Môn học VI SINH THỰC PHẨM báo cáo KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM mẫu KIỂM NGHIỆM nước ép RAU má

VI SINH VẬT CÓ HẠIBÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA Mẫu thực phẩm: Nước rau má không đá có đường Trong phương pháp này, cần pha loãng mẫ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 04 năm 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

GIỚI THIỆU CHUNG

Vi sinh vật học thực phẩm là một môn khoa học nghiên cứu về những hoạt động sinh lý của vi sinh vật có ảnh hưởng đến chất lượng của lương thực thực phẩm, tìm hiểu các quy luật phát triển của vi sinh vật trên thực phẩm để có những biện pháp ngăn ngừa tác động tiêu cực và phát huy tác động tích cực của chúng trong quá trình bảo quản và chế biến thực phẩm Không phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều được các nhà vi sinh thực phẩm quan tâm ngang nhau.

Việc thực hành môn vi sinh thực phẩm giúp sinh viên vận dụng những lý thuyết đã được học để tiến hành phân tích, giải quyết những vấn đề liên quan đến vi sinh vật Từ đó, áp dụng thực tế của vi sinh vật trong chế biến, bảo quản và an toàn vệ sinh thực phẩm.

Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm nhằm hệ thống hóa kiến thức, trình bày cơ chế cùng thao tác thực nghiệm, đồng thời để sinh viên tham gia thảo luận về những vấn đề thường gặp trong thí nghiệm

vi sinh Bên cạnh đó, trình bày những mặt lợi và hại do vi sinh vật mang đến đối với thực phẩm.

PHẦN 1 VI SINH VẬT CÓ HẠI

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG

THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA Mẫu thực phẩm: Nước rau má không đá có đường

Trong phương pháp này, cần pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10liên tiếp để có độ pha loãng và mật độ thich hợp cho việc đếm và tính toán Số lượngkhuẩn lạc tối ưu được đề nghị là 25-300 khuẩn lạc/đĩa

Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ Kết quả đếm và mậ độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn

+ Điều kiện từ lúc mua đến lúc bảo quản: ở nhiệt độ phòng

+ Nhận xét về nơi mua mẫu: Rác gần nơi bán

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

- Micropipette và đầu típ - Bao nilon bọc dụng cụ

3.3 Thiết bị

- Máy ủ

4 Cách tiến hành

4.1 Pha loãng mẫu

Lắc đều mẫu trước khi pha loãng, sau đó dùng pipette đã tiệt trùng hút 10ml dungdịch mẫu vào bình đựng 90ml NaCL Tiến hành đồng nhất mẫu: Cầm cổ bình rồi lắc theo chiều kim đồng hồ 25 vòng và ngược chiều kim đồng hồ 25 vòng Lúc này, hệ số pha loãng mẫu là 10-1

Tiếp tục tiến hành pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 1ml dung dịch từ mẫu pha loãng trước đó qua ống nghiệm chứa 9ml NaCl, đem đi đồng nhất mẫu bằng máy rung lắc ống nghiệm: bật công tắc cho máy, ống nghiệm cầm trong lòng bàn tay, ngón cái giữ ngay nắp ống nghiệm và ấn xuống máy 3 lần, mỗi lần khoảng từ 1-3

giây Ta có hệ số pha loãng mẫu là 10-2, tương tự ta có 10-3 và 10-4 cho 2 ống nghiệm đựng NaCl còn lại (tổng 3 ống nghiệm đựng 9ml NaCl đã chuẩn bị trước)

Hình 1: Dung dịch mẫu và hệ số pha loãng

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

4.2 Tiến hành nuôi cấy VSV bằng phương pháp đổ đĩa

Sau khi pha loãng, chọn 1 bộ 3 hệ số pha loãng liên tiếp (cụ thể nhóm chọn là 10

-1, 10-2, 10-3) để tiến hành đổ đĩa Mỗi nồng độ pha loãng sẽ đổ tương ứng 2 đĩa petri(tổng

6 đĩa cho 3 nồng độ) Phương pháp đổ đĩa: dùng micropipette hút 1ml dung dịch từ ống nghiệm chứa nồng độ pha loãng đã chọn qua đĩa petri, sau đó đổ khoảng từ 15-20ml môitrường PCA vào đĩa petri (sau cho dàn đều mặt đáy đĩa) Lập lại tương tự với các đĩa còn lại

