BÁO cáo môn THỰC tập PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH

Môi trường Violet Red Bile là môi trường tăng sinh chọn lọc, dựa vào các đặc tính của Coliforms,VRB có những thành phần phù hợp giúp vi khuẩn Coliform phát triển, dùng để phát hiện sự có

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

¨¨¨¨¨¨¨¨

BÁO CÁO MÔN THỰC TẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH

Họ và tên: Trừ Lâm Yến Linh

MSSV: 18180218

Nhóm 16- Lớp 2

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 1 năm 2021

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ

I Mục tiêu:

Để xác định có bao nhiêu Coliforms có trong 1 gam mẫu vật kiểm nghiệm cho biết mức

độ ô nhiễm của thịt

II Nguyên tắc:

- Coliforms là những trực khuẩn Gram âm (-), không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 ±0,5° C trong

24 giờ, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật Số lượng hiện diện của Coliforms trong thực phẩm được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

- Mẫu thịt sau khi pha loãng được nuôi cấy trong môi trường VRB( Violet Red Bile) và ủ qua đêm Môi trường Violet Red Bile là môi trường tăng sinh chọn lọc, dựa vào các đặc tính của Coliforms,VRB có những thành phần phù hợp giúp

vi khuẩn Coliform phát triển, dùng để phát hiện sự có mặt của Coliforms thông qua các khuẩn lạc đặc trưng

Thành phần gồm:

• Pepton và cao nấm men (yeast Extract) là nguồn cung cấp nitơ, lưu huỳnh,carbon, vitamin và khoáng chất

• Hỗn hợp mật muối(Bile salts) và tinh thể màu tím(Crystal violet) là chất

ức chế vi khuẩn Gram dương Coliforms là vi khuẩn gram âm nên có thể mọc được trên môi trường VRB

• Đường Lactose là carbohydrate giúp lên men sinh khí gas, acid Đặc điểm

để nhận biết được có sự xuất hiện của Coliforms trong mẫu hay không

• Muối Natri Clorua nhằm cân bằng áp suất thẩm thấu

• Neutral red là chất chỉ thị màu

- Cấy các khuẩn lạc đặc trưng vào môi trường BGBL là môi trường chọn lọc, khẳng định sự có mặt của Coliforms,… ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gram dương và 1 số vi khuẩn gram âm trong cả quá trình lên men lactose Sau khi cấy các khuẩn lạc vào môi trường BGBL, ống nghiệm có sinh hơi chứng tỏ dương tính với Coliforms do Coliforms có khả năng lên men đường lastose có trong thành phần môi trường

Thành phần gồm:

• Pepton là nguồn cung cấp dinh dưỡng

• Đường Lactose là carbohydrate giúp lên men sinh khí gas, acid

• Salt bile và Green brilliant là chất ức chế vi khuẩn gram dương(+) và 1 số

vi khuẩn gram âm Tránh các vi khuẩn khác cạnh tranh chất dinh dưỡng với Coliforms và mọc trên đĩa, gây nhầm lẫn với Coliforms

III Qui trình:

1 Cân 10 g mẫu thịt vào 1 bao PE + 90g dung dịch pha loãng (Dung dịch pha loãng

10-1)

2 Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu

3 Tiến hành pha loãng từ dung dịch pha loãng 10-1

4 Cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3 và 10-4 vào đĩa petri trống (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

10-3 x 2 đĩa 10-3 x 2 đĩa

5 Sau đó đổ 15ml môi trường VRB vào mỗi đĩa, lắc đều, đợi đông đặc Đổ thêm 5ml môi trường VRB, để đông đặc

6 Lật ngược đĩa, ủ ở 37°C qua đêm

7 Mẫu đối chứng: Cấy 1ml canh khuẩn E.coli vào 1 đĩa, thực hiện đổ đĩa môi trường tương tự mẫu

8 Đếm và ghi nhận số khuẩn lạc đặc trưng trong các đĩa nồng độ 10-3 và 10-4 Khuẩn lạc đặc trưng: có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đừơng kính lớn hơn hay bằng 0,5mm

