomar Conference

NIH Guidelines

 Self Regulation in Science Milestone

 Contents

 Specified handling and construction processes

 Microorganisms containing recombinant DNA were

prohibited outside of the laboratory

 Vectors that sexually move to “unsafe” bacteria was

prohibited

 Subsequent modifications

 1986 expanded to include animals and plants, and 4 biosafety levels

 1994 officially relinquished control of GMO plants in the

environment to EPA and APHIS

Xu hướng tiếp theo là phát triển plasmid nhỏ

Ưu điểm

• Tăng hiệu quả của biến nạp

• Dễ dàng hơn tạo bản đồ enzyme cắt giới hạn

• Số lượng plasmid cao hơn

Giới hạn chính của tạo dòng sử

• Thích số lượng clone nhỏ để biến nạp

• Tạo ra các vùng gene lớn nhưng rời rạc

• Nếu bộ gene của E coli chứa 4,639,221 bp, cần

bao nhiêu clone để tạo dòng cả bộ genome?

• Nếu là vector biểu hiện thì các giới hạn liên quan đến biểu hiện protein của eukaryote

Bacteriophage lambda (λ)

that the central third

of the genome was not required for lytic

started to replace it

with E coli DNA

http://phage.bocklabs.wisc.edu/Virus.htm

Các vector tạo dòng là phage

• Vector phage có thể chứa đoạn DNA ngoại lai lên đến 23 KB

• Phage Lambda là phổ biến nhất

• 60% của bộ gen cần thiết cho con đường lytic Các đoạn của DNA Lambda bị loại bỏ và một mảnh stuffer được giữ lại

• Đoạn stuffer này giữ cho kích thước vector đúng và có mang gen marker Khi DNA ngoại lai được chèn vào vector, marker bị bất hoạt.

• Ví dụ: Charon 4A Lambda Khi Charon 4A Lambda là còn nguyên vẹn, beta-galactosidase phản ứng với X-gal và các khuẩn lạc có màu xanh lam Khi các đoạn DNA ngoại lai

chèn vào khu vực stuffer, gen lac mã hóa cho

beta-galactosidase bị bất hoạt, và các khuẩn lạc có màu trắng.

Lambda genome is approximately 49

kb in length.

Only 30 kb is required for lytic growth.

Thus, one could clone 19 kb of

“foreign” DNA.

Packaging efficiency 78%- 100% of the lambda genome.

A complete animation of the lytic cycle:

http://www.blackwellpublishing.com/trun/artwork/Animations/Lambda/lambda.html

Circularized lambda

ori

Không phải Bacteriophage lambda

COS

Tail Replication

ori

Lambda tốt :

hiệu quả hơn biến nạp plasmid DNA vào E.coli

tan khuẩn lạc (plaque)

Nhưng:

 Vector lai: plasmids mang cos

bacteriophage lambda

dòng hóa, đóng gói vào virus và

virus được cho nhiễm vào E.coli

vi khuẩn do đó các TB nhiễm phát

triển tạo các khuẩn lạc bình

thường

có thể nhồi vào vỏ của phage

Cosmids

• Cosmids tương tự như phage vector: sử dụng lambda, nhưng loại bỏ tất

cả trừ vị trí cos, ori, và marker chọn lọc Đóng gói in vitro tạo thành 1 plasmid lớn (50 kb) trong E coli.

• Cosmids được tách chiết từ vi khuẩn và cắt với enzyme cắt giới hạn

• DNA ngoại lai cũng được cắt với cùng enzyme cắt giới hạn và trộn với cosmid đã cắt Cosmid tái tổ hợp được đóng gói vào virus và cho nhiễm vào vi khuẩn.

• rcosmid sắp xếp tạo vòng và sao chép như 1 plasmid.

Shown above is a 50,000 base-pair long DNA molecule bound with six EcoRI molecules, and imaged using the atomic force microscope This image clearly indicates the six EcoRI "sites" and allows an accurate restriction enzyme map of the cosmid to be generated

http://homer.ornl.gov/cbps/afmimaging.htm

– Có thể điện biến nạp vào E coli

– Hữu dụng trong giải trình tự bộ gen vì đoạn chèn có kích thước

100 - 300kb

• Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men – YAC (Yeast Artificial Chromosome)

– Có thể sao chép trong E.coli và Yeast

– Là chromosome thu nhỏ (chứa ori, marker chọn lọc, 2 telomeres,

và 1 centromere

– Có thể nhận 200 kb -1000 kb; hữu dụng trong giải trình tự

• Ti plasmids: để chuyển gen vào thực vật

• Các vector biểu hiện

• Vector con thoi (shuttle vector): có thể sao chép ở 2 loài khác nhau

Yeast Artificial Chromosomes

trong nấm men (thường là các

gene sinh tổng hợp uracil hay

tryptophan).

