Kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS I. Giới thiệu chung: Coliforms là một loại vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37oC trong 24–48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_ _

BÁO CÁO THỰC TẬP

KIỂM NGHIỆM VI SINH

Mục lục

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS 3

I Giới thiệu chung: 3

II Quy trình: 3

III Kết quả: 4

IV Kết luận: 4

V Biện luận: 4

ĐỊNH TÍNH E coli GIẢ ĐỊNH 5

I Giới thiệu chung: 5

II Quy trình: 5

III Kết quả: 6

IV Kết luận: 6

V Biện luận: 6

ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus 8

I Giới thiệu chung: 8

II Quy trình: 8

III Kết quả: 9

IV Kết luận: 10

V Biện luận: 10

ĐỊNH TÍNH Salmonella 11

I Giới thiệu chung: 11

II Quy trình: 11

III Kết quả: 13

IV Kết luận: 13

V Biện luận: 13

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS

I Giới thiệu chung:

Coliforms là một loại vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý,

không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37oC trong

24–48 giờ Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lượng của chúng hiện

diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm

II Quy trình:

Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn:

Quy trình làm của nhóm: Không có bước cấy 5 khuẩn lạc sang môi trường BGBL trở

về sau (vì không xuất hiện khuẩn lạc ở cả 4 đĩa)

III Kết quả:

Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N (CFU)

Vì không có khuẩn lạc nên không thực hiện bước xác nhận sinh hơi ở môi trường BGBL và tính theo công thức:

C ≤ nVf N x R

N: là số khuẩn lạc (quy ước N=1) R: là hệ số tỉ lệ xác nhận sinh hơi trong ống BGBL (quy ước R=1) n: là số đĩa

V: là thể tích mẫu cấy vào đĩa f: độ pha loãng

 C ≤ 1 *1 = 455 (CFU/g)

2*1*10-3 + 2*1*10-4

3

10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất

mẫu dung dịch 10-1

Pha loãng mẫu thành 10-3 và 10-4

Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-3 và 10-4 vào đĩa

petri, cấy 2 đĩa/ nồng độ

Đỗ vào 10-15 ml VRB đã đun tan và làm nguội đến 45oC chờ đông đặc đổ thêm khoảng 5 ml

lên bề mặt chờ đông đặc

Lật ngược và ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đen đến đỏ

đậm, có quầng tủa muối mật

v

Chọn 5 khuẩn lạc đã đếm cấy sang môi trường BGBL

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

IV Kết luận:

- Coliforms tổng số / g trong mẫu thịt tươi là nhỏ hơn hoặc bằng 455 CFU/g

- Kết luận: Coliforms tổng số trong 1(g) mẫu nằm trong khoảng cho phép theo

TCVN 10-2 CFU

V Biện luận:

- Môi trường VRB là môi trường tăng sinh chọn lọc Coliforms Trong quá trình pha

môi trường thì không được hấp vô trùng mà cần phải cân vô trùng

- Khuẩn lạc ở môi trường VRB có màu đỏ đậm và quầng tủa muối mật xung quanh

Màu đỏ đậm của khẩn lạc là do Coliforms lên men lactose tạo acid nên làm cho chất

chỉ thị màu Nutral Red chuyển sang màu đỏ Còn quầng tủa là sự kết tủa của muối mật

do bị acid hóa

- Môi trường BGBL: Muối mật để ức chế vi khuẩn Gram (+), brilliant green dùng

để chọn lọc vi khuẩn Gram (-), hình que (Coliforms).

- Dùng môi trường BGBL để xác nhận lại khả năng sử dung lactose và sinh hơi của Coliforms, từ đó khẳng định về sự xuất hiện của Coliforms trong mẫu.

