Tủy xương, máu ngoại vi và máu cuống rốn là những nguồ n chủ yếu có thể thu nhận được tế bào tiền thân nội mô.. Bên cạnh đó, máu cuống rốn lại là nguồn chứa dồi dào các loại tế bào gốc v
GIỚI THIỆU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của kinh tế, khoa học và công nghệ, xã hội đang đối mặt với nguy cơ của nhiều căn bệnh hiểm nghèo như tim mạch, ung thư, tiểu đường và một số bệnh truyền nhiễm mới phát hiện Bệnh tim mạch vẫn là nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới, với khoảng 17,5 triệu người mất mạng mỗi năm theo số liệu công bố trong Ngày Tim mạch thế giới (28/09/2008) Tại Việt Nam, thống kê của Bộ Y tế cho thấy tỷ lệ mắc và tử vong do các bệnh tim mạch ở các bệnh viện trên toàn quốc còn ở mức cao Ở Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã có nhiều biện pháp hỗ trợ cũng như điều trị bệnh tim mạch nhưng khả năng phục hồi của bệnh nhân còn rất thấp Vì vậy, việc tìm ra một liệu pháp chữa trị mới cho các bệnh tim mạch đang trở nên cấp thiết.
Trên thế giới, công nghệ tế bào gốc đang được ứng dụng ngày càng phổ biến trong nghiên cứu y sinh học Từ kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng, liệu pháp tế bào gốc cho các bệnh tim mạch cho thấy nhiều triển vọng điều trị Tế bào tiền thân nội mô (EPC) được xác định là một loại tế bào gốc đơn năng có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào nội mô trưởng thành và tham gia vào quá trình hình thành cũng như sửa chữa mạch máu Vì vậy, nghiên cứu sử dụng tế bào gốc nội mô trong điều trị các bệnh tim mạch mở ra những chiến lược chữa trị đầy hứa hẹn.
Ba nguồn chính cung cấp tế bào tiền thân nội mô (EPC) cho nghiên cứu và điều trị là tủy xương, máu ngoại vi và máu cuống rốn Tuy vậy, việc thu nhận EPC từ tủy xương và máu ngoại vi có hạn chế: quá trình lấy mẫu gây đau cho bệnh nhân và lượng EPC thu được không nhiều Ngược lại, máu cuống rốn là nguồn giàu tế bào gốc và tế bào tiền thân, bao gồm EPC, và quá trình thu nhận máu cuống rốn khá dễ dàng và không vi phạm các chuẩn mực đạo đức.
Mặc dù máu cuống rốn có tiềm năng to lớn trong việc thu nhận EPC, việc xây dựng quy trình thu nhận và định danh EPC vẫn còn đang gây nhiều tranh cãi Hiện nay, ở nhiều nước, sự khác biệt về chuẩn mực thu thập, xử lý và đánh giá EPC dẫn tới thiếu sự đồng nhất về dữ liệu và chất lượng mẫu Những thách thức chính liên quan đến an toàn, đạo đức và công nghệ tách chiết cũng làm phức tạp quá trình chuẩn hóa EPC Để tối ưu hóa tiềm năng ứng dụng và hỗ trợ các quyết định đầu tư nghiên cứu, cần có hướng dẫn chuẩn hóa về quy trình thu gom, bảo quản và xác định EPC, cùng với khung pháp lý phù hợp.
Việt Nam chúng tôi vẫn chưa thấy có công trình nghiên cứu nào về tế bào tiền thân nội mô
Do những vấn đề được nêu, chúng tôi thực hiện đề tài khóa luận mang tựa đề "Nghiên cứu thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người" với mục tiêu đóng góp cho các nghiên cứu lâm sàng trong tương lai Nghiên cứu nhằm tối ưu hóa quy trình thu nhận và phân lập tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn, đánh giá đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng lâm sàng của chúng Kết quả dự kiến sẽ cung cấp nguồn tế bào nội mô có triển vọng cho các ứng dụng điều trị và tái tạo, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của liệu pháp tế bào và các nghiên cứu lâm sàng liên quan.
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
Thu nhận được tế bào tiền thân nội mô từ máu cuố ng rốn người
Thu nhận tế bào đơn nhân bằng 2 phương pháp
- Ly tâm gradient nồng độ với Percoll
Khảo sát nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô trong 4 loại môi trường:
- M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF (Growth Factors)
- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS
- EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS +GF
- Thu nhận được quần thể tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người
- Nuôi c ấy được các tế bào tiền thân nội mô ứng viên khỏe mạnh
Xây dựng được quy trình thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người có hiệu quả nhất.
QUAN TÀI LIỆU
TẾ B ÀO GỐC
Tế bào gốc là những tế bào chưa hoặc đang trong quá trình biệt hóa, tồn tại trong mô sống và có khả năng biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa với chức năng sinh lý cụ thể Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới và duy trì các đặc tính riêng biệt, tạo nguồn tế bào có khả năng tái tạo liên tục Nhờ đặc tính tự làm mới và khả năng biệt hóa, tế bào gốc đóng vai trò như hệ thống sửa chữa mô và sinh ra các tế bào chức năng hoạt động bình thường trong cơ thể sinh vật.
Các tế bào gốc khác với các loại tế bào bình thường trong cơ thể Tế bào gốc có các đặc tính chung:
Tính tự làm mới (self-renewal) là khả năng của tế bào tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào nguyên nhiễm mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa, giúp tế bào duy trì nguồn gốc của nó và có khả năng phát triển liên tục mà không bị biệt hóa.
Tiềm năng vô hạn của tế bào gốc là khả năng biệt hóa thành bất kỳ kiểu tế bào trưởng thành nào Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với các tế bào gốc toàn năng (hay tế bào tiền thân), đôi khi được gọi là tế bào gốc, khi chúng có thể phát triển thành các loại tế bào khác nhau trong cơ thể Hiểu rõ giới hạn giữa tế bào gốc toàn năng và các loại tế bào gốc khác giúp làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng của chúng trong y học và nghiên cứu.
Trong thời gian qua, tế bào gốc trưởng thành được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn do những tính năng đặc biệt của chúng Số lượng các tế bào gốc trưởng thành trong cơ thể là rất ít, chẳng hạn 1/10.000 – 15.000 tế bào trong tủy xương là tế bào gốc tạo máu (HSC)
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tế bào gốc trưởng thành có khả năng tăng sinh và biệt hóa (khi được kích thích bởi nhân tố biệt hóa) thành nhiều kiểu tế bào mong muốn Đặc trưng của tế bào gốc trưởng thành là tính đa năng (còn gọi là tính mềm dẻo), đó là khả năng biệt hóa thành nhiều dạng tế bào Đây là đặc tính được ứng dụng nhiều nhất cho mục đích y sinh học
Thông thường, tế bào gốc sinh ra một loại tế bào trung gian trước khi đạt được trạng thái biệt hóa hoàn toàn Giai đoạn này được đại diện bởi tế bào tiền thân, loại tế bào có vai trò cầu nối giữa tế bào gốc và các tế bào đã phân hóa Tế bào tiền thân có khả năng phân hóa giới hạn hơn tế bào gốc, nhưng vẫn đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phát triển và thay đổi chức năng mô Hiểu rõ vai trò của tế bào tiền thân giúp nắm bắt cơ chế biệt hóa và tiềm năng ứng dụng trong y học tái tạo và điều trị bệnh Do đó, nhận diện và nghiên cứu tế bào tiền thân là phần cốt lõi của quá trình nghiên cứu tế bào gốc và phát triển liệu pháp dựa trên phân hóa có kiểm soát.
Trong sinh học tế bào, tế bào tiền thân chỉ có khả năng biệt hóa mà không có khả năng tự làm mới (renewal) Tuy nhiên, tế bào tiền thân của một loại mô trong cơ thể có khả năng biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt của mô đó và góp phần vào quá trình duy trì, tái tạo mô theo nhu cầu sinh lý, dù nguồn gốc tế bào còn giới hạn và phụ thuộc vào môi trường sinh học.
