Môn học VI SINH THỰC PHẨM Báo cáo KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM MẪU KIỂM NGHIỆM NƯỚC ÉP RAU MÁ

TIEU LUAN MOI download :skknchat123@gmail.com GIỚI THIỆU CHUNG Vi sinh vật học thực phẩm là một môn khoa học nghiên cứu về những hoạt động sinh lý của vi sinh vật có ảnh hưởng đến chất l

Trang 1

TIEU LUAN MOI download :

skknchat123@gmail.com

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM

-

-Môn học

VI SINH THỰC PHẨM

Báo cáo KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM MẪU KIỂM NGHIỆM: NƯỚC ÉP RAU MÁ

GVHD: Lê Thị Phượng LinhNhóm sinh viên thực hiện: Nhóm V9.2Ngày thực hiện: 20/03/2022 -

23/03/2022

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 04 năm 2022

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

Trang 3

Trang 4

GIỚI THIỆU CHUNG

Vi sinh vật học thực phẩm là một môn khoa học nghiên cứu về những hoạt động sinh lý của vi sinh vật có ảnh hưởng đến chất lượng của lương thực thực phẩm, tìm hiểu các quy luật phát triển của vi sinh vật trên thực phẩm để có những biện pháp ngăn ngừa tác động tiêu cực và phát huy tác động tích cực của chúng trong quá trình bảo quản và chế biến thực phẩm Không phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều được các nhà vi sinh thực phẩm quan tâm ngang nhau.

Việc thực hành môn vi sinh thực phẩm giúp sinh viên vận dụng những lý thuyết đã được học để tiến hành phân tích, giải quyết những vấn đề liên quan đến vi sinh vật Từ đó, áp dụng thực tế của vi sinh vật trong chế biến, bảo quản và an toàn vệ sinh thực phẩm.

Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm nhằm hệ thống hóa kiến thức, trình bày cơ chế cùng thao tác thực nghiệm, đồng thời để sinh viên tham gia thảo luận về những vấn đề thường gặp trong thí nghiệm

vi sinh Bên cạnh đó, trình bày những mặt lợi và hại do vi sinh vật mang đến đối với thực phẩm.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

VKHK: Vi khuẩn hiếu khí

VSV: Vi sinh vật

PP: phương pháp

Trang 5

PHẦN 1 VI SINH VẬT CÓ HẠIBÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA Mẫu thực phẩm: Nước rau má không đá có đường

Trong phương pháp này, cần pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liêntiếp để có độ pha loãng và mật độ thich hợp cho việc đếm và tính toán Số lượng khuẩnlạc tối ưu được đề nghị là 25-300 khuẩn lạc/đĩa

Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môitrường và điều kiện ủ Kết quả đếm và mậ độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn

+ Điều kiện từ lúc mua đến lúc bảo quản: ở nhiệt độ phòng

+ Nhận xét về nơi mua mẫu:

- Đĩa petri: 6 - Đèn cồn+ bật lửa

- Ống nghiệm: 3 - Bút lông dầu

- Pipette và ống bơm - Ống đong

Trang 6

- Micropipette và đầu típ - Bao nilon bọc dụng cụ

3.3 Thiết bị

- Cân điện tử - Máy rung lắc ống nghiệm

- Bếp hồng ngoại - Máy hấp tiệt trùng

- Máy ủ

4 Cách tiến hành

4.1 Pha loãng mẫu

Lắc đều mẫu trước khi pha loãng, sau đó dùng pipette đã tiệt trùng hút 10ml dungdịch mẫu vào bình đựng 90ml NaCL Tiến hành đồng nhất mẫu: Cầm cổ bình rồi lắctheo chiều kim đồng hồ 25 vòng và ngược chiều kim đồng hồ 25 vòng Lúc này, hệ sốpha loãng mẫu là 10-1

Tiếp tục tiến hành pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 1ml dung dịch từmẫu pha loãng trước đó qua ống nghiệm chứa 9ml NaCl, đem đi đồng nhất mẫu bằngmáy rung lắc ống nghiệm: bật công tắc cho máy, ống nghiệm cầm trong lòng bàn tay,ngón cái giữ ngay nắp ống nghiệm và ấn xuống máy 3 lần, mỗi lần khoảng từ 1-3 giây

Ta có hệ số pha loãng mẫu là 10-2, tương tự ta có 10-3và 10-4 cho 2 ống nghiệm đựngNaCl còn lại (tổng 3 ống nghiệm đựng 9ml NaCl đã chuẩn bị trước)