Đem tất cả đĩa petri đã đổ bọc vào bịch nilon và đem ủ ở máy ủ với nhiệt độ là

37oC±1oC trong thời gian khoảng 19h40 phút Sau đó mang ra để tiến hành đếm và tính toán định lượng số lượng VKHK có trong mẫu thí nghiệm

4.3 Lưu ý khi thực hiện thí nghiệm

Rửa tay khử khuẩn trước khi tiến hành thí nghiệm

Mọi công việc trong mục 4.1 và 4.2 đều được thực hiện kế bên ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm chéo

Ghi chú lại trên ống nghiệm và đĩa petri bằng bút lông dầu để tránh tình

trạng nhầm lẫn

Kết quả:

Hình 2: Khuẩn lạc trong 6 đĩa petri môi trường PCA

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

- Môi trường kết quả không bị biến đổi màu sắc.

Khuẩn lạc mọc nhiều ở khắp bề mặt bên trên, dưới và bên trong của thạch, độ to nhỏ không đồng đều cho thấy có rất nhiều loại VKHK tồn tại trong mẫu

Cả 6 đĩa đều có số lượng khuẩn lạc rất nhiều (lớn hơn 300) nên không thể đếm

được chính xác số lượng VKHK có trong mẫu

- Khi tiến hành pha loãng mẫu:

+ Pha loãng ít nhất 3 nồng độ liên tiếp

+ Các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu và đồng nhất mẫu

+ Nồng độ pha loãng mẫu phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh thực phẩm, thời gian bảo quản, kinh nghiệm người thực hiện…

+ Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn

+ Các ống nghiệm phải được vô trùng và sử dụng micropipet 1000ul để tránh hiệntượng sai số

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

- Khi tiến hành nuôi cấy dịch mẫu

+ Phải cho vi sinh vật vào đĩa petri trước, sau đó mới đổ môi trường vào các đĩa

 Những hư hỏng trong quá trình thí nghiệm

- Nồng độ pha loãng chưa đúng: hút không đúng thể tích yêu cầu và chưa đồng nhất mẫu, thao tác thí nghiệm sai dẫn đến sai số đáng kể

- Môi trường nuôi cấy dịch mẫu không đông đặc Nguyên nhân bao gồm: thời gian chưa đủ, môi trường cũ, lượng môi trường chưa đủ, lắc môi trường chưa đều

- Số khuẩn lạc không nằm trong khoảng 30 ≤ A ≤ 300 Nguyên nhân là: thời giannuôi cấy chưa đủ, nồng độ pha loãng chưa đồng nhất dẫn đến việc lấy 1ml dịch mẫuchứa ít vi sinh vật, thao tác thí nghiệm sai

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORM VÀ COLIFORM CHỊU NHIỆT

BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG (MPN) Mẫu thực phẩm: Nước rau má không đá có đường.

- Môi trường LSB (Lauryl Sulphate Broth): Môi trường vi sinh được dùng trong

việc xác định vi khuẩn Coliform

+ Mono potassium phosphate 2.75

+ Sodium lauryl sulphate 0.1

Pha môi trường:

+ Hòa tan 9,61g trong 270ml nước

+ Đun sôi và khuấy nhẹ đến khi tan hoàn toàn

+ Đổ 5ml môi trường đã được hòa tan vào các ống nghiệm thủy tinh có nắp chứa các ống Durham (úp ngược)

+Tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng (15 PSI – 121°C trong 30 phút) Sau đó làm lạnh đến 45 – 50°C trước khi dùng

- Ghi thông tin lên mỗi ống môi trường

- Kiểm tra bọt khí trong ống Durham trước khi cho mẫu vào

- Cho vào mỗi ống môi trường LSB 1 ml dung dịch mẫu: 3 ống 10-1, 3 ống 10-2, 3 ống 10-3

- Không lắc hoặc đồng nhất

- Ủ ở nhiệt độ 37°C, thời gian 19 giờ 40 phút

- Chuẩn bị 9 ống môi trường BGBB và 9 ống môi trường EC (tất cả đều chứa ống Durham)