• Cũng có E coli ori và marker

chọn lọc, nên có thể sao chép

trong E coli Sau đó được

tách chiết, tinh sạch, nối với

DNA ngoại lai và chuyển vào

trong nấm men.

Vector biểu hiện

Tạo RNA và protein từ đoạn DNA chèn vào

– Chỉ tạo RNA: vector chứa T7 promoter trước vị trí chèn và 1 gene có thể cảm ứng mã hóa cho T7 polymerase Cảm ứng bằng gen ức chế của lac operon và chất cảm ứng tổng hợp IPTG (isopropyl thiogalactoside).

– Tạo polypeptide hoặc mảnh của polypeptide: có thể tạo trong E coli

bằng cách thêm vị trí gắn ribosome trước promoter Cần kiểm tra lại khung đọc.

– Biến đổi sau dịch mã hoặc protein cắt bỏ intron: cần trong biểu hiện

ở TB eukaryote Cần promoter của eukaryote, polyadenylation (thêm poly-A), một marker chọn lọc hoạt động trong eukaryote.

Example Expression Vector

• For eukaryotic expression, this vector (from Invitrogen) has a cauliflower mosaic virus promoter (PCMV), a bovine growth hormone polyadenlyation site (BGHpA).

• The DNA inserted at “hORF” gets fused to a short peptide called an epitope, for which very specific anitbodies exist It also gets fused to 6 histidines, which allow easy purification on a column that has nickel ions bound to it (an affinity tag).

• For growth in mammalian cells, it has an SV40 viral origin of replication (SV40ori), and a zeocin resistance gene (Zeocin, with SV40 promoter/enhancer and SV40 poly A site).

• For growth in E coli it has the ColE1 replicon

Zeocin works as a selectable marker in bacteria as well as in eukaryotic cells

• There is also a T7 promoter for making RNA from the inserted gene, and an f1 origin of replication for making single stranded DNA (useful for sequencing)

Làm giàu vector tái tổ hợp bằng Alkaline Phosphatase

Dephosphorylation của các vector dang thẳng (linearized vector) bằng Alkaline Phosphatase

Biến nạp và chọn lọc

Screening

White White Blue Dead

Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

Hóa biến nạp

- DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid, có khả

năng dung nạp (competent)

- Xử lí CaCl 2 lạnh, kèm sốc nhiệt (Ex: 42 0C, 2’)  thể biến nạp (transformants) (Ex:

10 5 -10 6 transformants/1 mg DNA)

Điện biến nạp (electrotransformation hay electroporation)

- Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung (pulse)

- Hiệu quả biến nạp cao có thể đến 10 9 -10 10 transformants/1mg DNA

- Đoạn DNA biến nạp có kích thước lớn (25-135kb)

- Tỉ lệ tế bào chết đáng kể

CƠ CHẾ ĐiỀU HÒA BiỂU HiỆN GEN

Z = beta galactosidase, Y = lactose permease A = thiogalactoside transactylase, lacI = repressor, Pi = promoter for the lac repressor,

P and O = promoter and operator

lac operon khi có lactose

lac operon khi không có lactose

Sàng lọc dựa trên Vector

Blue/White Screening

• E coli normally produces β -galactosidase

• Production is under control by the lac operon

• Chủng E coli chủ bị xĩa vùng N-terminus của lacZ

β -galactosidase: α4; 1023 aa

E coli lacZ‘ (aa 1-146) → Lac- phenotype

E coli lacZ ∆ M15 (aa 11-41) → Lac- phenotype

E coli lacZ‘ + lacZ ∆ M15 → Lac+ phenotype =

α -complemention

Nguyeân taéc boå sung α (Complementation- α )

• Chất cảm ứng THIOGALACTOPYRANOSIDE

ISOPROPYL-ß-D-(IPTG)

• Chất chỉ thị màu 3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside (X-gal), khuẩn lạc hóa xanh

5-Bromo-4-chloro-• Khi chèn DNA ngoại lai vào giữa trình tự mã hóa alpha

peptide trên vector hoặc lacZ,

peptide không được tạo ra Do

đó các khuẩn lạc chứa vector và DNA ngoại lai sẽ có màu trắng

- Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid

- Tế bào nhận được plasmid không có gene lạ

vào

- Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp

Cô chaát cuûa β -Galactosidase

Chất cảm ứng Operon lac

Chèn  Bất hoạt

Chèn  Bất hoạt (tiếp theo)

Lai trên khuẩn lạc (Colony) và trên đĩa (Plaque)

Làm gì được với DNA library?