9 Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng đã đếm cấy sang môi trường BGBL Ủ 37°C qua đêm

Cấy KL mẫu đối chứng Cấy 5 KL đặc trưng vào 5 ống

10 Quan sát sự sinh hơi trên môi trường BGBL Tính tỉ lệ xác nhận R trên các ống mẫu

IV Kết quả:

Sự xuất hiện của các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa môi trường VRB: có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính lớn hơn hoặc bằng 0,5mm

- Đĩa chứng dương: có rất nhiều khuẩn lạc đặc trưng, không thể đếm số lượng khuẩn lạc, N>300

- Đĩa dung dịch pha loãng nồng độ 10-3 : đĩa 1 có 3 khuẩn lạc đặc trưng, đĩa 2 có

3 khuẩn lạc đặc trưng

- Đĩa dung dịch pha loãng nồng độ 10-4 : đĩa 1 có 1 khuẩn lạc đặc trưng, đĩa 2 không có khuẩn lạc đặc trưng nào

Sau khi chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng đã đếm vào 5 ống môi trường BGBL và 1 ống chứng dương:

- Ống chứng dương: có sự xuất hiện của bọt khí trong ống Durham ngược

- Ống chứa khuẩn lạc của dung dịch pha loãng nồng độ 10-4 có xuất hiện bọt khí trong ống Durham ngược

- 4 ống còn lại không xuất hiện bọt khí trong ống Durham ngược

Tỉ lệ xác nhận R

R = 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 sinh ℎơ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝐵𝐺𝐵𝐿

𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 đã 𝑐ấ𝑦 = 1

5 = 0,2

Tổng số Coliforms (cfu/g) (C)

Tổng số Coliforms trong mẫu thịt kiểm nghiệm

Trong đó:

- A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 gram hay 1ml mẫu

- N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn

- ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

- V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong đĩa

- fi: Độ pha loãng tương ứng

V Biện luận kết quả:

Sự xuất hiện của các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường cấy đĩa VRB:

- Đĩa chứng dương có xuất hiện rất nhiều khuẩn lạc cho thấy thao tác cấy đĩa đảm bảo vô trùng, quá trình pha môi trường VRB, các hóa chất, và quá trình hấp khử trùng, các thao tác được đảm bảo chính xác, nên xuất hiện đúng các khuẩn lạc đặc trưng, có thể tin tưởng kết quả ở mẫu vật

- Đĩa mẫu thịt kiểm nghiệm của nhóm, có rất ít khuẩn lạc đặc trưng, điều này có thể chứng tỏ rằng mẫu thịt đi kiểm nghiệm sạch, có ít vi khuẩn Coliforms Sau khi cấy các khuẩn lạc đặc trưng qua ống nghiệm môi trường BGBL:

- Ở ống chứng dương có sự xuất hiện bọt khí trong chuông Durham ngược, chứng

tỏ đã cấy đúng khuẩn lạc, đặc trưng, thao tác cấy và môi trường đảm bảo

- Ở ống mẫu chỉ có ống chứa khuẩn lạc của dung dịch pha loãng 10-4 xuất hiện khí, những ống còn lại thì không xuất hiện.Có thể do những khuẩn lạc ở các ống môi trường còn lại không phải là khuẩn lạc đặc trưng nên không có sự xuất hiện của bọt khí

Do số khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa của cả 2 nồng độ pha loãng có N<300 và tỉ lệ xác nhận R =0,2 > 0 nên tổng số Coliforms trong mẫu ở 2 nồng độ tính theo công thức bình thường Kết quả định lượng được có khoảng 636 vi khuẩn Coliforms có trong 1 gam mẫu thịt

VI Kết luận:

Mẫu thịt của nhóm có sự xuất hiện của vi khuẩn Coliforms, nhưng với số lượng ít Trên đĩa cấy khuẩn lạc ở nồng độ dung dịch pha loãng 10-3 và nồng độ dung dịch pha loãng

10-4 có dưới 10 khuẩn lạc dặc trưng

Các ống có sự xuất hiện bọt khí là 1 trên tổng 5 ống mẫu của nhóm Những ống không xuất hiện bọt khí có thể là do khuẩn lạc đó không phải là khuẩn lạc đặc trưng hoặc khuẩn lạc quá nhỏ và ít nên không thể xuất hiện bọt khí

Tỉ lệ xác nhận R:

R = 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 sinh ℎơ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝐵𝐺𝐵𝐿

𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 đã 𝑐ấ𝑦 = 1

5 = 0,2

Định lượng Coliforms:

𝑛1𝑉𝑓1+𝑛2𝑉𝑓2 × 𝑅 = 3+3+1

2.1.10−3+2.1.10−4 × 0,2 =636 (cfu/g) (C)

Định lượng Coliforms mẫu thịt: có khoảng 636 vi khuẩn Coliforms trên 1 gam mẫu thịt kiểm nghiệm

ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus

I Mục tiêu:

Để xác định có bao nhiêu S.aureus có trong 1 gam mẫu vật kiểm nghiệm

II Nguyên tắc:

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, không di động, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý Có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, sucrose Phát triển tốt ở môi trường

tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh Ngoài ra S aureus có thể

sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao

Môi trường Baird Parker Agar (BPA) là môi trường nuôi cấy chọn lọc, định lượng

S.aureus gồm:

• Tryptone, cao thịt, cao nấm men lag nguồn cung cấp dinh dưỡng

• Lithium Chloride có vai trò chọn lọc

• Sodium Pyruvate và Glycine là thành phần phát triển S aureus

Trên môi trường thạch BPA khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, có tâm đen-quầng sáng- quầng trong Nguyên nhân hình thành hình dạng khuẩn lạc đặc trưng:

• S aureus có enzyme coagulase phân giải Tellurite có thành phần Egg Yolk

Tellurite trong môi trường nuôi cấy thành Telluride tạo tâm đen của khuẩn lạc

• S aureus có enzyme lecithinase phân giải licithin tạo quầng sáng cho khuẩn lạc

• S aureus có enzyme lipase phân giải lipid thành các acid béo và glycerol tạo

quầng trong cho khuẩn lạc

Sau đó, cấy các khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường tăng sinh TSA.TSA là môi trường giàu dinh dưỡng chứa mẫu phân giải bằng casein và bột đậu tương giúp

trường huyết tương để xác định trong mẫu có S.aureus không thông qua yếu tố gây đông máu bởi enzyme coagulase của Staphylococcus aureus Do coagulase

phản ứng với fibrinogen trong huyết tương thành fibrin dẫn đến hiện tượng đông đặc huyết tương Nếu có sự đông tụ huyết tương, chứng tỏ mẫu thịt kiểm nghiệm

có vi khuẩn Staphylococcus aureus

III Qui trình

1 Cấy 0,1ml dung dịch pha loãng có nồng độ 10-3 vào 2 đĩa petri môi trường BPA

10-3

2 Lật ngược đĩa và ủ 37°C trong 2 ngày

3 Mẫu đối chứng: cấy 0,1ml dịch canh khuẩn S.aureus vào 1 đĩa petri môi trường BPA, thực hiện tương tự như mẫu

4 Sau khi ủ 2 ngày, quan sát khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa đối chứng và 2 đĩa cấy dung dịch pha loãng có nồng độ 10-3 có hình dạng: tính từ tâm ra: đen- quầng sáng- quầng trong

5 Cấy 1 khuẩn lạc của mẫu đối chứng và 4 khuẩn lạc ở 2 đĩa còn lại vào môi trường TSA, ủ 37°C qua đêm

Nhóm cấy 6 khuẩn lạc gồm: 1 khuẩn lạc của mẫu đối chứng, 1 khuẩn đặc trưng

có xuất hiện quần trong và 4 khuẩn lạc không có quầng trong

6 Cấy chuyển mẫu đối chứng và mẫu sang môi trường huyết tương, ủ 37°C và theo dõi 2, 4, 6, 8, , 24 giờ Quan sát sự đông tụ huyết tương

IV Kết quả

Sau khi cấy trong môi trường BPA, các đĩa có sự xuất hiện các khuẩn lạc đặc trưng có hình dạng: hình tròn, tính từ tâm ra có màu đen- quầng sáng- quầng trong

- Ở đĩa chứng dương: có rất nhiều khuẩn lạc đặc trưng, không thể đếm số lượng

- Ở đĩa mẫu thứ nhất của nhóm: không có khuẩn lạc đặc trưng có quầng trong phía ngoài, có tâm đen và quầng sáng Số khuẩn lạc không có quầng trong là 114

- Ở đĩa mẫu thứ hai của nhóm: có 1 khuẩn lạc đặc trưng có quầng trong, và 107 khuẩn lạc chỉ có tâm đen và quầng sáng

Mẫu đối chứng 2 mẫu của nhóm

Sau khi cấy 5 khuẩn lạc và 1 khuẩn lạc ở mẫu đối chứng vào môi trường TSA, có sự xuất hiện các đường ria của 6 khuẩn lạc đã chọn ở 6 phần trên đĩa môi trường TSA Sau khi, cấy 6 phần khuẩn lạc đã ria trên môi trường TSA, kết quả sau khi cấy 6 khuẩn

lạc qua môi trường huyết tương

Kết quả ủ sau 2 giờ trong môi trường huyết tương: các ống nghiệm mẫu và ống nghiệm đối chứng không có sự thay đổi màu, không có hiện tượng đông tụ

Kết quả ủ sau 4 giờ trong môi trường huyết tương: ống mẫu đối chứng có sự đông tụ nhẹ, dung dịch hơi đông lại; các ống mẫu của nhóm có 1 ít cặn lặn xuống đáy, hiện tượng giống mẫu đối chứng

Kết quả ủ sau 24 giờ trong môi trường huyết tương: ống mẫu đối chứng có sự đông tụ huyết tương; các ống mẫu của nhóm không có sự đông tụ, hiện tượng giống sau khi ủ 4 giờ

Xác định tỉ lệ dương tính R

R = 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 đô𝑛𝑔 𝑡ụ

𝑠ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 đã 𝑐ấ𝑦 = 0

Số S aureus (cfu/g)

S = 𝑁

𝑛𝑉𝑓 × R = 1+107+114

Số lượng của vi khuẩn Staphylococcus aureus trong 1g mẫu kiểm nghiệm nhỏ hơn 111

× 104 vi khuẩn

V Biện luận kết quả:

Kết quả nuôi cấy mẫu trong môi trường BPA, chỉ có 1 khuẩn lạc giống hình thái của khuẩn lạc đặc trưng, các khuẩn lạc còn lại không có quầng trong phía ngoài, chưa thể

xác định được có hay không có vi khuẩn S aureus trong mẫu kiểm nghiệm thông qua

hình thái khuẩn lạc

Tiếp tục nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSA, và thực hiện phản ứng đông tụ huyết tương Các mẫu không có sự đông tụ rõ rệt, sau 24 giờ các mẫu của nhóm vẫn không

có sự đông tụ

Định lượng xem có bao nhiêu vi khuẩn S aureus trong mẫu, do N<300 và R=0, nên sẽ thế R=1 vào công thức để tính

Số S aureus (cfu/g)

S = 𝑁

𝑛𝑉𝑓 × R = 1+107+114

2.0,1.10−3 × 1 = 111 × 104 (cfu/g)

Số lượng của vi khuẩn Staphylococcus aureus trong 1g mẫu kiểm nghiệm nhỏ hơn 111

× 104 vi khuẩn

VI Kết luận:

Kết quả định lượng vi khuẩn S aureus trong mẫu: Số lượng của vi khuẩn

Staphylococcus aureus trong 1g mẫu kiểm nghiệm nhỏ hơn 111 × 104 vi khuẩn

ĐỊNH TÍNH Salmonella

I Mục tiêu:

Để xác nhận xem có hay không có sự có mặt của Salmonella có trong 25g mẫu vật kiểm

nghiệm

II Nguyên tắc:

Salmonella là trực khuẩn gram âm (-), hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di động,

không tạo bào tử, lên men glucose và lactose, không sinh indol, không phân giải urea, không có khả năng tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh H2S

Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và bị tổn thương nên phải chọn

quy trình tăng sinh phù hợp:

1 Tăng sinh Salmonella trong môi trường tăng sinh để phát hiện Salmonella trong

các mẫu thực phẩm: BPW (Buffered Pepton Water): là một môi trường được sử

dụng cho tăng sự khôi phục các loài Salmonella bị tổn thương từ thực phẩm trước

khi chọn lọc và phân lập

2 Sau đó đưa vào môi trường chọn lọc RV (Rappaport Vassiliadis broth):

Thành phần môi trường RV gồm:

• Pepton lag thành phần dinh dưỡng

• NaCl: cân bằng áp suất thẩm thấu

• P bufer: cân bằng pH

• MgCl2.6H2O: tăng áp suất thẩm thấu để ức chế

• Malachite green: ức chế các vi khuẩn gram dương

3 Môi trường Brain Heart Infusion là môi trường rất giàu dinh dưỡng, cung cấp

các chất cần thiết cho sự tăng sinh của vi sinh vật, giúp Salmonella phục hồi sau

các quá trình tăng sinh chọn lọc trước đó để chuẩn bị cho các phản ứng sinh hóa tiếp theo

Nhằm xác nhận lại sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên

môi trường phân lập, thực hiện các phản ứng sinh hóa trong môi trường KIA, Urea broth, Mannitol phenol red broth, LDC, canh trypton Nguyên tắc của các phản ứng sinh hóa

Phản ứng trên môi trường KIA: Ở điều kiện hiếu khí,đặc tính của Salmonella là lên men

đường sinh acid làm pH môi trường giảm, màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng Ở

điều kiện kị khí, đặc tính của Salmonella là sinh H2S, kết hợp với Fe3+ có trong môi

trường gây tủa đen, nếu H2S sinh ra nhiều có thể gây vỡ thạch

Phản ứng trên môi trường Urea broth: Salmonella là không có enzyme urease phân giải

urea, pH của môi trường không đổi nên màu của môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng, không đổi màu

Phản ứng trên môi trường Mannitol Phenol Red broth Salmonella có thể lên men

mannitol sinh acid làm pH của môi trường giảm, do vậy màu của môi trường đổi từ đỏ sang vàng

Phản ứng trên môi trường Lysine Decarboxylase Broth Salmonella là có khả năng tạo

enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt các nhóm carbonyl ở Lysine tạo các sản phẩm làm tăng pH môi trường, môi trường chuyển thành màu vàng Sau khi dùng hết Lysine trong môi trường, màu môi trường chuyển lại thành tím

Phản ứng Indol của Salmonella không có phản ứng Indol nên khi cho thuốc thử Kovac

vào nên không có hiện tương

III Qui trình:

1 Cân 25g mẫu thịt vào 1 bao PE + 225g BPW Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu

Ủ ở 37°C qua đêm (mẫu canh khuẩn)

2 Mẫu đối chứng: Cấy 1ml dịch canh khuẩn Salmonella vào ống chứa 10ml BPW,

ủ 37°C qua đêm

3 Hút 0,1ml canh khuẩn và mẫu đối chứng sang ống môi trường RV, ủ 42°C qua đêm

Canh khuẩn Mẫu đối chứng

4 Cấy mẫu phân lập và đối chứng trong 2 ống nghiệm trên vào 2 đĩa môi trường XLD, ủ 37°C qua đêm