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

- Môi trường BGBB (Brilliant Green Bile Broth): Thường dùng để phát hiện và

định lượng vi khuẩn Coliform trong nước và thực phẩm

+ Hóa chất vi sinh Brilliant Green Bile Broth 2% TM678 Titan dạng bột hút ẩm

tự nhiên nên cần được bảo quản trong bình kín dưới nhiệt độ 25°C và tránh ánh sángtrực tiếp

Pha môi trường:

+ Hòa tan hoàn toàn 10,80g với độ chính xác hai số lẻ trong 270ml nước

+ Đun sôi và khuấy đến khi tan hoàn toàn

+ Sau đó tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng tại 15 PSI – 121°C trong vòng 30 phút.+ Đổ vào các ống nghiệm có chứa ống Durham đảo ngược

- Môi trường EC: Sử dụng để phát hiện Coliform trong quá trình kiểm tra vi

khuẩn của nước, sữa và thực phẩm

Thành phần:

+ Tryptone 20g

+ Lactose 5g

+ Bile salts mixture 1,5g

+ Dipotassium hydrogen phosphate 4g

+ Potassium dihydrogen phosphate 1,5g

+ Sodium chloride 5g

+ Độ pH (ở 25°C) 6,9 ± 0,2

Pha môi trường:

+ Cân 9,99g môi trường khử nước và hòa tan trong 270ml nước

+ Để yên trong 5 phút

+ Sau đó đun sôi, khuấy đến khi tan hoàn toàn

+ Đổ vào các ống nghiệm có ống Durham bên trong, tiệt trùng trong nồi hấp ở 121°C trong 30 phút

4 Quy trình thực hiện thí nghiệm

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Bước 1: Pha loãng mẫu

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

 Tổng số Coliform chịu nhiệt > 10n-1 x 1100

Với n = 1 => Tổng số Coliform chịu nhiệt > 1,1 x 103 (MPN/ml)

- Môi trường LT: sử dụng để phát hiện vi khuẩn Coliform trong nước và các loạithực phẩm khác, … thúc đẩy sự sinh trưởng và giải phóng khí vi sinh vật Coliform

Bản chất của E coli là một nhóm coliform chịu nhiệt, vì vậy ở bài thực hành định tính E.coli này, chúng ta sẽ tận dụng các ống nghiệm chứa coliform chịu nhiệt trong các

ống môi trường EC dương tính ở Bài 2- Định lượng tổng số coliform

Bên trong các ống EC dương tính của Bài 2, ngoại trừ E.coli cần định tính ra thì còn có nhiều nhóm coliform chịu nhiệt khác Để xác định việc có hay không E.coi

tồn tại trong mẫu thực phẩm, cần tiến hành phương pháp cấy phân lập vi khuẩn E.colitrên môi trường EMB

Nếu xác định bên trong mẫu thực phẩm có tồn tại E.coli sẽ chuyển sang tiến

hành định danh VSV bằng KIT

Vì thời gian ủ để tăng sinh là từ khoảng 24-48h, nhưng định danh bằng KIT NKIDS

14 GNR thì thời gian ủ để có thể định danh chỉ trong khoảng 16-24h, điều này mẫu thuẫn với thời gian ủ tăng sinh bên trên nên sẽ không thể xác định được danh tính của

E.coli trong mẫu thí nghiệm theo cách này Thay vào đó, người ta sẽ dùng độ đục để xác

định nồng độ VSV có trong mẫu để tiến hành định danh

3 Nguyên liệu- dụng cụ- thiết bị

3.1 Nguyên liệu

- Mẫu thí nghiệm: 3 ống nghiệm chứa coliform chịu nhiệt trong các ống môi trường EC dương tính lấy từ Bài 2 (cụ thể có 1 ống nồng độ 10-1, 1 ống 10-2, 1 ống 10-3)

- Môi trường và hóa chất (đã được chuẩn bị và tiệt trùng sẵn):

+ EMB: 3 đĩa môi trường thạch EMB (chứa khaonrg 20ml EMB bên tỏng mỗi đĩa)

+ PCA: ống thạch nghiêng PCA để nuôi cấy vi khuẩn (đã được chuẩn bị vfa nuôi cấy từ trước- sử dụng để làm phần định danh vi khuẩn)

3.2 Dụng cụ

- Ống nghiệm - Micropipette và đầu típ

- Que cấy vòng và que cấy thẳng -Bịch nilon bọc dụng cụ -

Bút lông dầu

3.3 Thiết bị

4 Cách tiến hành

4.1 Cấy phân lập trên môi trường EMB

Dùng que cấy vòng nhúng vào ống EC dương tính và tiến hành cấy phân lập vào môi trường EMB theo phương pháp đã học:

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Sau khi cấy xong thì dùng bịch nilon bọc các đĩa petri lại và đem đi ủ ở tủ ủ dưới nhiệt độ 37oC±1oC trong khoảng từ 24-48h.