4 năng thay thế các tế bào bị hư hỏng hay các tế bào bị chết của mô đó nhằm duy trì sự thống nhất và chức năng của mô
Trong sinh học, tế bào tiền thân được xem là một dạng tế bào gốc nhờ khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào có liên quan với nhau Ví dụ điển hình là tế bào tiền thân dòng tủy có thể biệt hóa thành các loại tế bào máu khác nhau, như tế bào hồng cầu và tế bào bạch cầu trung tính.
Hình 2.1 Tế bào gốc và tế bào tiền thân 2.1.3 Phân loại [3]
Theo các phân loại được đề nghị dựa trên kết quả mới nhất năm 2008, tế bào gốc được chia thành năm nhóm chính: tế bào gốc phôi từ phôi ở giai đoạn Blastocyst; tế bào gốc nhũ nhi thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối và màng lót dây rốn; tế bào gốc trưởng thành từ cơ thể trưởng thành; tế bào gốc vạn năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem Cells – iPS), có thể hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo với tiềm năng như tế bào phôi do thao tác in vitro trên chính bộ gen đã biệt hóa chức năng; và tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cells – CSC), được coi là nguồn gốc của khối u và chỉ có trong các khối u.
Từ năm nhóm phân lo ại lớn, người ta có thể chia thành các nhóm nhỏ như sau:
Phôi Nhũ nhi Trưởng thành
Morula Blastocyst Rãnh sinh dục
Tế bào gốc nhân tạo
Tế bào gốc ung thƣ
Morula Tế bào mầm phôi
Tủy xương Gan Máu ngoại vi
Sơ đồ 2.1 Một số loại tế bào gốc [3]
2.1.4.1 Cấy ghép tế bào, mô và cơ quan
Hình 2.2 Chiến lƣợc cấy ghép tế bào gốc [5]
Những bệnh có thể được điều trị bằng cấy ghép tế bào ES ở người đã được ghi nhận bao gồm bệnh Parkinson, tiểu đường, chấn thương cột sống, suy thoái tế bào Purkinje, loạn dưỡng cơ Duchenne, bệnh tim và khả năng tái tạo xương.
Với khả năng tăng sinh vô hạn và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, tế bào gốc trở thành nền tảng cho các chiến lược cấy ghép cơ quan Tế bào gốc phôi (ES) có thể được cấy ghép và đã được chứng minh có thể tồn tại, hợp nhất và thực hiện chức năng trong cơ thể người nhận Tuy nhiên, vấn đề then chốt của cấy ghép là phản ứng thải loại miễn dịch, phụ thuộc vào sự biểu hiện của các kháng nguyên tương hợp mô (MHC) để cơ thể phân biệt tế bào của mình với tế bào ngoại lai.
Khả năng bị từ chối miễn dịch của tế bào ES người có thể được giảm thiểu hoặc tránh bằng kỹ thuật di truyền Phương pháp này sử dụng kỹ thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, tức lấy nhân từ tế bào của người nhận (ví dụ da) ghép vào trứng đã loại nhân, sau đó nuôi cấy in vitro đến giai đoạn blastocyst Tế bào ES được thu nhận từ lớp sinh khối bên trong và được điều khiển biệt hóa thành kiểu tế bào mong muốn Kết quả là có thể tạo ra tế bào ES hoặc cơ quan tương thích miễn dịch gần như hoàn toàn với người nhận, từ đó có thể cấy ghép mô hoặc cơ quan Đây là một ứng dụng quan trọng của tế bào gốc.
]Hình 2.3 Chiến lƣợc dùng tế bào gốc trong liệu pháp gen [5]
Các kỹ thuật trong liệu pháp gen (gene therapy) có thể được phát huy tối đa bằng cách sử dụng tế bào gốc biến đổi di truyền như một vector để mang và chuyển gen đến tế bào đích Việc này mở ra triển vọng điều trị nhiều bệnh nhờ tối ưu hóa quá trình vận chuyển và biểu hiện gen Tuy nhiên, liệu pháp gen gặp hai vấn đề lớn: (1) tính an toàn và hiệu quả của quá trình vận chuyển và biểu hiện gen, và (2) sự đáp ứng miễn dịch cùng khả năng kiểm soát biểu hiện gen lâu dài trong cơ thể.
Các rủi ro do hệ thống mang gen có thể gây ra
Sự đáp ứng thải lo ại miễn dịch
Việc sử dụng tế bào gốc để đưa gen vào cơ thể mang lại tiềm năng khắc phục hai khó khăn chính Các tế bào gốc tự thân (myES) được lấy từ các tế bào sinh dưỡng trưởng thành của cơ thể và dùng làm nhân, nhân này được chuyển vào tế bào trứng đã loại bỏ nhân, sau đó tế bào này phát triển thành phôi mới Ở giai đoạn blastocyst, các tế bào mầm ở lớp sinh khối bên trong được thu nhận.
Khác với hệ thống mang gen từ virus tiềm ẩn nhiều rủi ro, tế bào gốc tự thân có rủi ro thấp vì bộ gen của cơ thể chủ được bảo toàn hoàn toàn Vì vậy, các tế bào này không bị thải loại.
SINH HỌC CUỐNG RỐN
2.2.1 Cấu trúc và s ự phát triển của cuống rốn
Cuống rốn được phát triển đầy đủ gồm một tĩnh mạch và hai động mạch, được bao quanh bởi Wharton’s jelly — mô nhầy và mô liên kết gelatin — và sau đó được bao phủ bởi màng ối Có ba vùng được xác định của tế bào nền và chất nền: lớp màng ối, Wharton’s jelly và môi trường, cuối cùng là ngoại mạc quanh các mạch Cấu trúc và thành phần của dây rốn giàu chất nền đàn hồi và nguyên bào sợi cơ, giúp bảo vệ mạch khỏi sự nén và làm cho trao đổi giữa cuống rốn và dịch ối trở nên dễ dàng.
Cuống rốn được hình thành từ trung mô ngoại phôi Khi túi phôi phát triển, các tế bào từ lớp ICM biệt hóa thành epiblast Từ epiblast gần trung bì ngoại phôi hình thành trung bì ngoại phôi, là nhóm tế bào trung bì sớm di cư qua rãnh nguyên thủy Trung bì ngoại phôi tiếp tục tăng lên trong giai đoạn phát sinh phôi và tham gia vào hình thành vỏ phôi (màng ối), ngoại bì màng ối và noãn hoàng nội bì Do đó, trung bì ngoại phôi đã tham gia vào màng ối, túi noãn hoàng và sau này là cuống rốn.
Các tế bào mầm sinh dục (EG) và tế bào gốc tạo máu sớm phát sinh từ trung bì ngoài phôi Sự hình thành máu diễn ra trong túi noãn hoàng từ ngày thứ 8 đến 8,5 sau thụ tinh, khi các tế bào gốc máu trong túi noãn hoàng cung cấp nguồn tế bào đầu tiên cho quá trình tạo máu của phôi.
9 máu sớm, trong suốt quá trình phát triển và tuần hoàn khắp phôi để cung cấp oxi, chất dinh dưỡng
2.2.2 Một số thông tin về tế bào máu cuống rốn [1], [3], [4]
Máu cuống rốn (máu dây rốn, máu bánh nhau) là nguồn dưỡng chất và oxy cho thai nhi qua tuần hoàn thai kỳ Sau khi sản phụ sinh, phần máu còn lại trong dây rốn và bánh nhau thường được coi là chất thải sinh học tại các bệnh viện phụ sản, nhưng nhờ tiến bộ khoa học, nguồn máu cuống rốn này được khai thác như một kho tế bào gốc dồi dào có ứng dụng trong điều trị và nghiên cứu y học.
Theo nghiên cứu của Wintrobe (Clinical Hematology – sixth edition) và Bệnh viện Truyền máu và Huyết học TP Hồ Chí Minh, máu cuống rốn có các chỉ số huyết học ở mức bình thường và được trình bày cụ thể trong bảng tham khảo Những chỉ số này cho thấy máu cuống rốn ở trạng thái ổn định với đặc điểm huyết học phù hợp cho sơ sinh, bao gồm các giá trị liên quan đến hematocrit, hemoglobin và số lượng tế bào máu nói chung Việc nắm bắt các chỉ số huyết học bình thường của máu cuống rốn giúp đánh giá nhanh tình trạng sức khỏe của trẻ sơ sinh và đảm bảo chất lượng mẫu máu cho các xét nghiệm sau đó.