• Dùng bổ sung cho 1 đột biến (phổ biến trong nghiên cứu vi khuẩn)

• Sử dụng trong lai khuẩn lạc (colony hybridization)

Thư viện DNA (genomic library)

• Toàn bộ DNA của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ bằng lắc cơ học hay bởi các RE rồi gắn vào các vector

Phân tích tên gel agarose DNA bộ gene cắt khơng

hồn tồn

Xác định nồng độ enzyme tối ưu

Genomic Library

Số lượng clone/thư viện bộ gene

N = ln (1-P) / ln (1-f), N = số lượng clones, P = xác suất DNA ngoại lai tìm thấy trong thư viện, f = tần suất của DNA ngoại lai trong thư viện = kích thước DNA ngoại lai (Kb)/ kích thước DNA bộ gen (Kb)

Tính số lượng clone cần thiết để có thể 99% tìm thấy 1 clone mang mảnh DNA ngoại lai 5 Kb trong thư viện DNA bộ gen E.coli có kích thước 4.7 x 10 3 Kb.

Thư viện cDNA

 Reverse transcriptase tổng hợp c-DNA mạch

đơn (complementary DNA) từ khuôn mRNA

 DNA polymerase tổng hợp c-DNA kép

 Gắn c-DNA kép vào plasmid

 Biến nạp vào vi khuẩn

cDNA library

Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Screening libraries by colony hybridization

Bài tập 1 Thiết lập phản ứng RE với thể tích 50 microlit Cho biet enzyme

RE gốc có nồng độ 20.000 unit/microlit, dung dịch đệm gốc cho enzyme là 10X, DNA gốc là 10 microgram/microlit Cho rằng phản ứng cần cắt 1 microgram DNA và để cắt hoàn toàn lượng DNA này cần sử dụng 20 unit enzyme, dung dịch đệm 1X.

Bài tập 2 Tính toán phản ứng cắt DNA với 2 RE RE A hoạt động 100%

với buffer 1 và 75% với buffer 2 RE B hoạt động 50% với buffer 1 và 100% với buffer 2.

Có bao nhiêu cách tạo phản ứng cắt?

Nếu cắt đồng thời với 2 RE, buffer nào tốt nhất?

BÀI TẬP

Bài tập 3 Tìm xem trong những RE sau, những cặp enzyme nào có thể

tạo ra các đầu tương hợp:

Sau3AI : /GATC ; AluI : AG/CT ; EcoRI : G/AATTC ; XmaI : C/CCGGG ; PstI : CTGCA/G ; BamHI : G/GATCC ; SmaI : CCC/GGG ; SspI : AAT/ATT

Bài tập 4 Tính khoảng cách trung bình (lý thuyết) (đơn vị nucleotide) giữa

2 điểm nhận biết của các RE sau:

4.1 Cho rằng: đoạn DNA có thành phần GC chiếm 50%.

4.2 Cũng tính tương tự với điều kiện đoạn DNA có thành phần GC chiếm 38% (trường hợp bộ gene tế bào nấm men) Cho rằng kích thước trung bình của gene thuộc tế bào nấm men là 1.5 kb, vector plasmid có thể chèn được đoạn gene với kích thước tối đa là 15 kb; những enzyme RE nào có thể sử dụng để tạo dòng các đoạn DNA trên, giải thích cụ thể RE được sử dụng trong phản ứng cắt hoàn toàn hay từng phần?

Bài tập 5 Thiết lập bản đồ RE: 4 thí nghiệm được thực hiện riêng biệt với

cùng 1 loại DNA, các điều kiện phản ứng như nhau, ngoại trừ các RE sử dụng

trong 4 ống là khác nhau, lần lượt là: HpaI, PvuII, PstI và ScaI Kết quả điện di

trên gel agarose sản phẩm của phản ứng cắt cho kết quả như hình sau:

MM

6660 4360

2320 2030

3800

3400 2610

6030 4630

1350

Molecular Mass (MM): thang trọng lượng phân tử của bộ gene phage λ marker

(DNA mạch đôi) được cắt bằng HindIII.

5.1 Suy luận cấu hình của đoạn DNA trên: mạch thẳng hay dạng vòng? Với mỗi loại RE, cho biết có bao nhiêu điểm nhận biết của RE đó?

Để có thể thiết lập một cách chính xác hơn bản đồ RE của đoạn DNA này, các phản ứng cắt bằng 2 RE được thực hiện Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm các phản ứng cắt này được minh họa trên hình sau:

BamHI ClaI

BamHI + PstI PstI

BamHI + ClaI

PstI + ClaI

13.2

7.2 6.2 6.0 5.4

4.4 4.2

3.6

1.8

1.6

7.2 6.2 5.4

3.6 3.6

1.8 1.8

1.6 1.6

5.2 Kết quả này có phù hợp với những giả thuyết đã được suy luận về cấu trúc của đoạn DNA? Thiết lập bản đồ RE của đoạn DNA này