ĐỊNH TÍNH E coli GIẢ ĐỊNH

I Giới thiệu chung:

Faecal Coliforms (hay E coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh

Indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton E coli giả định là một

thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm trong mẫu môi trường

II Quy trình:

Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn:

4

10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất

mẫu dung dịch 10-1

Cấy 1g (~10ml của 10-1) mẫu vào ống 10ml môi

Quy trình làm của nhóm: Thực hiện các bước như trên

III Kết quả:

- Môi trường LSB và EC broth đều sinh hơi

- Phản ứng thử Indol dương tính (xuất hiện vòng màu đỏ trên mặt dung dịch)

IV Kết luận:

Phát hiện E coli giả định trong 1g mẫu

V Biện luận:

- Vì đặc điểm của E coli giả định là Colilform, có khả năng chịu nhiệt và sinh Indol

nên ta thực hiện theo quy trình trên với các môi trường:

 Môi trường LSB dùng để xác định Coliforms (vi khuẩn Gram (-) và sử dụng

lactose) Trong môi trường LSB có Lauryl Sulfate dùng để ức chế vi sinh vật

không phải là Coliforms với điều kiện là pH ổn định, ngoài ra trong môi trường còn có lactose để xác nhận khả năng sinh hơi của Coliforms.

 Môi trường EC broth dùng để chọn lọc ra E coli giả định có khả năng chịu

nhiệt ở 44oC

 Canh trypton dùng để xác nhận E coli có tryptophanase (tryptophanase phân

hủy tryptophan có trong canh trypton) => dùng thuốc thử Kovac’s để nhận biết Cơ chất chính tham gia phát hiện Indol trong môi trường nuôi cấy là p-dimethyaminobanaldehyde Chất này phản ứng với Indol tạo thành phức hợp màu đỏ

- Trong quá trình thực tập nhận thấy ở định lượng Coliforms không có khuẩn lạc mọc nhưng định tính E coli giả định thì thấy có xuất hiện bởi vì những lí do sau:

 Nồng độ cấy để định lượng Coliform ít hơn rất nhiều so với E coli giả định

1 ml mẫu ở nồng độ 10-3 và 10-4 10 ml mẫu ở nồng độ 10-1

 Do mẫu là thịt ở Satra foods nên sẽ được bảo quản ở nhiệt độ lạnh  vi sinh vật sinh trưởng yếu và sau đó cấy thẳng vào môi trường tăng sinh chọn lọc VRB mà không tăng sinh phục hồi  vi sinh vật chết

 Do trong quá trình thao tác sai  ảnh hưởng tới kết quả

5

Cấy 1g (~10ml của 10-1) mẫu vào ống 10ml môi trường Luarylsulphate broth nồng độ đôi (LSB đôi)

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

Quan sát thấy có sinh hơi dùng que cấy vòng cấy sang ống chứa 10ml môi trường EC broth

Ủ ở 44 ± 0.5oC trong 24 giờ

Quan sát thấy có sinh hơi dùng que cấy vòng cấy sang ống chứa 5ml canh trypton

Ủ ở 44 ± 0.5oC trong 24 giờ

Thử phản ứng indol bằng thuốc thử Kovac và

quan sát kết quả

ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus

I Giới thiệu chung:

Staphylococcus aureus (S aureus) hay còn gọi là tụ cầu vàng, vi khuẩn gây ngộ

độc từ nhà bếp S aureus và vi khuẩn thuộc họ Micrococaceae, Gram (+), hình cầu,

cạnh tranh yếu với các vi sinh vật khác

Trong tự nhiên S aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng S aureus là vi sinh vật có khả năng sản sinh một số loại

độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút và tồn tại lâu trong thực phẩm Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4–6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mữa và các triệu chứng này kéo dài từ 6 – 8 giờ Những thực phẩm dễ bị nhiễm tụ cầu vàng nhất bao gồm trứng, thịt gia súc, gia cầm, salad (gồm trứng, cá ngừ, thịt gà, khoai tây, mỳ ống), các loại bánh nướng có kem và các sản phẩm từ sữa

II Quy trình:

Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn:

Quy trình làm của nhóm: Thực hiện các bước như trên

III Kết quả:

Độ pha loãng f Số khuẩn lạc N (CFU)