Bảng 2.1 Các chỉ số huyết học thông thường của máu cuố ng rốn [1]
Các chỉ số Wintrobe Bệnh viện Truyền máu & Huyết học Đơn vị tính
- Tế bào gốc máu cuống rốn: Người ta phát hiện trong máu cuống rốn có những tế bào gốc như sau:
Tế bào gốc tạo máu (Hematopoiteic stem cell _ HSC)
Tế bào gốc trung mô (Mensenchymal stem cell _ MSC)
Tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn (Unrestricted somatic stem cell _ USSC)
Tế bào gốc giống phôi được thu nhận từ máu cuống rốn (Cord blood – derived embryonic – like stem cell _ CBE)
Tế bào gốc tiền thân đa năng được thu nhận từ máu cuống rố n (Cord blood multipotent progenitor cell _ CBMPC)
Tế bào tiền thân nội mô (Endothelial progenitor cell _ EPC)
2.2.3 Những ƣu thế từ tế bào gốc máu cuống rốn [1], [4]
Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu tế bào gốc cuống rốn, trong đó có tế bào gốc trung mô, bởi những ưu điểm nổi bật mang lại tiềm năng ứng dụng lớn trong y học Tế bào gốc trung mô có khả năng phân hoá đa năng, tính tương thích cao và an toàn trong nhiều loại liệu pháp tế bào, làm nền tảng cho các nghiên cứu lâm sàng và phát triển liệu pháp cá nhân hóa.
- Không vi phạm y đức và tín ngưỡng tôn giáo các nước hay gây tổn thương cho cả mẹ và con trong quá trình thu giữ dây rốn
Máu dây rốn được thu nhận tại bệnh viện trước khi nhau thai bị loại bỏ; do đó, việc sử dụng tế bào gốc từ máu dây rốn không gây tranh cãi.
Nguồn cung cấp máu cuống rốn có tiềm năng rất lớn cho y học và nghiên cứu tế bào gốc Mỗi năm trên thế giới có khoảng 100 triệu trẻ em sinh ra, và nếu thu giữ máu cuống rốn cho từng bé với khoảng 100 ml mỗi mẫu, chúng ta có thể tích lũy một lượng tế bào gốc khổng lồ để phục vụ cho cấy ghép và các nghiên cứu trị liệu.
- Các tế bào từ cơ thể mới sinh này thường ít mang các mầm bệnh
- Quá trình thu nhận, bảo quản đông lạnh thuận lợi và hiệu quả
- Máu cuống rốn có thể được bảo quản hơn 15 năm và vẫn giữ được chức năng quan trọng
- Chúng biểu hiện tương tự như các tế bào gốc tủy xương trong việc biệt hóa thành nhiều kiều tế bào khác
Kỹ thuật nuôi cấy không quá phức tạp hay tốn kém, vì vậy các nước đang phát triển có thể sớm áp dụng công nghệ này trong y học Máu cuống rốn được xem là nguồn chất liệu tối ưu để chuyển các gen lành tính vào bệnh nhân mắc các bệnh di truyền, mở ra triển vọng điều trị an toàn và hiệu quả hơn.
Kháng nguyên và miễn dịch của tế bào gốc máu cuống rốn ở mức thấp khiến nguy cơ thải ghép thấp, làm cho ghép đồng loại từ tế bào gốc máu cuống rốn phù hợp mà không cần sử dụng thuốc ức chế miễn dịch; khi so sánh với ghép từ tủy xương, tần suất và mức độ nghiêm trọng của GVHD (Graft Versus Host Disease) giảm đáng kể.
TẾ B ÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ MÁU CUỐNG RỐN
Tế bào tiền thân nội mô (EPC) được xác định là các tế bào tiền thân đơn năng có tiềm năng biệt hóa hạn chế hơn so với một số tế bào gốc khác, nhưng chúng vẫn mang đặc tính của tế bào gốc như khả năng tự làm mới EPC có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô trưởng thành, từ đó tham gia hình thành mạch máu mới, tái tạo cơ tim và sửa chữa mạch máu Đồng thời, EPC cũng có thể hỗ trợ cho sự phát triển khối u.
2.3.2 Đặc điểm của tế bào tiền thân nội mô
Hình 2.4 Hình thái của tế bào tiền thân nội mô [22]
Về mặt hình thái, tế bào tiền thân nội mô sau một tuần nuôi cấy có dạng tròn với kích thước khác nhau Từ tuần thứ hai đến tuần thứ ba, các tế bào chuyển sang hình dạng thuôn dài hoặc hình viên sỏi, cho thấy sự biến đổi hình thái theo quá trình nuôi cấy.
2.3.2.2 Các marker bề mặt của EPC [2]
HSC và EPC có nguồn gốc chung từ u nguyên bào mạch, vì vậy trong tủy xương các tế bào này mang nhiều yếu tố xác định như CD34, CD133, Sca-1, c-Kit và Tie-2 (Khakoo và Finkle, 2005) Tuy nhiên khi đi vào hệ tuần hoàn, chúng biểu hiện các marker của tế bào nội mô như von Willebrand factor (vWF) và VE-cadherin (Hristov và Weber, 2004) EPC nguyên thủy có thể được xác định tốt nhất dựa trên tổ hợp CD133+, CD34+, Flk-1+ (VEGFR-2) Trong đó hai marker CD34+ và CD133+ được xem là đặc trưng nhất cho tế bào tiền thân nội mô.
2.3.3 Nguồn tế bào tiền thân nội mô [3], [7]
Trước năm 1997, các tế bào tiền thân nội mô (EPC) được xem là tồn tại chỉ trong phôi thai và được gọi là nguyên bào mạch hoặc EPC phôi Những tế bào này có thể được thu nhận từ tế bào trung mô ngoại phôi, có khả năng tăng sinh, di cư và biệt hóa thành các tế bào dòng nội mô, nhưng cho tới thời điểm đó chúng chưa mang các marker đặc trưng của tế bào nội mô trưởng thành.
EPC còn được tìm thấy trong tủy xương, máu ngoại vi và máu cuống rốn Máu cuống rốn là nguồn giàu tế bào EPC, chứa tỷ lệ cao các tế bào CD133+ và CD34+, tương tự máu ngoại vi ở người trưởng thành, và chúng có thể biệt hóa thành tế bào nội mô ex vivo Khi so sánh số lượng tập đoàn tế bào nội mô thu được từ máu cuống rốn với máu ngoại vi ở người trưởng thành, kết quả cho thấy các tế bào EC từ EPC có mức hoạt động telomerase cao, do đó có khả năng mở rộng các quần thể nhị cấp và tam cấp.
Gần đây, EPC được xác định có mặt trong các thành mạch máu, cụ thể tại các tế bào nội mô tĩnh mạch cuống rốn người (HUVEC) và tế bào nội mô động mạch chủ người (HAEC) Đây là phát hiện quan trọng, vì EPC có trong HUVEC và HAEC được cho là thuộc nhóm tế bào nội mô trưởng thành, tuy nhiên chúng không có khả năng biệt hóa đa dạng.
Hình 2.5 Các nguồn gốc của EP C [7]
Lá lách là một cơ quan chứa nhiều EPC (tế bào gốc nội mô) Những tế bào này có thể tăng cường tái tạo nội mạch và làm giảm hình thành khối xơ vữa sau khi chấn thương động mạch cảnh Khi EPC nguồn gốc từ lá lách được truyền tĩnh mạch vào mô hình chuột bị cắt bỏ lá lách, người ta thấy các tế bào di chuyển đến vùng thương tổn, cho thấy tiềm năng của EPC từ lá lách trong việc hỗ trợ phục hồi mạch và giảm nguy cơ rối loạn mạch máu.
Hiện tượng thứ 13 chỉ xuất hiện khi cơ quan chủ bị loại bỏ Giả thiết cho rằng việc cắt bỏ lá lách kéo dài thời gian tuần hoàn của EPC và có thể làm thay đổi các marker trên bề mặt tế bào do các tín hiệu từ vùng bị thương.
