Knvs Nhóm 5.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Tháng 5 năm 2023 Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔ[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Tháng 5 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Sinh viên thực hiện

HEN RÍCH

LÊ THỊ NGỌC THI NGUYỄN LƯƠNG THẢO NHI

VÕ HOÀNG PHONG NGUYỄN ĐỨC LỢI

Người hướng dẫn thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

THS LÊ PHƯỚC THỌ

VÕ TRẦN QUỐC THẮNG

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH HÌNH ẢNH iii

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1

1 Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1 Kết quả 1

1.1.2 Biện luận và tính toán kết quả 2

1.2.1 Kết quả 3

1.2.2 Biện luận 4

2 Định lượng Coliforms và E Coli bằng phương pháp MPN 4

2.1.1 Định lượng Colifroms: ở môi trường BGBL 5

2.1.2 Định lượng E.coli ở môi trường EC 5

Bài 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 7

1 Kết quả 7

1.1 Kết quả thu được sau khi cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc RV 7

1.2 Kết quả thu được sau khi cấy vào HE 7

1.3 Kết quả thu được sau khi thực hiện phản ứng sinh hóa 8

2 Biện luận 8

Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC 9

1 Mẫu: Bò khô chợ 9

2 Kết quả: 9

2.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí: 9

2.2 Tổng nấm men, nấm mốc: 10

DANH SÁCH VIẾT TẮT

BPW: Buffered Pepton WaterS

DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar HE: Hektoen Entric Agar

KIA: Kliger Agar

PCA: Plate agar

RV: Rappaport Vassiliadis Pepton

TBX: Thạch trypton- mật- glucuronid

VRBL: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể

VP: Voges-Proskauer

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình Trang

Hình 1.1 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ủ ở 37oC trong 24 giờ nồng độ 10-1 1

Hình 1.2 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ở nồng độ 10-2 1

Hình 1.3 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ở nồng độ 10-3 2

Hình 1.4 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-1 ủ 370C, 24 giờ 3

Hình 1.5 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-2 ủ 370C, 24 giờ 3

Hình 1.6 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-3 ủ 370C, 24 giờ 4

Hình 1.7Môi trường LSB sau khi ủ 37oC ở 48 giờ 4

Hình 1.8 Môi trường BGBL sau khi ủ 37oC 48 giờ 5

Hình 1.9 Môi trường EC sau khi ủ 44,5oC 24 giờ 5

Hình 1.10 Môi trường thạch EMB và ủ 37oC 24 giờ 6

Hình 2.1 Mẫu khi để vào môi trường BPW và kết quả sau khi cấy vào VR 7

Hình 2.2 Đĩa thạch môi trường HE sau khi ủ 370C, 24 giờ 7

Hình 2.3 Các ống nghiệm sau khi thực hiện phản ứng sinh hóa 8

Hình 3.1 Chuẩn bị dịch mẫu 9

Hình 3.2 Đĩa thạch môi trường PCA ở nồng độ 10-2 sau khi ủ 300C trong 24 giờ 9

Hình 3.3 Đĩa thạch môi trường PCA ở nồng độ 10-3 sau khi ủ 300C trong 24 giờ 10

Hình 3.4 Đĩa thạch môi trường PCA ở nồng độ 10-4 sau khi ủ 300C trong 24 giờ 10

Hình 3.5 Đĩa thạch cấy ở môi trường DRBC ủ ở 250C trong 48 giờ 11

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

1 Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.1 Kết quả

Hình 1.1 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ủ ở 37oC trong 24 giờ nồng độ 10-1 Đĩa

thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 2

Hình 1.2 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ở nồng độ 10-2 (a) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 2

Nhận xét: đĩa thạch ở môi trường VRBL có sự xuất hiện của khuẩn lạc đặc trưng (màu

