Knvs Word_Nhóm1.Pdf

TP Thủ Đức, ngày 13 tháng 05 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học CÔNG N[.]

TP Thủ Đức, ngày 13 tháng 05 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn: KIỂM NGHIỆM VI SINH

Mã môn học: 211220 Nhóm thực hiện: Nhóm 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện MSSV

ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN

HOÀNG

ThS LÊ PHƯỚC THỌ

i

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập môn Thực hành Kiểm nghiệm vi sinh, nhóm em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của thầy cô, bạn bè Nhóm

em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trương Phước Thiên Hoàng, ThS Lê Phước Thọ và anh Võ Trần Quốc Thắng, Khoa khoa học sinh học – trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt quá trình học và làm báo cáo

Nhóm em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến các giảng viên trường Đại học Nông Lâm TP.HCM nói chung, các giảng viên khoa Khoa học sinh học nói riêng đã truyền đạt cho chúng em kiến thức về các môn đại cương, giúp chúng em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình học tập

Đại học Nông Lâm TP.HCM, tháng 5 năm 2023

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1

1.1 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1 Kết quả định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1.1 Kết quả 1

1.1.1.2 Biện luận và tính toán kết quả 2

1.1.2 Kết quả định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3

1.1.2.1 Kết quả 3

1.1.2.2 Biện luận và tính toán kết quả 3

1.2 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN 4

1.2.1 Kết quả định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN 4

1.2.1.1 Kết quả 4

1.2.1.2 Biện luận và tính toán kết quả 4

1.2.2 Kết quả định lượng E coli bằng phương pháp MPN 5

BÀI 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 7

2.1 Kết quả định tính Salmonella 7

2.2 Giải thích kết quả 8

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 9

3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 8

3.1.1 Kết quả định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bún tươi 8

3.1.2 Kết quả định lượng tổng số nấm men – nấm mốc trong mẫu bún tươi 8

3.1.3 Tính toán kết quả và biện luận 9

3.2 Định lượng tổng nấm men, nấm mốc 9

3.2.1 Kết quả định lượng tổng nấm men, nấm mốc 9

3.2.2 Tính toán kết quả và biện luận 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BGBL: Brilliant Green Bile broth Lactose

BPW: Buffered Pepton Water

CFU: Colony Forming Unit

DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

E coli: Escherichia coli

EC: E coli medium

EMB: Eosin Methylene Blue Agar

HE: Hektoen Entric Agar

KIA: Kligler Iron Agar

LSB: Lauryl Sulphate Water

MPN: Most probable number

PCA: Plate agar

RV: Rappaport Vassiliadis

TBX: Tryptone Bile X – glucuronide

VP: Voges – Proskauer

VRBL: Violet Red Bile Lactose

XLD: Xylose Lysine Desoxycholate

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-1 1

Hình 1.2 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-2 1

Hình 1.3 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-3 2

Hình 1.4 Đĩa thạch môi trường TBX nồng độ 10-1 3

Hình 1.5 Đĩa thạch môi trường TBX nồng độ 10-2 3

Hình 1.6 Đôi chứng với các ống LSB theo từng nồng độ 4

Hình 1.7 Kết quả các ống dương tính trong môi trường BGBL .4

Hình 1.8 Kết quả các ống dương tính trong môi trường EC 5

Hình 1.9 Đĩa thạch EMB sau khi cấy từ ống canh EC 5

Hình 1.10 Kết quả phản ứng sinh hóa 6

Hình 2.1 Mẫu tôm khô sau khi tăng sinh trong môi trường tăng sinh 7

Hình 2.2 Đĩa cấy mẫu trên môi trường chọn lọc trong HE… 7

Hình 2.3 Kết quả thử nghiệm sinh hoá với các khuẩn lạc đặc trưng 8

Hình 3.1 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-1 9

Hình 3.2 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-2 9

Hình 3.3 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-3 9

Hình 3.4 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-1 10

Hình 3.5 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-2 10

Hình 3.6 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-3 10

1

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

1.1 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Vật liệu: Thực hiện kiểm định trên mẫu nước mía mua ngoài chợ