Trong các mô hình chuột ghép ruột và gan, người ta phát hiện số lượng lớn tế bào EPC ở ruột và gan Các EPC có nguồn gốc từ máu ngoại vi ở gan có khả năng gắn kết với các cấu trúc mạch máu, từ đó tăng cường hình thành mạch mới và cải thiện hồi phục lưu lượng máu ở bệnh thiếu máu cục bộ.
Có nhiều báo cáo cho thấy tế bào gốc trưởng thành được thu từ mô mỡ của người có thể biệt hóa in vitro thành tế bào nội mô Những tế bào này có khả năng tập trung tại vùng bị thiếu máu, tăng mật độ mao mạch và cải thiện sự hình thành mạch máu mới Tuy nhiên, các nghiên cứu tương lai cần làm rõ đặc tính và cơ chế liên quan đến sự biệt hóa của chúng để định hướng ứng dụng và khai thác tiềm năng này.
Tiềm năng tái tạo của tế bào tiền thân nội mô (tế bào EPC) đã được khảo sát toàn diện; trong điều kiện in vitro, EPC và các tế bào gốc liên quan có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt của cơ quan, trong khi ở điều kiện in vivo cấy ghép các tế bào này có thể tái tạo cấu trúc và chức năng của hệ thống cơ quan, mở đường cho các ứng dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh tim mạch EPC có thể biệt hóa thành tế bào cơ tim khi được đồng nuôi cấy với tế bào tim thai chuột, và tiêm EPC tách từ máu ngoại vi cùng với tăng sinh in vitro có thể kích thích tân tạo mạch trong các mô hình động vật bị thiếu máu cục bộ ở chi.
Mặc dù có tiềm năng và hứa hẹn trong ứng dụng thuốc tái tạo, liệu pháp cấy ghép EPC sơ cấp vẫn bị hạn chế bởi sự khan hiếm quần thể EPC trong hệ thống mạch máu và sự suy giảm EPC ở các nhóm đối tượng như người cao tuổi, người mắc tiểu đường và người bị tăng cholesterol huyết, tạo thành các giới hạn chủ yếu của liệu pháp này.
Bên cạnh đó, người ta có sử dụng các liệu pháp gen để nâng cao ứng dụng của EPC Sự biến đổi di truyền của các EPC nhằm biểu hiện tốt các nhân tố phát triển mạch máu, kích thích hoạt động truyền tín hiệu của đáp ứng tạo mạch và trẻ hóa hoạt tính sinh học hay kéo dài đời sống của các EPC sẽ đóng góp vào một chiến lược tiềm năng, qua đó có thể giải quyết được các giới hạn của liệu pháp cấy ghép EPC
Tế bào tiền thân nội mô còn được ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ mô để cải thiện tính tương thích sinh học các mảnh ghép mạch Các mảnh ghép nhân tạo được nuôi với các tế bào CD34 + tự thân từ tủy xương và sau đó đồng cấy vào động mạch chủ, kết quả cho thấy có sư gia tăng việc hình thành nội mô đồng thời có cả sự hình thành mạch so với đối chứng.
NUÔI CẤY TẾ B ÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN
Các yếu tố liên quan đến mẫu máu, như thể tích mẫu và thời điểm lấy mẫu, cùng với điều kiện nuôi cấy, vật liệu, mật độ nuôi cấy và công thức môi trường, ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh và khả năng biệt hóa của EPC; tối ưu các yếu tố này giúp tăng hiệu quả nuôi cấy EPC và nâng cao tiềm năng ứng dụng của tế bào nội mô tiền thân trong nghiên cứu và lâm sàng.
2.4.1 Điều kiện nuôi cấy [1],[2] Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn thể hiện qua các yếu tố sau:
Khác với tế bào thực vật và vi sinh vật, hầu hết tế bào cần trải rộng trên một giá thể trong quá trình tăng trưởng Trong cơ thể (in vivo) là cấu trúc mô, còn trong nuôi cấy in vitro là các giá thể nhân tạo Đặc tính này được gọi là “tính cần giá thể” Các đĩa, bình nuôi bằng nhựa được sử dụng phổ biến hiện nay có hai thuận lợi chính.
- Giá thể có bề mặt phù hợp cho tế bào bám và thấm được O 2 , CO 2
- Nhựa mỏ ng rất thích hợp cho việc quan sát tế bào, mô dưới kính hiển vi quang học hay điện tử
Các yếu tố tăng cường sự bám dính là các yếu tố được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng khả năng tế bào gắn kết với giá thể, từ đó nâng cao khả năng sống sót và phát triển của tế bào Việc tăng cường bám dính giúp ổn định sự tiếp xúc giữa tế bào và giá thể, thúc đẩy phân chia, định hướng phân hóa và cải thiện hiệu quả nuôi cấy cũng như tái tạo mô Các yếu tố này thường được sử dụng dưới dạng các protein bám dính tự nhiên như fibronectin, laminin, collagen và vitronectin, hoặc các chất nền tổng hợp như poly-L-lysine và các hệ nền hydrogel, nhằm tăng diện tích tiếp xúc và lực bám của tế bào lên giá thể.
Chất nền ngoại bào (ECM) là thành phần nền cơ bản của liên kết mô, có ở mọi cơ quan sống và chủ yếu gồm collagen, laminin và fibronectin Việc phủ các thành phần ECM lên bề mặt dụng cụ nuôi cấy giúp tăng cường sự bám dính của tế bào bằng cách cung cấp các điểm gắn cho tế bào Tế bào có các thụ thể (receptor) gắn với các protein ECM, từ đó có thể bám dính lên bề mặt dụng cụ nuôi đã được xử lý với ECM.
Huyết thanh chứa các yếu tố bám dính ở dạng hòa tan như fibronectin, đóng vai trò quan trọng trong việc giúp tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy tốt hơn Fibronectin nhanh chóng bám lên đĩa nhựa nuôi cấy và biến đổi bề mặt nuôi, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám chắc và phát triển.
Thành phần quan trọng của pha khí là O 2 và CO 2
Oxy là yếu tố sống còn cho tế bào nuôi cấy Nhu cầu về O2 của tế bào nuôi cấy thấp hơn nhu cầu O2 của mô sống, vì tế bào trong môi trường nuôi nhân tạo không tiếp xúc với lượng oxy như mô cơ thể Do đó, áp suất O2 trong tủ nuôi tế bào thường thấp hơn áp suất O2 trong không khí, và nồng độ O2 được kiểm soát để phù hợp với từng loại tế bào và mục đích nuôi cấy Việc điều chỉnh đúng nồng độ và áp suất oxy giúp tối ưu hoá quá trình phát triển và chất lượng tế bào nuôi cấy.
Trong tủ nuôi tế bào, O2 phổ biến được sử dụng ở mức khoảng 16–20% Độ sâu của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến tỷ lệ oxy khuếch tán vào tế bào, và khuyến cáo nên giữ độ sâu của môi trường khoảng 2–5 mm (0,2–0,5 ml/cm²) trong nuôi cấy tĩnh.
Trong môi trường nuôi, carbonic đóng vai trò phức tạp do sự tương tác giữa CO2 hòa tan, pH và nồng độ HCO3-; các yếu tố này tác động lẫn nhau để hình thành điều kiện nước nuôi tối ưu Áp suất CO2 không khí ảnh hưởng trực tiếp đến nồng độ CO2 hòa tan và quá trình này bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Vì vậy, việc quản lý chất lượng nước cần theo dõi CO2 hòa tan, pH và nồng độ HCO3- cùng với yếu tố nhiệt độ để duy trì cân bằng sinh học và hỗ trợ sự phát triển của sinh vật nuôi.
Việc CO₂ biến đổi sang HCO₃⁻ và ngược lại có thể làm thay đổi pH của môi trường nuôi cấy, nên nồng độ CO₂ trong tủ nuôi đóng vai trò quyết định trong việc duy trì pH ổn định Vì vậy, kiểm soát nồng độ CO₂ là cách hiệu quả để ổn định pH của môi trường nuôi cấy Nồng độ CO₂ ở mức 5% là phù hợp với hầu hết các tế bào nuôi cấy, bao gồm EPC, giúp tối ưu hóa sự phát triển và chất lượng tế bào Việc thiết lập và duy trì mức CO₂ 5% có thể cải thiện độ ổn định của pH và hiệu suất nuôi cấy cho các dòng tế bào khác nhau.