Sau khi ủ xong, lấy đĩa petri ra và quan sát kết quả

4.2 Các lưu ý khi thực hành

Rửa tay khử khuẩn trước khi tiến hành thí nghiệm

Mọi công việc đều được thực hiện kế bên ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm chéo.Ghi chú lại trên đĩa bằng bút lông dầu để tránh tình trạng nhầm lẫn

Mọi vật dụng sau khi sử dụng xong cần được đem đi khử trùng, tuyệt đối

không rửa bằng nước thường

5 Kết quả

Hình 3: Đĩa môi trường EMB

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

 Cách nhận diện có thể có E coli trên EMB:

- Mặt trên đĩa: Khuẩn lạc tròn bóng, lồi và có ánh xanh kim loại

- Mặt dưới đĩa: Khuẩn lạc màu tím, đường kính khoảng 2-3mm, có tâm đen chiếm khoảng ¾ đường kính

- Môi trường cấy bình thường không có sự biến đổi

Dựa trên các đặc điểm nhận biết, có thể kết luận: Nghi ngờ có E coli trong mẫu thực

phẩm rau má có đường không đá ướp lạnh

6 Giải thích :

Eosin methylene blue (EMB) là một chất nhuộm màu chọn lọc cho vi khuẩn gramâm EMB chứa thuốc nhuộm độc hại đối với vi khuẩn gram dương EMB là môi trườngchọn lọc và vi phân cho coliforms Nó là sự pha trộn của hai chất nhuộm màu, eosin và xanh methylen theo tỷ lệ 6:1 Một ứng dụng phổ biến của chất nhuộm màu này

là trong việc tạo ra môi trường thạch EMB, một môi trường vi sinh khác biệt, ức chế một chút sự phát triển của vi khuẩn gram dương và cung cấp một chỉ thị màu phân biệt giữa các sinh vật lên men lactose (ví dụ E coli ) Các sinh vật lên men lactose sẽ thể hiện là một loại "khuẩn lạc có nhân" có màu đen với các phần trung tâm tối

Lên men nhanh chóng tạo ra axit, làm giảm độ pH Điều này khuyến khích sự hấp thụ chất nhuộm của các khuẩn lạc, hiện có màu tím đen

Trên EMB, nếu E coli được nuôi cấy, nó sẽ tạo ra ánh sáng màu xanh kim

loại đặc biệt (do tính chất chuyển hóa của chất nhuộm, chuyển động của E coli sử

dụng Flagella và các sản phẩm cuối của axit mạnh lên men)

BÀI 4 KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Mẫu thực phẩm: nước rau má không đá có đường

- 3 đĩa petri chứa XLD đã được tiệt trùng

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

2 Cách tiến hành

Pha môi trường: Cân chính xác 3,375g PW và cho vào bình đựng với 225ml nước

tinh khiết, khuấy đều

Bước 1: Tiền tăng sinh

Bao gói dụng cụ và bình đựng môi trường vừa pha, đem đi hấp tiệt trùng trong nồi hấp tiệt trùng ở 121ºC trong 30 phút

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Hút 25ml mẫu vào trong bình đựng PW đã được tiệt trùng, đóng nắp và lắc đều Ủ

ở 37ºC trong 19 giờ

Bước 3: Quan sát và phân lập

Cho vào 2 ống nghiệm chứa 5ml RV mỗi ống 0,1 ml hỗn hợp mẫu + PW Gắn nút

và đem ủ ở 42ºC trong 29 giờ 20 phút

Bước 4: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Dùng que cấy vòng cấy phân lập dung dịch vừa ủ lên đĩa môi trường XLD Đem đi ủ

ở 37ºC trong 16 giờ Quan sát lạc khuẩn

Bước 5 và 6: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường thạch NA và khẳng định bằng KIT định danh