đỏ tía) trong đĩa cấy nồng độ 10-1

1.1.2 Biện luận và tính toán kết quả

Biện luận: kết quả cho thấy khuẩn lạc mọc lên với mật độ giảm dần theo từng hệ pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10-3 Đối với nồng độ pha loãng 10-2 và 10-3, bốn đĩa cấy không có khuẩn lạc hay cấy vẫn chưa đều dẫn đến không thể đếm khuẩn lạc, có thể quá trình thao tác môi trường và dịch cấy vẫn chưa được trộn đều

Tính toán kết quả: ở nồng độ pha loãng 10-1 hai đĩa có số khuẩn lạc mọc lần lượt

là 69 và 94 Ở nồng độ pha loãng 10-2 và 10-3 không có khuẩn lạc

Ta tính mật độ tổng khuẩn theo công thức sau:

( ) ( )i i

N A

=

+ +

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm

men) trong 1g hay 1ml mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

Ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

Hình 1.3 Đĩa thạch ở môi trường VRBL ở nồng độ 10-3 (a) Đĩa thạch cấy

ở nồng độ 10 -3 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -3 lần 2

3 1

2.1.10

1.2 Quy trình định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.2.1 Kết quả

Hình 1.4 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-1 ủ 370C, 24 giờ (a) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 2

Hình 1.5 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-2 ủ 370C, 24 giờ (c) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -2 lần 1; (d) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -2 lần 2

1.2.2 Biện luận

Đối với kết quả cho thấy, với nồng độ pha loãng 10-1,10-2 và 10-3, sáu đĩa cấy không có khuẩn lạc hay cấy vẫn chưa đều dẫn đến không thể đếm khuẩn lạc, có thể quá trình thao tác môi trường và dịch cấy vẫn chưa được trộn đều

2 Định lượng Coliforms và E Coli bằng phương pháp MPN

2.1 Ghi nhận kết quả LSB là dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng:

Nhận xét: các ống có hiện tượng sinh hơi, sủi bọt và bị đục so với ống đối chứng

Biện luận: nghi ngờ trong mẫu có Coliforms hoặc E.Coli

Hình 1.6 Đĩa thạch môi trường TBX ở nồng độ 10-3 ủ 370C, 24 giờ (e)

Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -3 lần 1; (f) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -3 lần 2

Hình 1.7 Môi trường LSB sau khi ủ 37oC ở 48 giờ. (a) ống nghiệm LSB ở nồng độ

10 -1 ; (b) ống nghiệm LSB ở nồng độ 10 -2 ; (c) ống nghiệm LSB ở nồng độ 10 -3 ; (d) ống nghiệm LSB đối chứng

2.1.1 Định lượng Colifroms ở môi trường BGBL

Định lượng Colifroms: ở môi trường BGBL sau khi ủ 37oC 48 giờ, bắt đầu dùng

Micropipet lấy 0,1ml dung dịch mẫu dương tính cho vào các ống nghiệm chứa môi trường BGBL, mỗi nồng độ lập lại 3 lần

Nhận xét: tất cả các ống đều sủi bọt và sinh hơi, màu bị đục ta kết luận là các mẫu đã dương tính với Colifroms Số lượng ống dương tính là 9/9 tổng số ống nghiệm Mật độ

vi sinh vật MPN/100ml là: lớn hơn 1,1.103

2.1.2 Định lượng E.coli ở môi trường EC

Hình 1.8 Môi trường BGBL sau khi ủ 37oC 48 giờ. (a) ống nghiệm ở nồng độ 10 -1 ; (b) ống nghiệm ở nồng độ 10 -2 ; (c) ống nghiệm ở nồng độ 10 -3 ; (d) ống nghiệm đối

chứng

Hình 1.9 Môi trường EC sau khi ủ 44,5oC 24 giờ (a) ống nghiệm ở nồng độ 10 -1 ;

Nhận xét: tất cả các ống nghiệm đều sinh hơi, sủi bọt và đục màu so với ống đối

chứng Suy ra mẫu dương tính với EC là có vi sinh vật Số lượng ống nghiệm dương tính là 9/9 tổng số ống nghiệm