Nhiệt độ đề nghị để nuôi các dòng tế bào của người và động vật máu nóng là
37 0 C Nhiệt độ cao thường gây ảnh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ thấp
Tế bào EPC sau khi phân lập từ máu cuống rốn được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 0 C; 5% CO 2
2.4.1.4 pH pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt.[2]
Hầu hết các dòng tế bào mọc tốt ở pH 7,4 Tế bào gốc máu cuống rốn tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4 – 7,7
2.4.1.5 Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của chất nguyên sinh ở người kho ảng 290 - 310 mOsm/kg Đây là điều kiện tối ưu cho nuôi cấy in vitro các tế bào, mô người
Môi trường nuôi cấy tế bào được thiết kế để mô phỏng thành phần dịch lỏng trong cơ thể người, gồm muối, carbohydrate, vitamin, axit amin, các tiền chất biến dưỡng, yếu tố tăng trưởng, hormone và các yếu tố vi lượng Việc tái tạo điều kiện sinh học tự nhiên này giúp tế bào duy trì sự sống và phát triển tối ưu trong quá trình nuôi cấy.
Mỗi thành phần trong môi trường giữ những chức năng khác nhau:
Muối vô cơ đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào và điều chỉnh điện thế màng nhờ các ion Na+, K+ và Ca++ Những ion này có mặt trong môi trường tế bào và đảm nhiệm vai trò liên kết, đồng thời hoạt động như cofactors cho nhiều enzyme, giúp các quá trình sinh học diễn ra bình thường Ngoài ra, muối vô cơ duy trì cơ chế vận chuyển chất qua màng bằng cách tham gia vào các transporter và gradient ion, từ đó đảm bảo tế bào nhận dưỡng chất và loại bỏ chất thải.
Đường là nguồn năng lượng chính của tế bào, chủ yếu là glucose và galactose, hai loại đường được sử dụng phổ biến nhất; trong một số môi trường nuôi cấy, maltose hoặc fructose cũng có thể được dùng Mức nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy giúp hỗ trợ sự phát triển của nhiều loại tế bào khác nhau.
Nguồn bổ sung dưỡng chất, năng lượng cho tế bào là các amino acid thiết yếu như cysteine, tyrosine… và các amino acid không thiết yếu như glutamine
Trong nuôi cấy tế bào, huyết thanh là nguồn cung cấp vitamin thiết yếu giúp duy trì sự phát triển và chức năng của tế bào Ngoài ra, môi trường nuôi cấy có thể được bổ sung trực tiếp bằng các vitamin phù hợp để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng Nhiều vitamin, đặc biệt là nhóm B, đóng vai trò thiết yếu cho sự phát triển và khuếch đại tế bào Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào bao gồm riboflavin, thiamine và biotin.
Thành phần này rất quan trọng trong môi trường không huyết thanh Các protein và peptide thường sử dụng là albumin, transferrin, fibronectin và fetuin
PHƯƠNG PHÁP FLOW CYTOMETRY
Flow cytometry là kỹ thuật đo và xử lý đồng thời nhiều đặc tính sinh lý của các phần tử đơn lẻ, thường là tế bào, khi chúng di chuyển qua chùm tia sáng Tín hiệu từ tế bào bị kích thích bởi ánh sáng được cảm nhận bởi detector và truyền tới máy tính để xử lý, cho ra thông tin về thuộc tính tế bào Các thuộc tính có thể đo được gồm kích thước của phân tử, độ phức tạp bên trong cấu trúc, tính chất hạt của phân tử và mật độ huỳnh quang Flow cytometry thường được dùng để chẩn đoán các rối loạn sức khỏe, đặc biệt là bệnh ung thư máu, nhưng còn nhiều ứng dụng khác trong nghiên cứu và thực hành lâm sàng Một ứng dụng phổ biến khác là phân loại vật lý các đơn vị dựa trên tính năng để thu được các quần thể mục tiêu.
Thiết bị flow cytometry dựa vào sự phát quang huỳnh quang đầu tiên được phát triển vào năm 1968 bởi Wolfgang Göhde từ Đại học Münster và được thương mại hóa ở Đức vào cuối năm 1968/1969 bởi Partec thông qua Phywe AG tại Göttingen Khi đó, các phương pháp hấp thu vẫn tiếp tục được ưa chuộng bởi các nhà khoa học nhiều hơn so với các phương pháp phát quang huỳnh quang Sau đó, các thiết bị flow cytometry tiếp tục được cải tiến và mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực sinh học và y học.
Key milestones in the early development of flow cytometry include the Cytofluorograph (1971) by Bio/Physics Systems Inc., which later became Ortho Diagnostics, and Partec's PAS 8000 (1973) The first FACS instrument was released by Becton Dickinson in 1974, followed by the ICP 22 (1975) from Partec/Phywe and Coulter's Epics system in 1977–78.
Tên gọi ban đầu của công nghệ đo tế bào bằng flow là “pulse cytophotometry” (tiếng Đức: Impulszytophotometrie) Chỉ 20 năm sau, vào năm 1988, tại một hội nghị của Hiệp hội Kỹ sư sáng chế Mỹ (American Engineering Foundation) được tổ chức ở Pensacola, Florida, phương pháp này đã được đổi tên thành “flow cytometry” và thuật ngữ này từ đó nhanh chóng trở nên phổ biến.
Một chùm ánh sáng có bước sóng đơn, thường là laser, chiếu vào một dòng chất lỏng chứa tế bào Các detector được bố trí để đo ánh sáng bị phân tán và phát quang: FSC (Forward Scatter) nằm trên đường đi của chùm sáng, SSC (Side Scatter) nằm vuông góc với nó, cùng với một hay nhiều ống PMT nhận ánh sáng phát quang từ tế bào Mỗi tế bào có kích thước từ 0,2 đến 150 μm đi qua chùm sáng và phân tán ánh sáng, từ đó cung cấp thông tin về kích thước và nội dung tế bào Chất nhuộm huỳnh quang gắn trên tế bào có thể được kích thích để phát sáng ở bước sóng dài hơn so với nguồn sáng ban đầu, hỗ trợ phân tích đặc tính sinh học của tế bào trong phân tích dòng chảy.
Việc kết hợp giữa ánh sáng tán xạ và huỳnh quang được các máy dò ghi nhận và phân tích biến thiên độ sáng ở từng detector, cho phép suy ra cấu trúc vật lý và hóa học của mỗi tế bào FSC tỷ lệ với diện tích bề mặt tế bào, từ đó nhận diện các tế bào có kích thước lớn hơn ngưỡng mà không cần xét đến đặc tính phát quang Nói cách khác, FSC giúp phân biệt tế bào dựa trên sự khác biệt về kích thước Bên cạnh đó, SSC tỷ lệ với tính chất hạt và mức độ phức tạp bên trong tế bào, cung cấp thông tin về độ phức tạp nội tại của tế bào (granularity).
Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động của Flow cytometry[18]
Flow cytometry là một thiết bị tương tự kính hiển vi, nhưng khác ở chỗ thay vì ghi lại hình ảnh của từng tế bào, flow cytometry tự động định lượng hàng ngàn tế bào dựa trên các thông số đã được thiết lập sẵn Nhờ đó, nó cho phép đo nhiều đặc tính tế bào đồng thời, từ kích thước và độ phức tạp đến tín hiệu huỳnh quang của tế bào được gắn nhãn, giúp phân tích mẫu nhanh chóng và chính xác, phù hợp cho các ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng.
Kỹ thuật Flow cytometry được thực hiện trên thiết bị Flow cytometer gồm 3 bộ phận chính:
Hệ thống dòng chảy chất lỏng được thiết kế để vận chuyển các phần tử qua một tia laser nhằm phân tích chính xác đặc tính của mẫu Để đạt được mức độ chiếu sáng tối ưu, hệ thống cần thỏa mãn hai điều kiện: (1) lưu lượng dòng chảy đồng nhất và ổn định để các phần tử tiếp xúc với tia laser ở cùng điều kiện chiếu sáng; (2) điều chỉnh và kiểm soát chính xác vị trí, hướng và cường độ của tia laser sao cho vùng phân tích luôn nằm trong trường sáng tối ưu và hạn chế nhiễu từ sự phân bố ánh sáng.