6

10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất mẫu dung dịch 10-1 pha loãng thành 10-2, 10-3

Trải 0.1 ml dung dịch mẫu pha loãng ở 10-3 lên đĩa Baird Parker Agar (2 đĩa)

10 -3 6 và >300 Sau 4 giờ thấy cả 5 ống đều đông tụ huyết tương

 Tỷ lệ xác nhận: R = Số khuẩn lạc đông tụ huyết tương/ Số khuẩn lạc cấy = 5/5 =1

C = nVf N x R

N: là số khuẩn lạc (vì N >300 nên ta lấy N=300) R: là hệ số tỉ lệ xác nhận sinh hơi trong ống BGBL (R=1) n: là số đĩa (n=2)

V: là thể tích mẫu cấy vào đĩa (V=0.1) f: độ pha loãng (f=10 -3 )

 C = 2*0.1*10300 -3 *1 = 15*105 (CFU/g)

IV Kết luận:

Có 15*105 CFU S.aureus trong 1 gam mẫu

V Biện luận:

- Trong môi trường BPA có lithium chloride là thành phần chọn lọc ra S aureus, trong khi đó glycine và pyruvate là thành phần cần thiết cho sự phát triển của S.

aureus Khuẩn lạc S aureus có đặc điểm là tròn, lồi, đen, có 2 quầng nằm trên vùng

môi trường xung quanh (quầng trong đục, quầng ngoài trong):

 Màu đen S aureus tiết enzyme coagulase khử tellurite trong dịch trứng thành

tellurium (có màu đen)

 Quầng đục là do S aureus tiết ra enzyme lipase phân giải lipid  tụ xung

quanh khuẩn lạc

 Quầng trong là do S aureus tiết enzyme lecithinate khử lecithin.

- Môi trường TSA dùng để phục hồi S aureus sau khi nuôi trong môi trường chọn

lọc BPA

- Phản ứng đông tụ huyết tương là do tính chất của enzyme coagulase có ở S.

aureus Khi có sự hiện diện của enzyme này thì các cấu tử trong huyết tương kết hợp

thành từng khối hay từng cục

7

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi , màu đen

và có 2 quầng (quầng trong đục, quầng ngoài

trong) (N)

Dùng que cấy nhọn chuyển 5 khuẩn lạc đã đếm

sang đĩa TSA được chia làm 6

Ủ ở 37 ± 0.5oC qua đêm

Dùng que cấy vòng cấy chuyển vào ống chứa

0.3 ml huyết tương

Ủ ở 37 ± 0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ

Nếu không có biểu hiện ngưng kết thì ủ tiếp

đến 24 giờ

ĐỊNH TÍNH Salmonella

I Giới thiệu chung:

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi

khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động

bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột Hầu hết các loài Salmonella có thể

sinh H2S Salmonella không lên men lactose (trừ Salmonella arizona)

và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glucose

Salmonella là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng đầu trong số các vụ

ngộ độc do vi sinh vật Số lượng Samonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện diện

cả triệu tế bào trong một gam thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra

thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng biểu hiện thường sau 12–36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Triệu chứng

kéo dài ít nhất 2-7 ngày Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella như thịt

gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các loại sản phẩm của trứng, thủy sản

II Quy trình:

Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn:

8

25g mẫu + 225g PBW đồng nhất mẫu

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

Chuyển 0.1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml Rapparport Vasiliadis broth (RV)

Ủ ở 42 ± 0.5oC trong 24 giờ Cấy phân lập sang môi trường XLD bằng

Quy trình làm của nhóm: làm tới bước phân lập trên XLD (vì không có khuẩn lạc

nên không thể thử nghiệm sinh hóa)

III Kết quả:

 Cấy trên môi trường tăng sinh chọn lọc RV:

- Đối chứng: Ống nghiệm đục

- Mẫu: Ống nghiệm đục

 Phân lập trên môi trường XLD:

- Đối chứng: Có khuẩn lạc đặc trưng

- Mẫu: Không có khuẩn lạc đặc trưng

 Thử nghiệm sinh hóa: Vì không có khuẩn lạc đặc trưng trên XLD nên ta không thể tiến hành thử nghiệm sinh hóa

IV Kết luận:

Không có Salmonella trong 25g mẫu thịt lợn

V Biện luận:

- Môi trường tăng sinh chọn lọc RV có malachite green oxalat là chất chọn lọc

dùng để ức chế các vi sinh vật khác ngoài Salmonella với điều kiện áp suất thẩm thấu

cao, đúng pH và đúng nhiệt độ (42oC)

- Môi trường XLD dùng để phân lập Salmonella với đặc điểm nhận diện khuẩn lạc

trong suốt, có hoặc không có tâm đen

- Sở dĩ môi trường RV màu đục nhưng khi cấy trên môi trường XLD lại không có

khuẩn lạc là vì trong quá trình thao tác sai  kết quả bị sai hoặc số lượng Salmonella

trong RV quá ít  không xuất hiện khuẩn lạc

- Thử nghiệm sinh hóa nhằm khẳng định chính xác có Salmonella, trong đó:

 Ở thạch nghiêng KIA, đặc điểm là trên mặt thạch là màu đỏ, dưới màu vàng

Sở dĩ có hiện tượng trên là do trong môi trường KIA chỉ có 0.1% glucose, 1%

lactose và pepton Đầu tiên Salmonella lên men glucose trước tạo acid  làm màu chất chỉ thị Phenol red chuyển thành màu vàng (Salmonella không sử dụng được lactose), khi hết glucose thì Salmonella chuyển sang dùng pepton

9

Cấy phân lập sang môi trường XLD bằng

phương pháp ria

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng: trong suốt có hay không có tâm đen, cấy sang ống chứa 5ml BHI

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 3 giờ Thử nghiệm sinh hóa

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ và quan sát

Canh trypton

Dùng que cấy thẳng cấy mẫu vào KIA

Manitol Phenol Red broth

Urea Broth

Lysine Decarbo -xylase Broth (LDC) (+)

trong điều kiện hiếu khí  tạo môi trường base trên mặt thạch  chất chỉ thị chuyển thành màu đỏ, đỏ đậm

 Thử nghiệm manitol (dương tính): Vi khuẩn Salmonella có khả năng lên men

đường manitol sinh acid  làm cho chất chỉ thị Phenol red chuyển từ màu đỏ sang vàng

 Thử nghiệm urea (âm tính): Khi có cơ chất urea trong môi trường, enzyme urease được vi sinh vật tiết ra để phân giải urea tạo NH3  làm cho môi trường

hóa kiềm chuyển sang màu đỏ Vì Salmonella không có enzyme này nên không

thể phân giải urea do đó môi trường vẫn giữ nguyên màu

 Thử nghiệm lysin (dương tính): Trong môi trường LDC có glucose và lysin

nên khi có Salmonella thì vi sinh vật này ưu tiên sử dụng glucose trước tạo môi

trường acid chuyển từ màu tím sang màu vàng, sau đó khi hết glucose,

Salmonella chuyển sang sử dụng lysin bằng cách tiết ra enzyme decarboxylase

 loại bỏ nhóm carboxyl  môi trường trở nên kìm chuyển từ vàng sang tím

(dương tính) Còn khi không có Salmonella thì những vi sinh vật khác chỉ sử

dụng glucose nên làm môi trường chuyển sang màu vàng (âm tính)

 Thử nghiệm Indol (âm tính): Canh trypton dùng để xác nhận có tryptophanase (tryptophanase phân hủy tryptophan có trong canh trypton) => dùng thuốc thử Kovac’s để nhận biết Cơ chất chính tham gia phát hiện Indol trong môi trường nuôi cấy là p-dimethyaminobanaldehyde Chất này phản ứng với Indol tạo

thành phức hợp màu đỏ Vì Salmonella không có enzyme tryptophanase nên sẽ

âm tính với thuốc thử Kovac’s