Knvs Nhóm 4 (1).Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOAKHOAHỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM TP Thủ Đức, 05/2023 Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HOC Chuyên[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Hướng Dẫn Khóa Học

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN

HOÀNG

THS: LÊ PHƯỚC THỌ

VÕ TRẦN QUỐC THẮNG

Sinh viên thực hiện

HUỲNH THỊ THÙY DUYÊN NGUYỄN ĐẠT

TRỊNH NGỌC KHÁNH NGUYỄN NHÃ LINH

VÕ HUỲNH THẢO VY NGUYẾN DƯƠNG PHƯƠNG YẾN

Thủ Đức, 05/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI 1

1.1 Định lượng Coliform và E.COLI bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1 Định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1.1 Kết quả 1

1.1.2 Định lượng E.COLI bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2

1.1.2.1 Kết quả 2

1.2 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương pháp MPN 3

1.2.1 Kết quả thu được 3

1.2.1.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN 3

1.2.1.2 Định lượng E.Coli bằng phương pháp MPN 4

BÀI 2: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 6

2.1 Kết quả 6

2.1.1 Kết quả thu được 6

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC 8

3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 8

3.1.1 Kết quả 8

3.1.2 Biện luận và tính toán kết quả 9

3.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 10

3.2.1 kết quả 10

3.2.2 Biện luận và tính toán 11

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BPW: Buffered Pepton Waters

DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

HE: Hektoen Entric Agar

KIA: Kliger Agar

PCA: Plate agar

RV: Rappaport Vassiliadis Pepton

TBX: Thạch trypton- mật- glucuronid

VRBL: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể

VP: Voges-Proskauer

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Môi trường VRBL sau khi ủ 37oC trong 24 giờ (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1lần 2; (c) Nồng độ 10-2lần 1; (d) Nồng độ 10-2lần 2 1 Hình 1.2 Môi trường TBX sau khi ủ 44oC trong 24 giờ (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1lần 2; (c) Nồng độ 10-2lần 1; (d) Nồng độ 10-2lần 2 2 Hình 1.3 Các ống nghiệm LSB sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ (DC) Đối chứng;(a) Ống nghiệm ở nồng độ 10-1; (b) Ống nghiệm ở nồng độ 10-2; (c) Ống nghiệm ở nồng

độ 10-3 3 Hình 1.4 Các ống nghiệm BGBL sau khi ủ 37oC trong 48 tiếng (a) Ống ở nồng độ

10-1; (b) Ống ở nồng độ 10-2; (DC): Ống đối chứng 4 Hình 1.5 Các ống nghiệm EC sau khi ủ 44,5oC trong 24 giờ (a) ống ở nồng độ 10 -1 ; (c) ống ở nồng độ 10 -2 5

Hình 2.1: Mẫu gan heo và môi trường tăng sinh (a) mẫu gan heo trong môi trường

tăng sinh BPW, ( b) Ống nghiệm đối chứng, ( c) Dịch mẫu trong môi trường tăng sinh chọn lọc RV 6

Hình 2.1: Mẫu gan heo và môi trường tăng sinh (A) mẫu gan heo trong môi trường tăng sinh BPW, ( B) Ống nghiệm đối chứng, ( C) Dịch mẫu trong môi trường tăng sinh chọn lọc RV 6

Hình 2.2:Đĩa petri chứa khuẩn lạc trong môi trường HE (a) đĩa cấy lần 1; (b) đĩa

cấy lần 2 6

Hình 2.2:Đĩa petri chứa khuẩn lạc trong môi trường HE.(A) đĩa cấy lần 1, (B) đĩa

cấy lần 2 6

Hình 2.3: Thủ nghiệm sinh hóa (a) thử nghiệm KIA; (b) thử nghiệm VP; (c) thủ

nghiệm Indol 7

Hình 3.1.1 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10-2 (A) Nồng độ 10 -2 lần 1; (B) nồng độ 10 -2 lần 2 8

Hình 3.1.2 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10-3 (C) Nồng độ 10-3lần 1; (D) Nồng độ 10-3lặp lại lần 2 8

Hình 3.1.3 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10-4 (e) Nồng độ 10 -4 lần 1; (f) Nồng độ 10 -4 lần 2 9

Hình 3.2.1 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-1 (a) Nồng độ 10 -1

lần1; (b) Nồng độ 10 -1 lần 2 10

Hình 3.2.2 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-2 (c) Nồng độ 10 -2 lần 1; (d) Nồng độ 10 -2 lần 2 10

Hình 3.2.3 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-3 (e) Nồng độ10 -3 lần1; (f) Nồng độ 10 -3 lần 2 11

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1.2 nồng độ và số lần lặp của đĩa petri trong môi trường PCA 9 Bảng 3.1.3 Nồng độ và số lần lặp của đĩa petri chứa mơi trường DRBC 11

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI

1.1 Định lượng Coliform và E.COLI bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.1 Định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.1.1 Kết quả

Sau khi ủ mẫu trà sữa trong môi trường VRBL ở 37oC trong 24 giờ

Nhận xét qua hình 1.1 đều không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng của Coliform trên môi trường VRBL ở cả 2 nồng độ 10-1và 10-2 nên không cần đề cập đến nồng độ

10-3 Suy ra có thể dừng thí nghiệm tại đây

Hình 1.1 Môi trường VRBL sau khi ủ 37 o C trong 24 giờ (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2lần 1; (d) Nồng độ 10-2lần 2

Kết luận mẫu không có sự hiện diện của Coliform trong mẫu trà sữa.