1.1.1 Kết quả định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.1.1 Kết quả

Kết quả sau khi ủ Coliforms trên môi trường VRBL ở 30 oC – 37 oC trong 24 giờ với độ pha loãng lần lượt từ 10-1 đến 10-3 (mỗi nồng độ 2 đĩa) Ở nồng độ 10-1 cho mật độ quá dày không thể đếm được khuẩn lạc, khuẩn lạc mọc đè lên nhau tạo thành các dải màu lan trên mặt đĩa Ở nồng độ 10-2 cho mật số giảm hơn, khuẩn lạc mọc tách trên đĩa thạch nhưng mật độ còn khá nhiều Ở nồng độ 10-3 cho mật số giảm hẳn, khuẩn lạc mọc tạo thành dải kéo dài trên đĩa Nếu lật đĩa lại sẽ đếm được các chấm khuẩn lạc nhỏ mọc li ti dưới đáy Đối với những khuẩn mọc đè lên nhau hoặc tạo thành các cụm thì vẫn tính là một vì do thao tác cấy trải không tốt nên kết quả chỉ mang tính chất tương đối

Hình 1.1 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-1

Hình 1.2 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-2

1.1.1.2 Biện luận và tính toán kết quả

Để kết quả có giá trị, thường cần đếm các khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có chứa

ít nhất 10 khuẩn lạc (tổng số các khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc các khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí xác định)

Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai

độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng công thức:

𝑛1 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓1+⋯+𝑛𝑖 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓𝑖

Trong đó:

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

Số lượng khuẩn lạc đếm được lần lược ở nồng độ 10-3 là 72 và 59

Số lượng khuẩn lạc đếm được ở nồng độ 10-1 và 10-2 lớn hơn 150 nên chỉ sử dụng nồng độ 10-3 để đếm khuẩn lạc

Ở nồng độ 10-3 khuẩn lạc mọc tạo chùm không mọc riêng rẽ có thể là do thao tác cấy Khi cấy trải đĩa không khô nên không bao phủ toàn mặt đĩa làm vi khuẩn mọc

đè lên nhau làm cho việc đếm không được chính xác, cần luyện tập thêm

Hình 1.3 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-3

3

1.1.2 Kết quả định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.2.1 Kết quả

Kết quả sau khi ủ E coli trên môi trường TBX ở 44 oC từ 18 - 24 giờ (không quá

24 giờ) với độ pha loãng lần lượt từ 10-1 dến 10-3 (mỗi nồng độ 2 đĩa)

1.1.2.2 Biện luận và tính toán kết quả

Kết quả cho thấy sau khi ủ ở điều kiện thích hợp thì các khuẩn lạc sẽ mọc lên với mật độ giảm dần theo từng hệ số pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10-3 Các đĩa cấy trải tương đối khô và đều, khuẩn lạc mọc riêng rẽ nên dễ đếm hơn ở đĩa VRBL Khuẩn lạc mọc giảm dần theo nồng độ từ 10-1 đến 10-3

Qua các nồng độ không phát hiện khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc màu xanh) chỉ xuất hiện duy nhất 1 khuẩn lạc ở nồng độ 10 −2 Khuẩn lạc phát hiện được có thể do

nhiễm từ bên ngoài vào hoặc mật độ E.coli quá thấp nên chỉ xuất hiện đúng 1 con Kết

luận mẫu thực phẩm không có E.coli Có thể kết luận mẫu nước mía mua ngoài chợ an toàn với E.coli

Hình 1.4 Đĩa thạch môi trường TBX nồng độ 10-1

Hình 1.5 Đĩa thạch môi trường TBX nồng độ 10-2

1.2 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

Nhận xét: Ở 3 nồng độ đều xuất hiện hiện tượng đục môi trường và sủi bọt khí

Kết quả định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

1.2.1.1 Kết quả

1.2.1.2 Biện luận và tính toán kết quả

Trong môi trường BGBL có hiện tượng đục môi trường và sinh hơi nên mẫu có

sự hiện diện của coliforms Để tăng độ tin cậy và tính thuyết phục có thể làm thêm