Dòng lỏng chịu trách nhiệm vận chuyển các phần tử được đặt ở vị trí trung tâm của chùm tia laser, bảo đảm sự tiếp cận và di chuyển chính xác của từng phần tử Trong quá trình vận hành, chỉ một phần tử được đưa qua chùm tia laser tại mỗi thời điểm nhất định, nhằm kiểm soát quá trình xử lý và tối ưu hóa hiệu suất.
Hệ thống quang học bao gồm nguồn tia laser và các bộ phận lọc quang học, với tia laser chiếu sáng các phần tử trong chất lỏng và bộ phận lọc quang học điều khiển tín hiệu ánh sáng đến các bộ phận cảm nhận Trong ứng dụng Flow cytometry, tia laser argon thường được dùng vì phát ra ánh sáng ở bước sóng 488 nm và có khả năng kích thích sự phát quang của các chất huỳnh quang, từ đó các tín hiệu cảm biến có thể được phân tích để xác định đặc tính của mẫu.
21 thích nhiều phân tử phát huỳnh quang Một trong những phân tử phát huỳnh quang thưởng được sử dụng là fluorescein isothiocyanate (FITC)
Hệ thống điện tử tiếp nhận tín hiệu ánh sáng từ cảm biến, chuyển đổi chúng thành tín hiệu điện tử và được máy tính xử lý để tạo ra dữ liệu và kết quả phân tích.
Các thiết bị hiện đại trong phân tích tế bào thường tích hợp nhiều laser và đầu dò huỳnh quang, với kỷ lục thương mại hiện tại là 4 laser và 18 đầu dò huỳnh quang cho một công cụ Việc tăng số lượng đầu dò laser cho phép đánh dấu đồng thời nhiều kháng thể hơn và nhận diện quần thể mục tiêu qua các marker bề mặt của chúng một cách chính xác hơn Bên cạnh đó, một số thiết bị có thể ghi lại hình ảnh kỹ thuật số của từng tế bào, hỗ trợ phân tích vị trí tín hiệu huỳnh quang ở bên trong hoặc trên bề mặt tế bào.
2.5.4 Phương pháp phân loại tế bào dựa trên sự phát huỳnh quang (FACS) [2]
FACS là một dạng đặc thù của phương pháp flow cytometry, dùng để phân loại một hỗn hợp đồng nhất các tế bào sinh học thành hai hoặc nhiều loại dựa trên sự tán xạ ánh sáng và đặc điểm huỳnh quang của tế bào FACS là công cụ khoa học đắc lực, vì nó cho phép thu thập nhanh, khách quan và định lượng tín hiệu huỳnh quang từ tế bào đơn, đồng thời phân loại theo các tính chất vật lý của tế bào mà chúng ta quan tâm Sự phân loại tế bào đầu tiên được thực hiện bởi Mack Fulwyler nhờ phát minh công nghệ này, mở đường cho nhiều ứng dụng chẩn đoán và nghiên cứu tế bào hiện đại.
Vào năm 1965, nguyên lý Coulter volume được áp dụng cho một kỹ thuật tương đối khó khăn và hiện nay không còn được sử dụng trên các thiết bị hiện đại Kỹ thuật này sau đó được mở rộng bởi Len Herzenberg, người đã có những đóng góp đáng kể cho sự phát triển của phương pháp flow cytometry Nhờ những đóng góp đó, Herzenberg được trao giải Kyoto năm 2006 cho những đóng góp của ông vào sự phát triển của flow cytometry.
Trong các máy flow cytometry, bộ phận bắt tế bào được thiết kế khác nhau tùy loại máy Máy FACSCalibur (kiểu benchtop) sử dụng một thiết bị cơ học gọi là ống bắt để phân loại tế bào; ống bắt di chuyển ra vào qua dòng mẫu để thu nhận các tế bào quan tâm với tốc độ được điều khiển, giúp quá trình phân loại diễn ra hiệu quả.
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
3.1.1 Mẫu vật Đối tượng nghiên cứu là mẫu máu cuống rốn người được cung cấp từ Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem và Bệnh viện Phụ sản Hùng Vương Mẫu máu thu nhận cần đ ảm bảo những điều kiện sau:
- Cuống rốn được thu nhận từ trẻ sơ sinh khỏe mạnh, đủ tháng
- Cuống rốn còn nguyên vẹn
- Mẫu máu sạch, được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV và các bệnh khác
Máu được thu nhận ngay sau khi sản phụ sinh và không được để mẫu máu tiếp xúc với không khí quá lâu; mẫu máu chỉ có chất lượng sử dụng tốt khi được bảo quản và xử lý trong vòng 6 giờ kể từ thời điểm sinh.
Hỡnh 3.1 (a) Bỡnh nuụi, (b) Màng lọc vụ trựng 0,2àm , (c) Đĩa 6 giếng
- Bình Duran 50 ml, 100 ml, 250 ml (Schotte, Đức)
- Erlen, becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 1000 ml
- Bình Roux 25 cm 2 , đĩa nuôi 6 giếng(Nunc, Đức)
- Buồng đếm hồng cầu (Đức)
- Đầu típ các lo ại
- Màng lọc vụ trựng 0,2 àm (Minisart)
- Buồng thao tác vô trùng (Nuaire, Đức)
Hình 3.2 (a) Autoclave, (b) Tủ nuôi tế bào, (c) Kính hi ển vi đảo ngƣợc
(d) Tủ cấy vô trùng, (e) Máy ly tâm, (f) Máy F ACS- Calibur
- Tủ lạnh (4 0 C) (LG GR 051SF)
- Tủ nuôi mô và tế bào (Incusafe, Sanyo)
- Kính hiển vi đ ảo ngược (Olympus CX40)
- Kính hiển vi vi thao tác (Nikon eclipse Te300, Nikon Narishige)
3.1.4 Hóa chất và môi trường thí nghiệm
PBS - (Không có ion Ca 2+ và Mg 2+ )/KS
- Nước cất hai lần đủ 1 lít
- Hấp vô trùng ở 121 0 C, trong 30 phút
- Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng tối đa trong 1 tháng
Dung dịch li giải hồng cầu
- Khử trựng: lọc (Màng lọc vụ trựng 0,2 àm)
- Bảo quản ở 4 0 C, sử dụng tối đa trong 3 tuần
Môi trường M199 là loại môi trường phù hợp để nuôi nhiều loại tế bào gốc, là sự kết hợp của nhiều loại vitamin và axit amin thiết yếu cho sự phát triển của tế bào Tuy nhiên, với các tế bào nuôi cấy dài hạn, cần bổ sung huyết thanh để duy trì sự phát triển Môi trường này được ứng dụng rộng rãi trong vi sinh học, sản xuất vaccine và nuôi cấy tế bào ở giai đoạn sơ cấp.
Môi trường EBM-2 là một thành phần chủ chốt của môi trường EGM-2 dùng để nuôi cấy tế bào nội mô người in vitro Nó cung cấp các thành phần dinh dưỡng và các yếu tố tăng trưởng như EGF, IGF, VEGF cần thiết cho sự phát triển của tế bào nội mô Nói cách khác, EBM-2 là một môi trường chứa các muối, axit amin, vitamin và các thành phần cơ bản khác hỗ trợ nuôi cấy tế bào nội mô, và không chứa huyết thanh, kháng thể cũng như các yếu tố tăng trưởng bổ sung.
3.1.4.3 Các nhân tố tăng trưởng: EGF, ECGS, FGF
Nhân tố EGF (Epidermal Growth Factor) là một yếu tố tăng trưởng thuộc nhóm peptide, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sự phát triển, tăng sinh và biệt hóa tế bào EGF được tiết ra tại chỗ bởi một tế bào và có tác dụng thúc đẩy sự phân chia của các tế bào lân cận, từ đó kích hoạt chu trình tăng trưởng và biệt hóa tế bào theo nhu cầu của mô.