Hình 1: Dung dịch mẫu và hệ số pha loãng

Trang 7

4.2 Tiến hành nuôi cấy VSV bằng phương pháp đổ đĩa

Sau khi pha loãng, chọn 1 bộ 3 hệ số pha loãng liên tiếp (cụ thể nhóm chọn là 10

-1, 10-2, 10-3) để tiến hành đổ đĩa Mỗi nồng độ pha loãng sẽ đổ tương ứng 2 đĩa petri(tổng 6 đĩa cho 3 nồng độ) Phương pháp đổ đĩa: dùng micropipette hút 1ml dung dịch từống nghiệm chứa nồng độ pha loãng đã chọn qua đĩa petri, sau đó đổ khoảng từ 15-20mlmôi trường PCA vào đĩa petri (sau cho dàn đều mặt đáy đĩa) Lập lại tương tự với cácđĩa còn lại

Đem tất cả đĩa petri đã đổ bọc vào bịch nilon và đem ủ ở máy ủ với nhiệt độ là

37oC±1oC trong thời gian khoảng 19h40 phút Sau đó mang ra để tiến hành đếm và tínhtoán định lượng số lượng VKHK có trong mẫu thí nghiệm

4.3 Lưu ý khi thực hiện thí nghiệm

Rửa tay khử khuẩn trước khi tiến hành thí nghiệm

Mọi công việc trong mục 4.1 và 4.2 đều được thực hiện kế bên ngọn lửa đèn cồn

Trang 8

- Môi trường kết quả không bị biến đổi màu sắc

Khuẩn lạc mọc nhiều ở khắp bề mặt bên trên, dưới và bên trong của thạch, độ to nhỏkhông đồng đều cho thấy có rất nhiều loại VKHK tồn tại trong mẫu

Cả 6 đĩa đều có số lượng khuẩn lạc rất nhiều (lớn hơn 300) nên không thể đếm đượcchính xác số lượng VKHK có trong mẫu

- Khi tiến hành pha loãng mẫu:

+ Pha loãng ít nhất 3 nồng độ liên tiếp

+ Các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu và đồng nhất mẫu

+ Nồng độ pha loãng mẫu phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh thực phẩm, thời gian

Trang 9

bảo quản, kinh nghiệm người thực hiện…

+ Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn

+ Các ống nghiệm phải được vô trùng và sử dụng micropipet 1000ul để tránh hiệntượng sai số

Trang 10

- Khi tiến hành nuôi cấy dịch mẫu

+ Phải cho vi sinh vật vào đĩa petri trước, sau đó mới đổ môi trường vào các đĩa đãchứa 1ml dịch mẫu

+ Lắc đều môi trường trước khi đổ vào đĩa petri để tránh môi trường bị đông đặc.+ Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng và để nguội ở 44 - 47oC

+ Xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái phải để trộn đều dịch mẫu và môi trường.+ Khi môi trường đông đặc lại, lật ngược đĩa và đem ủ vào tủ ấm

+ Ghi thông tin ở phần đáy đĩa petri bao gồm: tên môi trường, nồng độ pha loãng,ngày thực hiện, tên nhóm

❖ Những hư hỏng trong quá trình thí nghiệm

- Nồng độ pha loãng chưa đúng: hút không đúng thể tích yêu cầu và chưa đồngnhất mẫu, thao tác thí nghiệm sai dẫn đến sai số đáng kể

- Môi trường nuôi cấy dịch mẫu không đông đặc Nguyên nhân bao gồm: thờigian chưa đủ, môi trường cũ, lượng môi trường chưa đủ, lắc môi trường chưa đều

- Số khuẩn lạc không nằm trong khoảng 30 ≤ A ≤ 300 Nguyên nhân là: thờigian nuôi cấy chưa đủ, nồng độ pha loãng chưa đồng nhất dẫn đến việc lấy 1ml dịchmẫu chứa ít vi sinh vật, thao tác thí nghiệm sai

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORM VÀ COLIFORM CHỊU NHIỆT

BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG (MPN) Mẫu thực phẩm: Nước rau má không đá có đường.