- Bước 5 không thực hiện, đã được chuẩn bị sẵn ống nghiệm chứa Salmonella nghi

Giai Môi Hình ảnh quan sát Đặc điểm quan sát Kết luận đoạn trường

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Tăng RV Môi trường nuôi Dương

- Mặt dưới đĩa: a trong

khuẩn lạc màu mẫu rauhồng, tâm đen má

hoặc không có(thực tế nhómchưa phân lậpđược)

- Môi trường xungquanh bị biếnđổi thành màuhồng

 Giải thích kết quả:

- Đầu tiên, cân mẫu và đem đi đồng nhất mẫu với BPW vì đây là môi trường tăng sinh không chọn lọc Trong BPW có pepton là nguồn nitơ, cacbon, vitamin và khoáng vật,… Giúp cho vi sinh vật tăng trưởng trở lại một cách mạnh mẽ cũng như phục hồi các tế bào bị tổn thương trong quá trình bảo quản

- Chuyển khóm khuẩn vào môi trường RV (Rapparport Vasiliadis broth) Đây là môi

trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế các vi sinh vật khác, chọn lọc Salmonella Nhưng

vì đây là môi trường chọn lọc cực mạnh nên nếu chúng ta không có giai đoạn tiền tăng sinh để chúng khỏe mạnh thì có thể ngay cả Salmonella cũng bị ức chế (các tế bào

Salmonella yếu, bị tổn thương…) Trong môi trường RV có Malachite green oxalate (chất

ức chế mạnh) giúp ức chế các vi sinh khác không phải

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Salmonella MgCl2 tăng áp lực thẩm thấu trong môi trường Độ pH thấp của môi trường RV kết hợp với MgCl2 và Malachite green oxalate cũng làm tăng tính đề kháng

của Salmonella Ngoài ra, trong RV còn có Trypton là nguồn dinh dưỡng kết hợp của nhiều dưỡng chất, giúp tăng sinh Salmonella Vì vậy, sau giai đoạn tăng sinh này thì mật độ Salmonella trong mẫu sẽ cao hơn so với các vi sinh vật khác.

- Cấy phân lập môi trường XLD là môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho

Salmonella hay nói cách khác là Salmonella phát triển và phân lập tốt, cho ra các khuẩn

lạc điển hình, dễ quan sát

PHẦN 2 VI SINH VẬT CÓ LỢI

BÀI 5: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÓ LỢI TRONG THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN (THỰC PHẨM LÊN MEN: CỦ CẢI NGÂM CHUA)

Bước 1: Cho đường, nước và giấm gạo vào nồi, sau đó đun sôi cho đường tan rồi

tắt bếp Để cho nước hỗn hợp nguội

Bước 2: Củ cải trắng và cà rốt có thể gọt vỏ hoặc để vỏ rồi rửa sạch Bào củ thành lát

mỏng Tùy vào sở thích của mỗi gia đình mà độ mảnh của củ cải và cà rốt có thểthay đổi

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Bước 3: Sau khi cắt sợi xong cho tất cả củ vào tô to, thêm vào 1 muỗng cà phê muối

và trộn đều Khi ướp củ cải trắng và cà rốt với muối sẽ giúp chúng mềm dẻo và gia tăng hương vị hơn

Bước 4: Sau khoảng 30 phút ngâm củ cải với muối thì các bạn rửa sạch chúng với

nước lạnh

Bước 5: Cho tất cả củ cải, cà rốt vào hủ nhựa Sau khi cho củ vào hủ thì các bạn lấy hỗn

hợp giấm, nước và đường đã chuẩn bị trước đó đổ đều vào hủ Đảm bảo sao cho hỗn hợp giấm đường ngập đều các củ

3 Thành phẩm

3.1 Khái niệm:

Muối chua là quy trình bảo quản hay kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm bằng cáchlên men yếm khí trong nước muối hoặc trong giấm Muối chua thường sẽ ảnh hưởng đếnkết cấu và hương vị của thực phẩm

3.2 Cơ chế lên men của sản phẩm:

Một đặc điểm của việc muối chua đó là độ pH ở mức 4,6 hoặc thấp hơn, nên vô cùnghiệu quả trong việc tiêu diệt các loại vi khuẩn

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com