Quá trình phân bào được khởi phát khi EGF gắn vào thụ thể của nó trên màng tế bào, gây ra con đường truyền tín hiêu có liên quan đến sự phosphoryl hóa các protein thuận nghịch bởi kinase và phosphatase
Nhân tố ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) ECGS có nguồn gốc từ dịch chiết não bò và được xem như là một nhân tố tăng trưởng cho tế bào nội mạch người ECGS có những thuận lợi so với các chất dinh dưỡng bổ sung khác ở chỗ tế bào ít bị nhiễm hơn, ECGS cần ít thời gian để chuẩn bị hơn vì quá trình đó đã được tiêu chuẩn hóa
FGF (Fibroblast Growth Factor) là một họ các yếu tố tăng trưởng liên quan chặt chẽ đến quá trình hình thành mạch, lành vết thương và phát triển phôi thai Các FGFs là những protein tăng trưởng có khả năng kích hoạt sự tăng sinh và biệt hóa tế bào thông qua tương tác với heparan sulfate proteoglycans và receptor FGFR, từ đó thúc đẩy chu kỳ tế bào và các quá trình sinh học thiết yếu cho sự phát triển mô Nhờ vai trò điều hòa của hệ FGF, các cơ chế tăng trưởng và tái tạo mô được thúc đẩy một cách hiệu quả, đặc biệt trong tạo mạch và phục hồi tổn thương.
3.1.4.4 FBS (Huyết thanh bào thai bò)
PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng quát quá trình thí nghiệm
Thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly giải hồng cầu
Nuôi cấy chọn lọc trên 4 môi trường khác nhau:
Nuôi cấy tế bào CD34 +
Xác định tế bào EPC
Thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng
Xác định trạng thái bám dính của tế bào
3.2.1 Thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly gi ải hồng cầu
3.2.1.1 Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân
Trong mẫu máu có chứa hai loại tế bào là tế bào có nhân và tế bào không nhân
Tế bào không nhân là hai loại tế bào chính gồm tế bào hồng cầu và tiểu cầu, đều thiếu nhân ở bên trong Ngược lại, các tế bào có nhân bao gồm tế bào gốc, tế bào tiền thân và các loại tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành máu, chức năng miễn dịch và phục hồi sau tổn thương.
Phương pháp ly giải hồng cầu được sử dụng để xử lý mẫu máu, loại bỏ bớt các loại tế bào không nhân và chỉ thu nhận quần thể tế bào đơn nhân, phục vụ cho mục đích cuối cùng là thu được tế bào EPC ứng viên Giai đoạn này cũng có mục đích loại bỏ hồng cầu, nhằm tránh ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào sau này.
Sơ đồ 3.2 Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuố ng rốn người
Nuôi tế bào ở 37 0 C, 5% CO 2 Chuyền huyền phù vào đĩa 6 giếng
Huyền phù tế bào trong 1,5-2ml môi trường nuôi cấy
Loại dịch nổi, rửa lại bằng PBS-
Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút
Vortex nhẹ, ủ 10 phút trong tối Cho vào 2ml máu cuống rốn Cho 12ml dung dịch ly giải hồng cầu vào ống falcon 15 ml
- Mẫu máu đem về phải được bảo quản trong điều kiện 4 o C và phải sử dụng trong vòng 6 tiếng tính từ khi nhận mẫu về
- Có thể lặp lại bước ly giải hồng cầu lần nữa nếu thấy vẫn còn nhiều hồng cầu
Sau khi kết thúc thí nghiệm, mọi dụng cụ đã qua sử dụng và nước thải phát sinh từ quá trình thí nghiệm đều phải được hấp vô trùng lại trước khi tiến hành rửa và tái sử dụng.
(a) Cho dung dịch ly giải vào ống falcon (b) Dùng syringe 10ml lấy máu
(c) Cho 2ml máu vào ống falcon (d) Ly tâm 3000 vòng/ phút, 5 phút
(e) Cho huyền phù tế bào vào đĩa 6 giếng (f) Nuôi tế bào ở 37 0 C, 5% CO 2
Hình 3.3 Hình minh họa quy trình thu nhận tế bào đơn nhân
3.2.1.2 Phương pháp nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên
- Quần thể tế bào trong máu cuống rốn bao gồ m:
Tế bào máu trưởng thành như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu
Các loại tế bào gốc: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô, tế bào tiền thân nội mô
- Khi ly tâm với dung dịch ly giải, các tế bào hồng cầu vỡ gần như hoàn toàn
Vì thế, hồ ng cầu và các mảnh vỡ tế bào bị loại bỏ
- Trong các tế bào đơn nhân thu được, các tế bào trưởng thành không sống được do không bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy
Khi nuôi cấy hỗn hợp tế bào, chỉ có các tế bào gốc bám dính mới gắn kết và phát triển trên bề mặt nuôi cấy Những tế bào không có khả năng bám dính sẽ được loại bỏ trong quá trình nuôi và thay môi trường, giúp thu được tập hợp tế bào gốc sạch và đồng nhất cho các ứng dụng nghiên cứu và trị liệu.
Thí nghiệm 1: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS
Thí nghiệm 2: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF Thí nghiệm 3: Nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS
Thí nghiệm 4 tiến hành nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS kèm GF để tối ưu hóa khả năng bám dính và sự phát triển của tế bào Mục tiêu là đánh giá trạng thái bám dính và so sánh số lượng tế bào bám dính giữa các môi trường nuôi khác nhau nhằm xác định điều kiện nuôi cho hiệu quả cao Phương pháp đánh giá bao gồm quan sát trực tiếp trạng thái bám dính dưới kính hiển vi và định lượng tế bào bám dính bằng các chỉ số như mật độ tế bào và diện tích bám dính, sau đó phân tích so sánh giữa các nhóm môi trường.
Trạng thái bám dính của tế bào được đánh giá dựa trên khả năng cố định trên bề mặt giếng, cho thấy mức độ gắn kết và ổn định của tế bào Khi di chuyển đĩa 6 giếng, các tế bào vẫn bám chắc vào bề mặt, không bị trôi nổi theo dòng môi trường bị lay động.
Trong thí nghiệm này, sau khoảng 24 giờ, dịch nổi được thu từ giếng cũ và ly tâm để thu cặn; huyền phù sau đó được pha với 2 ml môi trường nuôi và đưa vào giếng tiếp theo Để so sánh số lượng tế bào bám dính giữa các môi trường khác nhau, chúng tôi tiến hành đếm số tế bào hoặc cụm tế bào bám trên bề mặt nuôi tại 30 trường quan sát được chọn ngẫu nhiên ở các mốc thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, với độ phóng đại 20x của kính hiển vi đảo ngược.
- Kết quả sau khi đếm sẽ được tính trung bình cộng Mỗi môi trường được khảo sát với 5 mẫu tế bào
(a) Hút môi trường cho vào ống falcon (b) Ly tâm 3000 vòng/phút, 5 phút
(c) Loại dịch nổi, rửa lại bằng PBS (d) Huyền phù với môi trường và cho tế bào vào đĩa bên cạnh
Hình 3.4 Hình minh họa thao tác thay môi trường sau kho ảng thời gian
Trong quá trình nuôi cấy tế bào, sau 3–4 ngày ta tiến hành thay môi trường nuôi Sau mỗi lần thay, các tế bào tạp bị loại dần, chỉ còn lại những tế bào sống trong môi trường nuôi Tế bào tiền thân nội mô được đánh giá đang phát triển khi các tế bào đã bám dính và trải rộng thành các hình dạng đặc trưng của tế bào nội mô.
Sơ đồ 3.3 Quy trình thay môi trường nuôi cấy tế bào Đĩa 6 giếng đang nuôi cấy
Bổ sung 1,5 – 2ml môi trường nuôi cấy Rửa tế bào bằng PBS - (1 – 2 lần) Đổ bỏ môi trường cũ
3.2.1.3 Nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên
Sau khi các tế bào đã bám và trải thành hình dạng xác định, tiến hành nuôi cấy tăng sinh với 2 mục đích:
- Cung cấp môi trường với các chất dinh dưỡng cần thiết và không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh
- Thu được lượng tế bào cần thiết cho quy trình phân tích marker bằng hệ thống Flow Cytometry
Chọn các giếng nuôi cấy có sự phát triển tốt nhất của tế bào tiền thân nội mô ứng viên là yếu tố quyết định cho chất lượng và độ tin cậy của nghiên cứu Tất cả các thao tác được thực hiện trong tủ thao tác vô trùng để duy trì điều kiện vô khuẩn và bảo vệ tính toàn vẹn của mẫu.
