Nhóm 2 Kiểm Nghiệm Vi Sinh.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SI[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Tháng 02 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Ts TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG ĐẶNG THỊ HẰNG

NGUYỄN PHƯƠNG LAN NHI

VÕ HỒNG PHẨM

LÊ DĂNG DÂNG NGUYỄN THỊ MINH HẠNH

Tháng 02 năm 2023

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH SÁCH CÁC BẢNG ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1

1.2.1 Vật liệu 1

1.2.2 Phương pháp nghiên cứu 1

1.3 Định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.3.1 Quy trình định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.3.2.1 Biện luận 2

1.3.2.2 Kết quả 3

1.4 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3

1.4.1 Vật liệu 3

1.4.3.1 Kết quả 3

1.4.3.2 Biện luận 4

1.5 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN 4

1.5.2.1 Kết quả 4

1.5.2.2 Biện luận 6

BÀI 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 7

2.1 Quy trình và kết quả 7

2.2 Biện luận 9

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10

3.1 Các bước tiến hành 10

3.2 Kết quả vi khuẩn hiếu khí 10

3.3 Kết quả nấm men, nấm mốc 11

3.4 Kết luận 11

i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BGBL: Brilliant Green Bile Broth Lactose

EC: E coli medium

LSB: Lauryl Sulphate Broth

TBX: Thạch trypton - mật – glucuronid

BPW: Buffered Pepton Water

RV: Rappaport - Vassiliadis Soya Peptone

HE: Hektoen Entric Agar

VP:Voges - Proskauer

KIA: Kliger Iron Agar

PCA: Plate Agar

TSA: Tryptone Soya Agar

VRBL: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể

BPA: Baird – Parker Agar

DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

EMB: Eosin Methylene Blue Agar

MPN: Most Probable Number

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả đếm khuẩn lạc Coliforms 3

Bảng 2.1 So sánh kết quả thử nghiệm sinh hóa Salmonella 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Kết quả cấy mẫu nồng độ 10-1 trên môi trường VRBL 2

Hình 1.2 Kết quả cấy mẫu nồng độ 10-2 trên môi trường VRBL 2

Hình 1.3 Kết quả cấy mẫu trên môi trường TBX 3

Hình 1.5 Mẫu trong môi trường BGBL 5

Hình 1.6 Mẫu trong môi trường EC 5

Hình 1.7 Mẫu sau khi cấy lên thạch EMB 6

Hình 2.1 Cân mẫu và đồng nhất mẫu 7

Hình 2.2 Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường HE 8

Hình 2.3 Kết qua thử nghiệm sinh hóa 9

Hình 3.1 Cấy mẫu trên môi trường PCA lần 1 10

Hình 3.2 Cấy mẫu trên môi trường PCA lần 2 11

Hình 3.3 Cấy mẫu trên môi trường DRBC 11

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

1.1 Đặt vấn đề

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí

có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37℃ trong 24 giờ Coliforms được xem là một chất chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường dung để chỉ thị khả năng hiện diện của các loài vi sinh vật

Nhóm Coliforms gồm 4 giống: E coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Vật liệu

Mẫu thí nghiệm: sữa đậu nành chợ

Thiết bị: Tủ cấy, và các dụng cụ thí nghiệm

Hóa chất: Môi trường cấy VRBL (Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể)

1.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nhóm thực hiện theo hai phương pháp là đếm khuẩn lạc và phương pháp MPN

1.3 Định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc

1.3.1 Quy trình định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc

Bước 1: Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu có nồng độ là 10-1, 10-2,

10-3

Bước 2: Chuyển 1 ml của mỗi nồng độ vào đĩa petri, mỗi nồng độ thực hiện 2 lần Bước 3: Rót môi trường VRBL vào đĩa petri đã có mẫu đổ môi trường bằng 1

3 đĩa rồi trộn đều với dịch cấy

Bước 4: Sau khi trộn đều mẫu đợi cho đông đặc và đem ủ ở nhiệt độ 37℃ trong

24 giờ

Bước 5: Chọn những đĩa petri có số lượng khuẩn lạc từ 10 - 150, đếm những khuẩn lạc điển hình có màu đỏ tía có đường kính 0,5 mm trở lên (đôi khi vùng có mật độ tủa hơi đỏ bao quanh)