Hình 1.7 Kết quả các ống dương tính trong môi trường BGBL (a) ống đối chứng,(b) ống có

-3

Hình 1.6 Ống đối chứng và các ống LSB theo từng nồng độ (a) ống đối chứng, (b) ống có

5

ra kết quả chính xác hơn

Tính toán kết quả: cả 9 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng đều có sự sinh hơi

và làm đục môi trường Tra bảng MPN cho kết quả > 1100MPN / ml

1.2.2 Kết quả định lượng E coli bằng phương pháp MPN

Kết quả cho thấy tất cả 9 ống đều đục và có bọt khí khi sao với ống đối chứng

Chứng tỏ mẫu bị nghi ngờ có sự xuất hiện của E.coli Tiếp tục cấy sang môi trường

EMB để tìm khuẩn lạc đặc trưng

Sau khi cấy ria sang đĩa thạch EMB, đĩa ở nồng độ 10-1 thấy xuất hiện khuẩn lạc

đặc trưng nghi ngờ là E.coli, khuẩn lạc mọc trên đĩa có ánh kim xanh Ở nồng độ 10-2

và ở nồng độ 10-3 không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng Không phải là xuất hiện khuẩn

lạc đặc trưng đều là E.coli vì vậy tiếp tục sử dụng khuẩn lạc ở nồng độ 10-1 thực hiện

phản ứng sinh hóa, khẳng định xem có phải là E.coli hay không?

)

b

c

Hình 1.8 Kết quả các ống môi trường EC dương tính (a) ống đối chứng, (b) ống có nồng

Hình 1.9 Đĩa thạch EMB sau khi cấy từ ống canh EC (a) nồng độ 10 -1 , (b) nồng độ 10 -2 ,

Thử nghiệm IMViC được sử dụng để thực hiện các phản ứng nghi ngờ mẫu có

E.coli Kết quả IMViC dương tính thì mẫu dương tính với E.coli Kết quả IMViC âm tính thì mẫu âm tính với E.coli

1.2.3 Biện luận kết quả

Mẫu có Ecoli là mẫu có kết quả thử nghiệm IMViC: Indole (+), Methyl Red (+),

VP (-), Citrate (-) Trong khi đó kết quả phản ứng là Indole (+), Methyl Red (+), VP (+), Citrate (+).Từ đó cho thấy mẫu không phải Ecoli Môi trường EMB xuất hiện màu xanh ánh kim có thể chứa Ecoli, nhưng vì chưa làm thuần nên khi thử nghiệm IMViC lượng Ecoli quá ít nên kết quả bị sai Nhưng vì kết quả của phản ứng sinh hóa phù hợp với kết quả khi cấy trên môi trường TBX không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng nên có thể khẳng

định là không có E.coli trong mẫu.

a) b) c) d)

Hình 1.10 Kết quả phản ứng sinh hóa (a) ống phản ứng với Indol (+), (b) ống phản ứng với

Methyl Red (+), (c) ống phản ứng với VP (+), (d) ống phản ứng với iC (+)

7

BÀI 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

2.1 Kết quả định tính Salmonella

Vật liệu: Thực hiện kiểm định trên mẫu tôm khô

Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động

vật máu nóng và trong môi trường Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella

choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis) Các triệu chứng do Salmonella

gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 đến 36 giờ sau khi tiêu

thụ thực phẩm nhiễm Salmonella Chính vì sự nguy hiểm do Salmonella gây ra nên việc định tính Salmonella trong thực phẩm là rất cần thiết