Sơ đồ 3.4 Quy trình cấy chuyền tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên
Các giếng có tế bào EP C ứng viên phát tri ển tốt
Chia đều dịch huyền phù tế bào cho 3 giếng khác Thêm vào giếng 2-4 ml môi trường chọn lọc
Thêm vào giếng 2-3ml Trysin / EDTA 0,25%
Rửa tế bào với 2 ml PBS - Đặt vào tủ ấm 37 O C từ 2-3 phút
Nuôi trong tủ ấm ở 37 0 C, 5% CO 2
3.2.1.4 Phương pháp xác định tính gốc của EPC từ máu cuống rốn người a Dựa vào hình thái
Các đĩa nuôi tế bào được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá hình dạng và trạng thái bám dính c ủa tế bào
Các tế bào tiền thân nội mô có hình dạng đa dạng, từ hình thoi đến hình thon dài hoặc hình viên sỏi Những tế bào này có thể mọc rải rác khắp nơi hoặc tập hợp thành các cụm sát nhau.
Hình 3.5 Hình thái của tế bào tiền thân nội mô ứng viên [23]
(a) Tế bào có dạng hình thoi sau 48h nuôi cấy (b) Tế bào tạo thành các cụm sau 6-7 ngày nuôi cấy b Xác định marker bề mặt bằng phương pháp Flow cytometry
Các tế bào khác nhau luôn thể hiện các protein đặc trưng trên bề mặt, được gọi là marker bề mặt, giúp nhận diện và phân loại tế bào một cách nhanh chóng và chính xác Việc phân tích sự biểu hiện của các marker này cho phép nhận diện tế bào dựa vào đặc điểm protein trên màng tế bào Có nhiều phương pháp có thể sử dụng để đạt được mục tiêu này, nhưng phương pháp tối ưu và hiệu quả nhất hiện nay là Flow Cytometry, cho phép đo và phân loại nhiều marker trên từng tế bào đồng thời, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu trong nhận diện tế bào.
Phương pháp Flow Cytometry sử dụng kháng thể đơn dòng gắn chuyên biệt với các protein đặc trưng trên bề mặt tế bào để nhận diện các tế bào đích Những tế bào mang kháng thể được phát hiện và đếm thông qua quá trình phát quang kích hoạt bởi tia laser, với chất phát quang được gắn sẵn trên kháng thể Quá trình này cho phép phân tích nhanh nhạy và định lượng biểu hiện của các protein bề mặt, đồng thời hỗ trợ phân loại tế bào dựa trên đặc tính sinh học của chúng.
Sơ đồ 3.5 Quy trình phân tích marker bằng hệ thống Flow Cytometry
Cho vào tủ mát 4 o C trong 15 phút Ủ lắc với kháng thể kháng CD34 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 5 phút ở 23 o C
Bổ sung 1ml Trypsin/EDTA 0,25% Đổ bỏ môi trường cũ
Rửa tế bào bằng PBS không kháng sinh, rửa 2 lần
Mẫu tế bào Ủ ấm 2-3 phút, ở nhiệt độ phòng
Thu toàn bộ dịch nổi vào falcon 15ml
Thu kết quả Đƣa vào hệ thống FACS để phân tích Huyền phù tế bào trong dung dịch F ACSflow
Ly tâm loại bỏ kháng thể thừa
- Lựa chọn các giếng có tế bào phát triển tốt để thu tế bào đơn chuẩn bị cho quy trình phân tích Flow Cytometry
- Hút bỏ môi trường cũ trong các giếng
- Sau đó bổ sung 1 ml Trypsin/EDTA 0,25% vào giếng
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút Quan sát qua kính hiển vi xem các tế bào đã được tách ra khỏi bề mặt giếng chưa
- Thu toàn bộ dịch nổi cho vào ống falcon 15ml
- Ta ly tâm ở 3000 vòng/ phút trong 5 phút, ở 23 o C để thu cặn tế bào
- Cho vào ống falcon 10ml dung dịch PBS không kháng sinh để rửa lại tế bào
- Sau đó ly tâm ở vận tốc 3500 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào
- Cho kháng thể kháng CD34 vào các ống chứa tế bào và ủ lắc trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào t ủ mát ở 4 o C trong 15 phút
- Huyền phù tế bào được ly tâm để loại bỏ kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch FACSflow
- Cặn tế bào được huyền phù trong 0,5ml FACSflow
- Đưa các tế bào đã nhuộm kháng thể vào hệ thống máy FACS để phân tích
- Thu kết quả trên máy tính, s ử dụng phần mềm CellQuest Pro
- Tất cả các thao tác được tiến hành trong phòng thao tác vô trùng
(a) Rửa tế bào bằng PBS (b) Cho Trysin/EDTA 0.25% vào giếng
(c) Thu dịch nổi cho vào ống falcon 15ml (d) Ly tâm 3000 vòng/ phút, 5 phút
(e) Các ống chứa tế bào và kháng thể kháng C D34 (f) Ủ lắc, 30 phút trong tối
(g) Đưa vào hệ thống FACS để phân tích
Hình 3.6 Hình minh họa quy trình phân tích tế bào bằng Flow Cytometry
3.2.2 Thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm đẳng tỉ trọng với
3.2.2.1 Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân
Sơ đồ 3.6 Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp Percoll
- Mẫu máu tươi đem về được pha loãng với dung dịch PBS không kháng sinh theo tỷ lệ 1 máu : 2 PBS
Để thực hiện phân tầng bằng dung dịch Percoll, cho 3 ml dung dịch Percoll và 6 ml máu vào ống Falcon 15 ml Khi cho máu vào, thao tác nhẹ nhàng để hai lớp máu và Percoll vẫn nằm riêng biệt, đảm bảo sự phân tách giữa các lớp.
- Ly tâm 3000 vòng/phút, trong 10 phút ở 18 o C
Sau khi ly tâm, dung dịch bên trong ống Falcon được phân thành bốn lớp Lớp tế bào đơn nhân là một lớp mỏng đục nằm giữa lớp Percoll và huyết tương Nhẹ nhàng dùng pipette Pasteur thu lấy lớp tế bào đơn nhân.
- Rửa tế bào với 10ml PBS Vortex và ly tâm ở 3500 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào
Ly tâm ở 3500 vòng/ phút, trong 5 phút Thu c ặn tế bào
Cho vào tủ ấm 37 o C, 5% CO 2
Cho vào ống falcon 10ml PBS
Thu lớp tế bào đơn nhân cho vào ống falcon 15 ml
Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 10 phút ở 18 o C Cho tiếp 6ml dung dịch mẫu máu pha s ẵn Cho 3ml dung dịch Percoll vào ống falcon 15ml
Dung dịch Percoll pha sẵn
Huyền phù tế bào trong 2ml môi trường
Trong quy trình chuẩn bị, cặn tế bào được huyền phù với 2 ml môi trường nuôi dưỡng, sau đó lưu giữ trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 để chuẩn bị cho quá trình tách tế bào dương tính CD34.
(a) Pha máu tươi với PBS theo tỷ lệ 1:2 (b) Nhẹ nhàng cho máu vào ống falcon
( c) Ống falcon 15ml chứa máu và Percoll (d) Ly tâm 3000 vòng/ phút, 10 phút, 18 o C
(e) Dung dịch sau ly tâm chia thành 4 lớp (f) Thu lớp tế bào đơn nhân cẩn thận
(g) Cặn tế bào sau khi rửa PBS (h) Huyền phù tế bào với 2ml môi trường
Hình 3.7 Hình minh họa quy trình thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Percoll
3.2.2.2 Quy trình tách tế bào dương tính CD34
Sơ đồ 3.7 Quy trình chuẩn bị để tách tế bào CD34 +