Bước 6: Xác định mật số Coliforms

Lưu ý: Nếu có những khuẩn lạc có hình thái không điển hình thì cũng đếm và chọn

5 khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang mật

1.3.2 Kết quả và biện luận

2

Sau khi ủ qua 24 giờ ở 37℃

Hình 1.1 Kết quả cấy mẫu nồng độ 10-1 trên môi trường VRBL

Hình 1.2 Kết quả cấy mẫu nồng độ 10-2 trên môi trường VRBL

1.3.2.1 Biện luận

Vi khuẩn Coliforms ở Hình 1.1a và Hình 1.1b có nồng độ pha loãng là 10-1 nhưng khi nhìn khuẩn lạc ở cả hai hình ta thấy Hình 1.1a có thể nhìn rõ khuẩn lạc hơn so với Hình 1.1b

Vi khuẩn Coliforms ở Hình 1.2a và Hình 1.2b có nồng độ pha loãng là 10-2 ở 37℃ trong 24 giờ hầu như khuẩn lạc không có ở Hình 1.2a và Hình 1.2b là những vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh

Khi nhìn vào những hình trên ta thấy mẫu ở Hình 1.1, thấy rằng tuy cùng chung một nồng độ pha loãng thì có đĩa petri thấy rõ và có đĩa thì không thấy như Hình 1.2, hầu như là không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng

1.3.2.2 Kết quả

Bảng 1.1 Kết quả đếm khuẩn lạc Coliforms

N = ∑ 𝑎

𝑉∗(𝑛1 +0,1 𝑛2)∗𝑑 = 18+27+120+118

1∗(2+0,1∗2)∗10 −2 = 1,3 ∗ 104 (CFU/ml)

1.4 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.4.1 Vật liệu

Mẫu thí nghiệm: Sữa đậu nành chợ

Thiết bị: Tủ cấy và các dụng cụ thí nghiệm

Hóa chất: Môi trường TBX và các hóa chất khác

1.4.2 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Bước 1: Đồng nhất hoặc pha loãng mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

Bước 2: Chuyển 0,1 ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào đĩa petri môi trường thạch TBX, mỗi nồng độ lặp lại hai lần

Bước 3: Cấy trải đều khô và ủ trong vòng 24 giờ ở 44℃

Bước 4: Chọn những đĩa petri có số lượng khuẩn lạc điển hình (có màu xanh) nhỏ hơn 150 và tổng số khuẩn lạc nhỏ hơn 300 (gồm cả điển hình và không điển hình)

Bước 5: Tính toán kết quả mật độ E coli

1.4.3 Kết quả và biện luận

1.4.3.1 Kết quả

Hình 1.3 Kết quả cấy mẫu trên môi trường TBX. (a) mẫu ở nồng độ 10 -1 , (b) mẫu ở nồng độ 10 -2 , (c) mẫu ở nồng độ 10 -3

4

1.4.3.2 Biện luận

Khi nhìn vào những hình dưới ta thấy qua Hình 1.3a, ở nồng độ 10-3 cũng có các khuẩn lạc và so sánh với các mật độ khác nhau thì mật độ khuẩn lạc cũng khác nhau ở Hình 1.3b, mật độ khuẩn lạc thấp nhưng lại dính vào nhau rất khó để đếm khuẩn lạc Hình 1.3c, số lượng khuẩn lạc rất thấp và khuẩn lạc ở 3 hình dưới đều không có khuẩn

lạc đặc trưng nên là không có E coli trong mẫu trên

1.5 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

1.5.1 Quy trình định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

Bước 1: Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có nồng độ là 10−1, 10−2,

10−3

Bước 2: Chuyển 1 ml của mỗi nồng độ 10-1, 10-2,10-3 vào vào ống 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37℃, 48 giờ

Bước 3: Định lượng Coliforms: cấy vào ống môi trường BGBL, ủ ở 37℃, 48 giờ

Định lượng E coli: cấy vào ống môi trường EC, ủ ở 44,5℃, 24 giờ

Bước 4: Sau khi ủ thấy có ống sinh hơi ở môi trường EC thì đem cấy ria lên thạch EMB, ủ ở 37℃, 24 giờ

Bước 5: Sau khi ủ nếu có xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng (có ánh kim xanh) thì đem cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate ủ ở 44,5℃, 24 giờ Làm thử nghiệm IMViC, đếm

số ống EC dương tính và tra bảng MPN

1.5.2 Kết quả và biện luận

1.5.2.1 Kết quả

Mẫu được pha loãng và tăng sinh trong môi trường LSB sau khi ủ ở 37℃, 48 giờ

Hình 1.4 Mẫu trong môi trường LSB

Tất cả ống nghiệm đều có hiện tượng sinh hơi nên đều dương tính Lấy 3 ống nghiệm ở cả 3 nồng độ pha loãng 10−1, 10−2, 10−3 cấy vào môi trường BGBL để xem

sự hiện diện của Coliforms và môi trường EC để xem sử hiện diện của E coli

Hình 1.5 Mẫu trong môi trường BGBL. (sau khi ủ ở 37℃, 48 giờ)

Quan sát Hình 1.5 ta có thể thấy mẫu sau khi ủ ở môi trường BGBL có xuất hiện bọt khí chứng tỏ mẫu có Coliforms

Tất cả các ống của cả 3 nồng độ pha loãng 10−1, 10−2, 10−3 đều nổi bọt khí Từ

đó, ta tra bảng chỉ số MPN và có kết quả là 1,1*103 MPN/100 ml

Hình 1.6 Mẫu trong môi trường EC. (sau khi ủ ở 44,5℃, 24 giờ)

Quan sát Hình 1.6, mẫu sau khi ủ ở môi trường EC có sự xuất hiện bọt khí ở cả 3 ống ở độ pha loãng 10−1, 3 ống ở độ pha loãng 10−2 và 2 ống ở độ pha loãng 10−3

Vì vậy, ta nghi ngờ có sự xuất hiện của E coli

6

Khi nghi ngờ có sự xuất hiện của E coli, ta đem cả 3 ống đều nổi bọt khí ở cả 3

nồng độ pha loãng rồi đem đi cấy lên đĩa chứa môi trường EMB và ủ ở 37℃, 24 giờ

Hình 1.7 Mẫu sau khi cấy lên thạch EMB

Quan sát Hình 1.7 ta có thể thấy mẫu không có sự xuất hiện của khuẩn lạc đặc

trưng chứng tỏ không E coli

1.5.2.2 Biện luận

Sau khi cấy vào ống môi trường BGBL thì tất cả các ống đều xuất hiện bọt khí nên khi tra bảng ta có chỉ số MPN lớn hơn 110 Từ đó ta có kết quả là 1,1*103 MPN/100

ml Trên thực tế thì ta cần phải pha loãng thêm nồng độ 10−4, 10−5, 10−6, để tính kết quả nhưng vì đang học thực hành nên chỉ cần pha loãng ở 3 nồng độ cơ bản là

10−1, 10−2, 10−3

Sau khi cấy mẫu trên đĩa EMB thì ta quan sát không thấy có khuẩn lạc đặc trưng

chứng tỏ không có E coli nên không cần thực hiện các phản ứng sinh hóa để đinh lượng E coli Đĩa cấy của nhóm do cấy không đều nên không xuất hiện rõ khuẩn lạc

ở cả ba đường cấy

BÀI 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

2.1 Quy trình và kết quả

Giai đoạn 1: Đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh BPW (tăng sinh)

Chuẩn bị:

Mẫu: cá biển tươi

Môi trường tăng sinh: Dung dịch Buffered Pepton Water (BPW)

Bước tiến hành:

Tiến hành cân 10 g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90 ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây Ủ ở 37oC, 18 – 24 giờ

Giai đoạn 2: Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV (tăng

sinh chọn lọc)

Hình 2.1 Cân mẫu và đồng nhất mẫu

Chuẩn bị:

Dịch tăng sinh: mẫu trong BPW đã được ủ

Môi trường tăng sinh: Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton (RV)

Bước tiến hành:

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh RV

đã được ủ ấm 42oC Ủ ở 42oC, 18 – 24 giờ Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm

24 giờ

Giai đoạn 3: Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc đặc biệt (Phân lập

và nhận diện)

Chuẩn bị:

8

Dịch tăng sinh chọn lọc

Môi trường: Hektoen Entric Agar.(HE)

Bước tiến hành:

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch

tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella, ở

đây sử dụng môi trường HE

Hình 2.2 Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường HE

Kết quả:

(+) Khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể

chiếm gần hết khuẩn lạc

Giai đoạn 4: Thử nghiệm sinh hóa

Chuẩn bị:

Đĩa môi trường HE chứa các khuẩn lạc

Môi trường: Indol, Voges-Proskauer (VP), Kligler Iron Agar (KIA)

Bước tiến hành:

Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa cấy ria lần lượt vào các ống nghiệm chứa môi trường Indol và VP

Cho 5 – 7 giọt Kovacs vào ống chứa Indol

Cho 10 giọt alpha – naphthol 5% và 6 giọt KOH 40% vào ống chứa VP

Dùng que cấy thẳng cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa cấy ria vào ống nghiệm chứa môi trường KIA

Kết quả:

KIA (+) màu đen xuất hiện → có quá trình khử lưu huỳnh sinh H2S

VP (-) không đổi màu môi trường

Indol (+) xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường

Hình 2.3 Kết qua thử nghiệm sinh hóa a)

Thử nghiệm Indol; b) Thử nghiệm VP;

c) Thử nghiệm KIA

2.2 Biện luận

Bảng 2.1 So sánh kết quả thử nghiệm sinh hóa Salmonella

(+): dương tính, có hiện tượng sảy ra, (-): âm tính, không có hiện tượng sảy ra

Thử nghiệm sinh hóa bị sai kết quả so với dự đoán do trong quá trình làm đã bị tạp nhiễm hoặc do có rất nhiều nguyên nhân có thể xảy ra như:

Nguyên nhân khách quan: Do thuốc thử bị hư hỏng có vấn đề từ trước, nồi hấp có vấn

đề

Nguyên nhân chủ quan: Do thao tác cấy chưa đúng kỹ thuật, để nút bông bịt kín ống bị nhiễm khuẩn, chưa khử trùng kĩ tủ cấy, chưa hơ kĩ đầu ống nghiệm, chưa lấy được khuẩn lạc điển hình

Chính vì có cả các nguyên nhân chủ quan lẫn khách quan nên chưa thể khẳng định mẫu

thử có Salmonella Cần thực hiện lại các phản ứng sinh hóa để có kết quả chính xác

nhất

b)

10

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

3.1 Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị 10 g mẫu mì tươi

Bước 2: Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3

Bước 3: Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn hiếu khí

Cấy trang 0,1 ml lên đĩa chứa môi trường thạch PCA, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa

Ủ ở 30oC trong 24 giờ

Chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25 - 250 để đếm

Ghi nhận kết quả

Bước 4: Kiểm tra sự hiện diện của nấm men, nấm mốc

Cấy trang 0.1 ml mẫu lên đĩa DRBC, ủ ngữa đĩa ở 25℃, 3 - 5 ngày, mỗi nồng độ lặp lại

2 đĩa

Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men

Ghi nhận kết quả

Bước 5: Tính kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men, nấm mốc trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)

3.2 Kết quả vi khuẩn hiếu

Sau khi ủ 30℃, 24 giờ

Hình 3.1 Cấy mẫu trên môi trường PCA lần 1. (a) Chụp mẫu ở nồng độ pha loãng

10 -1 ; (b) Chụp mẫu ở nồng độ pha loãng 10 -2 ; (c) Chụp mẫu ở nồng độ pha loãng 10 -3

Hình 3.2 Cấy mẫu trên môi trường PCA lần 2 (a) Chụp mẫu ở nồng độ pha

loãng 10 -1 ; (b) Chụp mẫu ở nồng độ pha loãng 10 -2 ; (c) Chụp mẫu ở nồng độ pha

loãng 10 -3

Dựa vào Hình 3.1 cho thấy ở cả 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 đều có sự xuất hiện của vi khuẩn hiếu khí

Biện luận

Nồng độ 10-1, 10-2 ta thấy mật số vi khuẩn xuất hiện khá cao trên 250 khuẩn lạc

Ở nồng độ này không đếm được mật số vi khuẩn

Nồng độ 10-3 ta đếm đuợc mật số vi khuẩn do khuẩn lạc xuất hiện với mật số thấp hơn dao động từ 25 - 250

Dựa vào phương pháp CFU, ta đếm được mật số vi khuẩn hiếu khí ở nồng độ pha loãng 10-3 có 90 khuẩn lạc Áp dụng công thức:

n∗V∗d = 90

1∗0.1∗10−3 = 9 ∗ 105(CFU/g)

Ở Hình 3.2 trong quá trình cấy, thao tác cấy trang chưa khô nên không tạo được khuẩn lạc

3.3 Kết quả nấm men, nấm mốc

Mẫu sau khi ủ 250C sau 3 – 5 ngày

Hình 3.3 Cấy mẫu trên môi trường DRBC a), b) ở nồng dộ pha loãng 10 -1; c) mẫu cấy ở nồng độ pha loãng 10 -3

Biện luận: dựa vào Hình 3.3a, Hình 3.3b cho thấy ở mẫu nồng độ pha loãng

10-1 không có sự hiện diện của nấm men, nấm mốc Ở Hình 3.3c đĩa cấy bị lỗi nguyên nhân là do thạch bị đổ mỏng và cấy quá khô

3.4 Kết luận

Trong 10 g mì tươi mật số xuất hiện vi sinh vật hiếu khí là 9*105 CFU/g (nhỏ hơn 106) nằm trong giới hạn cho phép sử dụng