1.1.2 Định lượng E.COLI bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.2.1 Kết quả

Nhận xét: Môi trường TBX là môi trường chọn lọc được sừ dụng trong chọn lọc

E.COLI trong thực phẩm Qua hình 2.1 không có sự xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng của E.COLI trên môi trường TBX ở 2 nồng độ 10-1 và 10-2nên không cần đề cập đến ảnh của 10-3 Suy ra có thể dừng thí nghiệm tại đây

Hình 1.2 Môi trường TBX sau khi ủ 44 o C trong 24 giờ (a) Nồng độ 10-1lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2lần 1; (d) Nồng độ 10-2lần 2

1.2 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương pháp MPN

1.2.1 Kết quả thu được

Nhận xét: So với ống đối chứng thì 3 ống ở nồng độ 10-1 và ống đầu tiên ở nồng

độ 10-2xuất hiện bọt khí và bị đục 2 ống tiếp theo ở nồng độ 10-2không có hiện tượng sinh bọt khí nhưng vẫn bị đục nhẹ cho thấy sự nghi ngờ là có sự hiện diện của vi khuẩn Ở 3 ống nồng độ 10-3không có xảy ra hiện tượng và giống như ống đối chứng, nên không có sự hiện diện của vi khuẩn

Sau khi ghi nhận các ống LSB(+) và 2 ống nghi ngờ ở hình 1.3 thì ta tiếp tục cấy vào ống canh chứa môi trường BGBL ở nhiệt độ 37oC trong 48 tiếng và môi trường

EC ở nhiệt độ 44,5oC trong 24 tiếng

1.2.1.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

Các ống canh BGBL sau khi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 tiếng

Nhận xét: Theo hình 1.4 số ống sinh hơi sau khi ủ các ống canh BGBL ở nhiệt độ

37oC trong 48 tiếng, với các ổng ở nồng độ 10-1 đều có sinh hơi và có bọt khí , còn ở các ống với nồng độ 10-2 chỉ có 2 ống sinh hơi so với ống đối chứng và ống còn lại không có hiện tượng gì xảy ra

Hình 1.3 Các ống nghiệm LSB sau khi ủ ở 37 o C trong 48 giờ.(DC) Đối chứng; (a) Ống nghiệm ở nồng độ 10 -1 ; (b) Ống nghiệm ở nồng độ 10 -2 ; (c) Ống nghiệm ở nồng độ

10-3

Các ống nghiệm BGBL sau khi ủ ở 37oC trong 24 giờ ở tất cả độ pha loãng đều (+) (sinh hơi) Tra bảng MPN với số lượng kết quả ống dương tính theo nồng độ pha

MPN/ml

1.2.1.2 Định lượng E.Coli bằng phương pháp MPN

Ghi nhận các ống LSD(+) có ở những nồng độ pha loãng hình 1.3, tiếp tục quá trình cấy vào ống canh EC ủ ở 44 độ C trong 24 giờ

Biện luận các ống nghiệm EC sau khi ủ ở 37oC trong 24 giờ với nồng độ pha loãng 10-1 10-2 đều (+) (sinh hơi và đục màu môi trường)

Tiếp tục cấy ria từ ống EC(+) vào đĩa thạch EMB, ủ ở 37oC trong 24 giờ Nếu đĩa xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng ánh kim xanh thì thực hiện thử nghiệm sinh hóa Indol –

MR – VP – SC Ghi nhận và tính kết quả

Hình 1.6 cho thấy không tồn tại E coli trong mẫu trà sữa do khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch EMB sau khi ủ ở 370C trong 24 giờ không có màu ánh kim xanh đặc trưng vì thế không tiến hành thử nghiệm IMViC

Hình 1.4 Các ống nghiệm BGBL sau khi ủ 37 o C trong 48 tiếng.(a) Ống ở nồng độ

10 -1 ; (b) Ống ở nồng độ 10 -2 ; (DC): Ống đối chứng

DC

Hình 1.5 Các ống nghiệm EC sau khi ủ 44,5 o C trong 24 giờ (a) ống ở nồng độ 10 -1 ; (c) ống ở nồng độ 10 -2