Dùng que cấy vòng nhúng vào ống nghiệm có chứa dung dịch dương tính với EC Cấy ria sang môi trường thạch EMB và ủ 37oC 24 giờ để chọn khuẩn lạc điển hình

Nhận xét: Trong môi trường thạch EMB ở nồng độ 10-2 và 10-3 không có vi khuẩn lạc

điển hình (có màu xanh ánh kim), nên không có sự hiện diện E.coli trong mẫu ban đầu

Hình 1.10 Môi trường thạch EMB và ủ 37oC 24 giờ (a) Đĩa thạch EMB ở nồng

độ 10 -2 ; (b) Đĩa thạch EMB ở nồng độ 10 -3

Bài 2 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

1 Kết quả

1.1 Kết quả thu được sau khi cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc RV ủ ở 42 0 C trong 24 giờ

1.2 Kết quả thu được sau khi cấy vào HE ủ ở 37 0 C, 24 giờ

Hình 2.1 Mẫu khi để vào môi trường BPW và kết quả sau khi cấy vào VR.

(a) mẫu khi để vào môi trường tăng sinh BPW; (b) kết quả sau khi cấy vào môi

trường tăng sinh chọn lọc RV ủ ở 42 0 C trong 24 giờ; (c) môi trường RV khi chưa cấy dịch tăng sinh PMW

a) b)

b

c)

Nhận xét: theo kết quả cho thấy, hai đĩa cấy (a),(b) các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ là

Salmonella chưa được phân lập có thể do kĩ thuật cấy chưa đều

1.3 Kết quả thu được sau khi thực hiện phản ứng sinh hóa

Nhận xét: Theo kết quả cho thấy: thử nghiệm Indol dương tính, thử nghiệm VP âm

tính, thử nghiệm KIA dương tính Nên mẫu thử nghiệm không có Samonella

2 Biện luận

TH1: trong mẫu có Salmonella nhưng do trong quy trình bỏ qua bước làm thuần, dẫn

đến lấy sai khuẩn lạc nên kết quả Indol sai

TH2: trong mẫu không có Salmonella nhưng do trong quy trình bỏ qua bước làm thuần

dẫn đến kết quả KIA sai

Hình 2.3 Các ống nghiệm sau khi thực hiện phản ứng sinh

hóa (a) ống sau thử nghiệm Indol; (b) ống sau thử nghiệm VP;

(c) ống sau thử nghiệm KIA.

b

c

Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG

NẤM MEN NẤM MỐC

1 Mẫu: Bò khô chợ

2 Kết quả:

2.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí:

Hình 3.1 Chuẩn bị dịch mẫu (a) Cân 10 g bò khô; (b) Bò khô sau khi để

vào 90 g nước hấp

Biện luận: Hình 3.2 (a) mẫu ở nồng độ 10-2 bị nhiễm nấm nên ức chế sự sinh trưởng khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí, có thể trong lúc thao tác cấy xa đèn cồn và bước khử khuẩn cho que cấy chưa diệt hết vi khuẩn Hình 3.2 (b) mẫu ở nồng độ 10-2 lại có mật

độ khuẩn lạc vượt quá 250 nên không thể đếm

2.2 Tổng nấm men, nấm mốc:

Nhận xét: Trong mẫu khô bò không có nấm men nấm mốc, nên khi cấy ở môi trường DRBC ủ ở 250C trong 48 giờ không thấy sự xuất hiện của nấm men nấm mốc

Hình 3.3 Đĩa thạch môi trường PCA ở nồng độ 10-3 sau khi ủ 300C trong 24 giờ

(a) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -3 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -4 lần 2

Hình 3.4 Đĩa thạch môi trường PCA ở nồng độ 10-4 sau khi ủ 300C trong 24 giờ

(a) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -4 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -4 lần 2

b) a)

Hình 3.5 Đĩa thạch cấy ở môi trường DRBC ủ ở 250C trong 48 giờ (a) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 1; (b) Đĩa thạch cấy ở nồng độ 10 -1 lần 2