1 Mục đích

Xác định tổng số vi khuẩn Coliform có trong nước rau má

2 Thiết bị, dụng cụ

Trang 11

- Môi trường LSB (Lauryl Sulphate Broth): Môi trường vi sinh được dùng trong

việc xác định vi khuẩn Coliform

+ Mono potassium phosphate 2.75

+ Sodium lauryl sulphate 0.1

Pha môi trường:

+ Hòa tan 9,61g trong 270ml nước

+ Đun sôi và khuấy nhẹ đến khi tan hoàn toàn

+ Đổ 5ml môi trường đã được hòa tan vào các ống nghiệm thủy tinh có nắp chứacác ống Durham (úp ngược)

+Tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng (15 PSI – 121°C trong 30 phút) Sau đó làm lạnhđến 45 – 50°C trước khi dùng

- Ghi thông tin lên mỗi ống môi trường

- Kiểm tra bọt khí trong ống Durham trước khi cho mẫu vào

- Cho vào mỗi ống môi trường LSB 1 ml dung dịch mẫu: 3 ống 10-1, 3 ống 10-2, 3ống 10-3

- Không lắc hoặc đồng nhất

- Ủ ở nhiệt độ 37°C, thời gian 19 giờ 40 phút

- Chuẩn bị 9 ống môi trường BGBB và 9 ống môi trường EC (tất cả đều chứa ốngDurham)

Trang 12

- Môi trường BGBB (Brilliant Green Bile Broth): Thường dùng để phát hiện và

định lượng vi khuẩn Coliform trong nước và thực phẩm

Pha môi trường:

+ Hòa tan hoàn toàn 10,80g với độ chính xác hai số lẻ trong 270ml nước

+ Đun sôi và khuấy đến khi tan hoàn toàn

+ Sau đó tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng tại 15 PSI – 121°C trong vòng 30 phút.+ Đổ vào các ống nghiệm có chứa ống Durham đảo ngược

- Môi trường EC: Sử dụng để phát hiện Coliform trong quá trình kiểm tra vi

khuẩn của nước, sữa và thực phẩm

Thành phần:

+ Tryptone 20g

+ Lactose 5g

+ Bile salts mixture 1,5g

+ Dipotassium hydrogen phosphate 4g

+ Potassium dihydrogen phosphate 1,5g

+ Sodium chloride 5g

+ Độ pH (ở 25°C) 6,9 ± 0,2

Pha môi trường:

+ Cân 9,99g môi trường khử nước và hòa tan trong 270ml nước

+ Để yên trong 5 phút

+ Sau đó đun sôi, khuấy đến khi tan hoàn toàn

+ Đổ vào các ống nghiệm có ống Durham bên trong, tiệt trùng trong nồi hấp ở121°C trong 30 phút

4 Quy trình thực hiện thí nghiệm

Trang 13

Trang 14

Trang 15

Trang 16

⇨ Tổng số Coliform chịu nhiệt > 10n-1x 1100

Với n = 1 => Tổng số Coliform chịu nhiệt > 1,1 x 103 (MPN/ml)

- Môi trường LT: sử dụng để phát hiện vi khuẩn Coliform trong nước và các loạithực phẩm khác, … thúc đẩy sự sinh trưởng và giải phóng khí vi sinh vật

Trang 17

- BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA

- Dụng cụ

- Tiến hành nuôi cấy VSV bằng phương pháp đổ đĩa

- Lưu ý khi thực hiện thí nghiệm

- Những điểm cần lưu ý

- Những hư hỏng trong quá trình thí nghiệm

- BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORM VÀ COLIFORM CHỊU NHIỆT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG (MPN)

- Bước 1: Tiền tăng sinh

- Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

- Bước 3: Quan sát và phân lập

- Bước 4: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc

- Bước 5 và 6: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường thạch NA và khẳng định bằng KIT định danh

- Giai đoạn đầu: Yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển

- Giai đoạn 2: Đường được phân hủy bởi acid lactic

Trang 18

- Giai đoạn 3: Men chua phát triển

- Những tác dụng tốt đối với sức khỏe của thực phẩm lên men

Trang 19

Bản chất của E coli là một nhóm coliform chịu nhiệt, vì vậy ở bài thực hành định tính E.coli này, chúng ta sẽ tận dụng các ống nghiệm chứa coliform chịu nhiệt trong các

ống môi trường EC dương tính ở Bài 2- Định lượng tổng số coliform

Bên trong các ống EC dương tính của Bài 2, ngoại trừ E.coli cần định tính ra thì còn có nhiều nhóm coliform chịu nhiệt khác Để xác định việc có hay không E.coi tồn

tại trong mẫu thực phẩm, cần tiến hành phương pháp cấy phân lập vi khuẩn E.coli trênmôi trường EMB

Nếu xác định bên trong mẫu thực phẩm có tồn tại E.coli sẽ chuyển sang tiến hành

định danh VSV bằng KIT

Vì thời gian ủ để tăng sinh là từ khoảng 24-48h, nhưng định danh bằng KITNKIDS

14 GNR thì thời gian ủ để có thể định danh chỉ trong khoảng 16-24h, điều này mẫuthuẫn với thời gian ủ tăng sinh bên trên nên sẽ không thể xác định được danh tính của

E.coli trong mẫu thí nghiệm theo cách này Thay vào đó, người ta sẽ dùng độ đục để xác

định nồng độ VSV có trong mẫu để tiến hành định danh

3 Nguyên liệu- dụng cụ- thiết bị

3.1 Nguyên liệu

- Mẫu thí nghiệm: 3 ống nghiệm chứa coliform chịu nhiệt trong các ống môitrường EC dương tính lấy từ Bài 2 (cụ thể có 1 ống nồng độ 10-1, 1 ống 10-2, 1 ống 10-3)

- Môi trường và hóa chất (đã được chuẩn bị và tiệt trùng sẵn):

+ EMB: 3 đĩa môi trường thạch EMB (chứa khaonrg 20ml EMB bên tỏng mỗi đĩa)

+ PCA: ống thạch nghiêng PCA để nuôi cấy vi khuẩn (đã được chuẩn bị vfa nuôi cấy từtrước- sử dụng để làm phần định danh vi khuẩn)

3.2 Dụng cụ

- Đĩa petri - Đèn cồn và bật lửa

- Ống nghiệm - Micropipette và đầu típ

- Que cấy vòng và que cấy thẳng -Bịch nilon bọc dụng cụ

- Bút lông dầu

3.3 Thiết bị

- Tủ ủ

4.1 Cấy phân lập trên môi trường EMB

Dùng que cấy vòng nhúng vào ống EC dương tính và tiến hành cấy phân lập vàomôi trường EMB theo phương pháp đã học:

Trang 20

Rửa tay khử khuẩn trước khi tiến hành thí nghiệm

Mọi công việc đều được thực hiện kế bên ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm chéo.Ghi chú lại trên đĩa bằng bút lông dầu để tránh tình trạng nhầm lẫn

Mọi vật dụng sau khi sử dụng xong cần được đem đi khử trùng, tuyệt đối khôngrửa bằng nước thường

5 Kết quả

Hình 3: Đĩa môi trường EMB

Trang 21

❖ Cách nhận diện có thể có E coli trên EMB:

- Mặt trên đĩa: Khuẩn lạc tròn bóng, lồi và có ánh xanh kim loại

- Mặt dưới đĩa: Khuẩn lạc màu tím, đường kính khoảng 2-3mm, có tâm đenchiếm khoảng ¾ đường kính

- Môi trường cấy bình thường không có sự biến đổi

Dựa trên các đặc điểm nhận biết, có thể kết luận: Nghi ngờ có E coli trong mẫu thực

phẩm rau má có đường không đá ướp lạnh

6 Giải thích:

Eosin methylene blue (EMB) là một chất nhuộm màu chọn lọc cho vi khuẩn gram

âm EMB chứa thuốc nhuộm độc hại đối với vi khuẩn gram dương EMB là môi trườngchọn lọc và vi phân chocoliforms.Nó là sự pha trộn của hai chất nhuộm màu, eosin

vàxanh methylen theo tỷ lệ 6:1 Một ứng dụng phổ biến của chất nhuộm màu này làtrong việc tạo ra môi trường thạch EMB, một môi trường vi sinh khác biệt, ức chế mộtchút sự phát triểncủa vi khuẩn gram dươngvà cung cấp một chỉ thị màu phân biệt giữacác sinh vật lên men lactose(ví dụ E coli) Các sinh vật lên men lactosesẽ thể hiện làmột loại "khuẩn lạc có nhân" có màu đen với các phần trung tâm tối

Lên men nhanh chóng tạo ra axit, làm giảm độ pH Điều này khuyến khích sựhấp thụ chất nhuộm của các khuẩn lạc, hiện có màu tím đen

Trên EMB,nếu E coli được nuôi cấy, nó sẽ tạo ra ánh sáng màu xanh kim loại

đặc biệt (do tính chất chuyển hóa của chất nhuộm, chuyển động của E coli sử dụng

Flagella và các sản phẩm cuối của axit mạnh lên men)

BÀI 4 KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Mẫu thực phẩm: nước rau má không đá có đường

Trang 22

Pha môi trường: Cân chính xác 3,375g PW và cho vào bình đựng với 225ml nước tinhkhiết, khuấy đều

Bước 1: Tiền tăng sinh

Bao gói dụng cụ và bình đựng môi trường vừa pha, đem đi hấp tiệt trùng trong nồi hấptiệt trùng ở 121ºC trong 30 phút

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Hút 25ml mẫu vào trong bình đựng PW đã được tiệt trùng, đóng nắp và lắc đều Ủ ở37ºC trong 19 giờ

Bước 3: Quan sát và phân lập

Cho vào 2 ống nghiệm chứa 5ml RV mỗi ống 0,1 ml hỗn hợp mẫu + PW Gắn nút vàđem ủ ở 42ºC trong 29 giờ 20 phút

Bước 4: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Dùng que cấy vòng cấy phân lập dung dịch vừa ủ lên đĩa môi trường XLD Đem đi ủ ở37ºC trong 16 giờ Quan sát lạc khuẩn

Bước 5 và 6: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường thạch NA và khẳng định bằng KIT định danh

- Bước 5 không thực hiện, đã được chuẩn bị sẵn ống nghiệm chứa Salmonella

Trang 23

Phân

lập

XLD - Mặt trên đĩa:

khuẩn lạctròn, lồi

- Mặt dưới đĩa:

khuẩn lạcmàu hồng,tâm đen hoặckhông có(thực tế nhómchưa phân lậpđược)

- Môi trườngxung quanh bịbiến đổi thànhmàu

hồng

Nghi ngờcó

Salmonell

a trong

mẫu raumá

❖ Giải thích kết quả:

- Đầu tiên, cân mẫu và đem đi đồng nhất mẫu với BPW vì đây là môi trườngtăng sinh không chọn lọc Trong BPW có pepton là nguồn nitơ, cacbon, vitamin vàkhoáng vật,… Giúp cho vi sinh vật tăng trưởng trở lại một cách mạnh mẽ cũng nhưphục hồi các tế bào bị tổn thương trong quá trình bảo quản

- Chuyển khóm khuẩn vào môi trường RV (Rapparport Vasiliadis broth) Đây

là môi trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế các vi sinh vật khác, chọn lọc

Salmonella Nhưng vì đây là môi trường chọn lọc cực mạnh nên nếu chúng ta không

Trang 24

có giai đoạn tiền tăng sinh để chúng khỏe mạnh thì có thể ngay cả Salmonella cũng

bị ức chế (các tế bào Salmonella yếu, bị tổn thương…) Trong môi trường RV có

Malachite green oxalate (chất ức chế mạnh) giúp ức chế các vi sinh khác không phải

Tiêu đề	Kiểm Nghiệm Vi Sinh Trong Thực Phẩm Mẫu Kiểm Nghiệm: Nước Ép Rau Má
Tác giả	Nhóm V9.2
Người hướng dẫn	GVHD: Lê Thị Phượng Linh
Trường học	Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Vi Sinh Thực Phẩm
Thể loại	báo cáo
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	37
Dung lượng	1,4 MB

Tài liệu tham khảo	Loại	Chi tiết
25. Các lưu ý khi thực hành	Khác
26. BÀI 4. KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH SALMONELLA	Khác
27. Dụng cụ và hóa chất	Khác
28. Cách tiến hành	Khác
29. Bước 1: Tiền tăng sinh	Khác
30. Bước 2: Tăng sinh chọn lọc	Khác
31. Bước 3: Quan sát và phân lập	Khác
32. Bước 4: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc	Khác
35. PHẦN 2. VI SINH VẬT CÓ LỢI	Khác
36. BÀI 5: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÓ LỢI TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN	Khác
37. Nguyên liệu	Khác
41. Giai đoạn đầu: Yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển	Khác
42. Giai đoạn 2: Đường được phân hủy bởi acid lactic	Khác
43. Giai đoạn 3: Men chua phát triển	Khác
44. Những tác dụng tốt đối với sức khỏe của thực phẩm lên men	Khác
45. PHẦN 3. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT	Khác
46. BÀI 6: IDS 14GNR – HỆ THỐNG ĐỊNH DANH TRỰC KHUẨN GRAM (-), DỄ MỌC	Khác
48. Hóa chất và dụng cụ	Khác
49. Quy trình thực hiện:50. Kết quả51. 5.52. 5	Khác
53. Tài liệu tham khảo54.55	Khác