DC

Hình 1.6 Đĩa petri chứa môi trường EMB sau khi ủ 37 o C trong 24 giờ (A) Nồng

độ 10 -1 lần 1; (B) Nồng độ 10 -1 lần 2

BÀI 2: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

2.1 Kết quả

2.1.1 Kết quả thu được

Hình 2.1: Mẫu gan heo và môi trường tăng sinh (a) mẫu gan heo trong môi trường tăng sinh BPW, ( b) Ống nghiệm đối chứng, ( c) Dịch mẫu trong môi trường tăng sinh chọn lọc RV

Cho mẫu gan heo đã chuẩn bị vào môi trường tăng sinh BPW ủ ở nhiệt độ 37°C trong 18-24 giờ( Hình 2.1A) Ta tiếp tục tăng sinh vi khuẩn bằng cách hút 0,1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV và ủ ở 42°C trong 18-24 giờ( Hình 2.1C) Sau đó tiến hành phân lập khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc đặc biệt HE Nhận xét: Sau khi ủ trên đĩa cấy ở môi trường HE xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh dương, chứng tỏ đã có sự phát triển của salmonella để hình thành những khuẩn lạc nghi ngờ có sự hiện diện của salmonella trong mẫu gan (Hình 2.2)

Kết quả: Sau đó tiến hành

các phản ứng sinh hoá để kiểm

định sự hiện diện của Salmonella

Trong ổng nghiệm A, salmonella

phản ứng sinh ra H2S tạo màu

đen cho kết quả dương tính

Trong ống nghiệm B, cho kết quả

âm tính vì không có sự thay đổi

màu sắc chỉ thị sau Trong ống

nghiệm C, cho kết quả âm tính vì

không có sự thay đổi màu sắc chỉ

thị

Hình 2.3: Thủ nghiệm sinh hóa.(a) thử nghiệm KIA; (b) thử nghiệm VP; (c) thủ nghiệm Indol

Kết luận: qua các bước kiểm định, cho kết quả dương tính với Salmonella trong

mẫu .gan

BÀI 3 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG

NẤM MEN-NẤM MỐC

3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí.

3.1.1 Kết quả

Kết quả định lượng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau khi ủ 37oC trong 24 giờ, ( mỗi nồng độ lặp lại 2 lần)

Hình 3.1.1 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10 -2.(a) Nồng độ 10 -2 lần 1; (b) nồng độ 10 -2 lần 2

Nhận xét Có khuẩn lạc xuất hiện trong môi trường PCA.

3.1.2 Biện luận và tính toán kết quả

Trong quá trình cấy còn có 1 số thao tác chưa được tốt và vẫn xuất hiện sai xót trong quá trình cấy

Ở các hình trên các đĩa vẫn chưa được cấy đều, cấy bị nhiễm, cấy chưa khô dẫn đến việc 1 số đĩa không thể xác định được số lượng khuẩn lạc có trong môi trường PCA Tính toán kết quả

Số lần lặp

Ta có công thức A=

1 1 i . i

N

196 185 26 1,9.10

2.0,1.10  1.0,1.10 



Vây mật độ pha loãng định lượng được trong môi trường PCA là 1,9.106CFU/g

Hình 3.1.3 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10 -4 (e) Nồng độ 10 -4 lần 1; (f) Nồng độ 10 -4 lần 2

Bảng 3.1.2 nồng độ và số lần lặp của đĩa petri trong môi trường PCA

3.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc

3.2.1 kết quả

Kết quả tổng nấm men – nấm mốc thu được trong môi trường DRBC sau khi ủ

25oC từ 3-5 ngày

Nhận xét ở 2 nồng độ 10-1và 10-2 ta đều thấy 4 đĩa đều có sự xuất hiện của nấm mốc

Hình 3.2.1 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10 -1 (a) Nồng độ 10 -1 lần1; (b) Nồng độ 10 -1 lần 2

Hình 3.2.2 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10 -2 (c) Nồng độ 10 -2 lần 1; (d) Nồng độ 10 -2 lần 2

Nhận xét ở hình 3.2.3 ta chỉ thấy được sự xuất hiện của nấm mốc ở hình 3.2.3(f) còn ở hình còn lại ta kh thấy được hiện tượng gì

3.2.2 Biện luận và tính toán

Biện luận

Do trong quá trình cấy vẫy xảy ra thao tác chưa chính xác như hơ que cấy còn nóng có thể dẫn đến làm cho các nấm mốc bị chết đi Các đĩa cấy có sự sai xót nên vẫn có thể xảy ra việc số liệu vẫn chưa chính xác nhất có thể

Tính toán kết quả

Lần lặp lại

Ta có công thức A=

1 1 i . i

N

2.0,1.10  2.0,1.10  1.0,1.10 

 



Vậy mật độ pha loãng định lượng trong môi trường PRBC là 4,5.10-2CFU/g

Hình 3.2.3 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10 -3 (e) Nồng độ10 -3 lần1; (f) Nồng độ 10 -3 lần 2

Bảng 3.1.3 Nồng độ và số lần lặp của đĩa petri chứa mơi trường DRBC