Hình 2.2 Đĩa cấy mẫu trên môi trường chọn lọc trong HE

Hình 2.1 Mẫu tôm khô sau khi tăng sinh trong môi trường tăng sinh

(a) môi trường BPW, (b) môi trường RV

Giải thích kết quả

Ở hình 2.2 có sự xuất hiện của các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa cấy môi trường chọn lọc HE (khuẩn lạc có màu thay đổi từ màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen) trên các đĩa cấy môi trường chọn lọc HE Nghi ngờ mẫu có chứa

Salmonella, để khẳng định cần thêm kiểm tra các phản ứng sinh hóa cho Salmonella

để xác định mẫu có Salmonella

Hình 2.3 Kết quả thử nghiệm sinh hoá với các khuẩn lạc đặc trưng (a) ống thử nghiệm

môi trường Indol (+), (b) là kết quả thử nghiệm môi trường VP (-), (c) ống kết quả thử nghiệm môi trường KIA (-).

9

Thử nghiệm trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose)

và khả năng sinh H2S

Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên môi trường KIA, thử nghiệm Indol và VP được thể hiện trên hình 2.3., thử nghiệm Indol dương tính, VP và KIA đều âm tính, không

đúng với Salmonella Từ kết quả trên định tính âm tính với Salmonella trong 10 g mẫu

tôm khô

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí

3.1.1 Kết quả định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bún tươi

Kết quả định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA ở 30 oC – 37 oC trong 24 giờ với độ pha loãng lần lượt từ 10-1 đến 10-3 (mỗi nồng độ 2 đĩa)

Hình 3.1 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-1

3.1.2 Kết quả định lượng tổng số nấm men – nấm mốc trong mẫu bún tươi

Khuẩn lạc mọc đều trên đĩa, tạo khuẩn lạc riêng rẽ, cấy trải tốt hơn ở đĩa PCA, có thể dễ dàng đếm được mật số Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng tồn tại ở dạng khuẩn ty giả, các tế bào kết thành chuỗi Đa số các khuẩn lạc

là nấm men đều có dạng tròn, khuẩn lạc khô, tâm màu trắng hoặc hồng tía Không phát hiện nấm mốc dạng sợi, khuẩn lạc có tâm đen

Hình 3.2 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-2

Hình 3.3 Đĩa thạch môi trường PCA nồng độ 10-3

Hình 3.4 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-1

11

3.1.3 Tính toán kết quả và biện luận

Ở môi trường PCA và DRBC ta thấy ở nồng độ 10−1 tổng số khuẩn lạc lớn hơn 250 nên ta sử dụng nồng độ 10−2 và 10−3 để định tính Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa ở nồng độ 10−2 và 10−3 sau khi ủ Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng 25 – 250

để tính kết quả

Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng số nấm men- nấm mốc được tính như sau:

𝑛1 𝑉 𝑓1+ +𝑛𝑖 𝑉 𝑓𝑖

Trong đó:

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

Hình 3.5 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-2

Hình 3.6 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-3

Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí:

Số lượng khuẩn lạc đếm được ở 2 đĩa nồng độ 10−2 là : 192; 189

Số lượng khuẩn lạc đếm được ở 2 đĩa nồng độ 10−3 là : 31; 43

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu = 192+189+31+43

2∗0,1∗10 −2 +2∗0∗1∗ 10 −3 = 2,1*105 (CFU/g) Đinh lượng tổng số nấm men-nấm mốc:

Số lượng khuẩn lạc đếm được ở 2 đĩa nồng độ 10−2 là : 234; 112

Số lượng khuẩn lạc đếm được ở 2 đĩa nồng độ 10−3 là : 37; 52

Tổng số nấm men-nấm mốc trong 1g mẫu = 234+112

2∗0,1∗10 −2 +2∗0∗1∗ 10 −3 = 1,9*105 (CFU/g) Tổng số vi sinh vật hiếu khí = (tổng số vi khuẩn hiếu khí) + (tổng số nấm men – nấm mốc)

Tổng số vi sinh vật hiếu khí = 2,1*105 +1,9*105 = 4*105 (CFU/g)

13

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Trương Phước Thiên Hoàng, Lê Phước Thọ 2023 Tài liệu thực hành kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh