CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THU NHẬN TẾ B ÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ ỨNG VIÊN B ẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHỌN LỌC TRONG 4 MÔI TRƯỜNG
4.1.1. Hiệu quả bám dính, tăng sinh của tế bào trong 4 môi trường khảo sát
- Môi trường 1: M199 bổ sung 15%FBS/KS.
- Môi trường 2: M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF.
- Môi trường 3: EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS.
- Môi trường 4: EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF.
Khả năng bám dính của tế bào trên bề mặt nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và được đánh giá là sự bám c ủa chúng lên bề mặt dụng cụ nuôi cấy nhưng chưa trải hình dạng đặc trưng.
Tro ng mỗi thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát 5 mẫu nuôi, sau thời gian khảo sát 24h, 48h và 72h, tiến hành đếm ngẫu nhiên số tế bào bám dính trên 30 thị trường dưới kính hiển vi đảo ngược (x20) và thu kết quả trung bình số tế bào bám. Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.
Hình 4.1. Vạch tế bào đơn nhân thu đƣợc bằng phương pháp ly giải hồng cầu
41
4.1.1.1. Thí nghiệm 1: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15%
FBS/KS
Hình 4.2. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS sau 24h
(a) Giếng 1; (b) Giếng 2; (c) Giếng 3 (b)
(c) (a)
42
Bảng 4.1. Số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS t ại 3 thời điểm khảo sát
M199 Thời điểm khảo sát (tế bào)
24h 48h 72h
Giếng 1 3,00 7,00 12,40
Giếng 2 8,20 5,20 6,20
Giếng 3 4,20 2,20 8,80
Trung bình 6,36
Biểu đồ 4.1. Biểu đồ số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS tại 3 thời điểm khảo sát
Giải thích – Biện luận:
Ở giếng 1, sau 24h nuôi cấy, trong 30 thị trường khảo sát được trung bình 3,00 tế bào bám, đến 48h có được 7,00 tế bào và ở thời điểm 72h có 12,40 tế bào. Điều này cho thấy rằng, các tế bào đơn nhân khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS có khả năng bám dính r ất thấp.
Số tế bào trung bình
Thời gian
43
Ở giếng 2, trong 30 thị trường khảo sát tại 24h trung bình là 8,20 tế bào, 48h là 5,20 tế bào và ở 72h là 6,20 tế bào. Môi trường M199 là môi trường cơ bản, có thể dùng để nuôi hầu hết các dòng tế bào động vật, không chuyên biệt cho tế bào nội mô, chính vì thế, kết quả khảo sát ở giếng 2 cho thấy sự bám của các tế bào đơn nhân là không tăng.
Ở giếng 3, trong 30 thị trường tại thời điểm 24h có 4,20 tế bào, 48h là 2,20 tế bào và ở 72h là 8,80 tế bào. Kết quả này cho thấy môi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS không thích hợp cho nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên vì sau thời gian nuôi c ấy 24h và 48h các tế bào đơn nhân giảm dần khả năng bám dính và đến thời điểm 72h có tăng nhưng không đáng kể số tế bào bám chứng tỏ rằng môi trường này không tạo điều kiện bám tốt cho tế bào trong thời gian đầu nuôi cấy và có thể chết đi sau một thời gian nuôi cấy.
Trung bình số tế bào bám dính trong 3 giếng tại 3 thời điểm khảo sát khi nuôi cấy trong môi trường này là 6,36 tế bào. Kết quả này cho thấy, môi trường này chỉ thích hợp nuôi thứ cấp các dòng tế bào tạo mạch có sức sống tốt và khả năng bám dính cao mà không cho hiệu quả cao khi nuôi cấy sơ cấp.
4.1.1.2. Thí nghiệm 2: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15%
FBS/KS + GF
(a)
44
Hình 4.3. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF sau 24h
(a) Giếng 1; (b) Giếng 2; (c) Giếng 3
Bảng 4.2. Số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF tại 3 thời điểm khảo sát
M199-GF Thời điểm khảo sát (tế bào)
24h 48h 72h
Giếng 1 10,00 17,40 8,00
Giếng 2 7,00 12,20 7,80
Giếng 3 7,40 5,20 7,40
Trung bình 9,16
(b)
(c)
45
Biểu đồ 4.2. Biểu đồ số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF tại 3 thời điểm khảo sát
Giải thích – Biện luận:
Ở giếng 1, tại thời điểm 24h, trong 30 thị trường khảo sát được 10,00 tế bào, 48h có 17,40 tế bào và ở 72h có 8,00 tế bào. So với thí nghiệm 1, trong môi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF, tế bào bám tương đối nhiều hơn ở cả 3 thời điểm.
Các nhân tố tăng trưởng đã có tác dụng giúp tế bào bám tốt hơn. Tuy nhiên, số lượng tế bào bám vẫn rất thấp.
Ở giếng 2, khảo sát trong 30 thị trường, tại 24h có 7,00 tế bào, 48h có 12,20 tế bào và ở 72h có 7,80 tế bào. Trong giếng 2, các tế bào đơn nhân đã giảm đi khả năng bám vì sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào trôi nổi ở giếng 1 được thu nhận, ly tâm thu cặn và cho môi trường vào nuôi ở giếng 2. Sự bám dính của tế bào đơn nhân giảm dần, điều này cho thấy môi trường nuôi không thích hợp cho sự bám dính và phát triển của tế bào.
Kết quả thu được ở giếng 3, trong 30 thị trường tại 3 thời điểm 24h là 7,40 tế bào, ở 48h là 5,20 tế bào và ở 72h có 7,40 tế bào bám dính. Kết quả này một lần nữa cho thấy môi trường M199 là môi trường không thích hợp cho việc nuôi cấy tế bào sơ
Số tế bào trung bình
Thời gian
46
cấp, cụ thể là tế bào tiền thân nội mô vì cho kết quả trung bình số tế bào bám dính rất thấp, kể cả khi đã bổ sung một số nhân tố tăng trưởng.
Kết luận: Môi trường M199 chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu cơ bản cho sự phát triển của tế bào nhưng không phù hợp khi nuôi cấy sơ cấp các dòng tế bào, đặc biệt là dòng tế bào tiền thân nội mô. Mặc dù đã bổ sung các nhân tố cần thiết như FBS, các nhân tố tăng trưởng (GF_Growth Factors) nhưng cũng không cải thiện được môi trường M199 khi nuôi cấy sơ cấp tế bào tiền thân nội mô vì số lượng tế bào bám ít và khả năng tăng sinh rất thấp.
4.1.1.3. Thí nghiệm 3: Nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15%
FBS/KS
(a)
(b)
47
Hình 4.4. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS sau 24h
(a) Giếng 1; (b) Giếng 2; (c) Giếng 3
Bảng 4.3. Số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS tại 3 thời điểm khảo sát
EBM-2 Thời điểm khảo sát (tế bào)
24h 48h 72h
Giếng 1 11,80 18,20 7,00
Giếng 2 9,60 11,60 6,80
Giếng 3 5,00 1,80 4,60
Trung bình 8,49
(c)
48
Biểu đồ 4.3. Biểu đồ số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS tại 3 thời điểm khảo sát
Giải thích – Biện luận:
Ở giếng 1, trong 30 thị trường tại thời điểm khảo sát 24h có trung bình 11,80 tế bào, ở 48h có 18,20 tế bào và đến 72h là 7,00 tế bào. Kết quả thu được ở giếng 1 tại 3 thời điểm khảo sát cho thấy các tế bào đơn nhân bám khá tốt trong thời gian 24h đến 48h (trung bình tế bào bám cao hơn so với 2 môi trường trên). Có thể giải thích rằng, môi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS là môi trường dinh dưỡng giúp cho tế bào bám và phát triển tốt. Tuy nhiên, môi trường này vẫn thiếu một số các nhân tố tăng trưởng giúp cho tế bào duy trì sự bám dính và phát triển tốt.
Ở giếng 2, tại thời điểm 24h, trong 30 thị trường khảo sát có 9,60 tế bào, tại thời điểm 48h có 11,60 tế bào và 72h có 6,80 tế bào. Kết quả này cho thấy rằng số tế bào bám là có tăng trong giai đoạn từ 24h đến 48h nhưng giảm đi tại thời điểm 72h.
Có thể giải thích rằng, các tế bào đơn nhân khi được nuôi cấy trong môi trường này đã thích ứng nhưng còn thiếu các nhân tố giúp chúng bám và tăng sinh.
Ở giếng 3, tại thời điểm khảo sát 24h có 5,00 tế bào, ở 48h có 1,80 tế bào và ở 72h có 4,60 tế bào bám dính trong 30 thị trường. Ở giếng 3, số tế bào bám dính giảm
Số tế bào trung bình
Thời gian
49
rất nhiều. Điều này một lần nữa khẳng định rằng, môi trường EBM-2 có thể giúp tế bào bám dính tốt trong thời gian đ ầu nuôi cấy (khoảng 24h đến 48h) nhưng thiếu các nhân tố duy trì sự bám dính và tăng sinh của tế bào. Thật vậy, môi trường EBM-2 là môi trường đặc trưng cho nuôi cấy các dòng tế bào có nguồn gốc nội mô, tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy cần bổ sung các nhân tố kích thích sự bám dính và phát triển của tế bào trong giai đoạn nuôi c ấy sơ cấp.
4.1.1.4. Thí nghiệm 4: Nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15%
FBS/KS + GF
(a)
(b)
50
Hình 4.5. Tế bào bám dính khi nuôi trong môi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF sau 24h
(a) Giếng 1; (b) Giếng 2; (c) Giếng 3
Bảng 4.4. Số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF tại 3 thời điểm khảo sát
EBM-2-GF Thời điểm khảo sát (tế bào)
24h 48h 72h
Giếng 1 19,60 54,20 18,20
Giếng 2 85,00 18,20 9,60
Giếng 3 12,80 35,40 44,40
Trung bình 33,04
Biểu đồ 4.4. Biểu đồ số tế bào bám trung bình khi nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF tại 3 thời điểm khảo sát
Số tế bào trung bình
Thời gian (c)
51 Giải thích – Biện luận:
Từ thí nghiệm 3, chúng tôi thấy rằng cần phải bổ sung một số nhân tố tăng trưởng, kích thích sự bám dính và tăng sinh của tế bào tiền thân nội mô ứng viên và kết quả cho thấy rằng:
Ở giếng 1, tại thời điểm 24h, trong 30 thị trường trung bình có 19,60 tế bào bám dính, ở 48h là 54,20 tế bào bám dính và 72h là 18,20 tế bào. Kết quả này cho thấy sự vượt trội của môi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF so với môi trường M199, giúp tế bào bám tốt trong cả 3 thời điểm khảo sát. Các nhân tố tăng trưởng đã cải thiện được sự bám dính của các tế bào đơn nhân.
Ở giếng 2, trong 24h đầu sau khi bổ sung môi trường nuôi cấy có 85,00 tế bào bám khi khảo sát ở 30 thị trường. Đến thời điểm 48h có 18,20 tế bào và ở 72h là 9,60 tế bào. Khi so sánh kết quả này với cả 3 môi trường khảo sát trên cho thấy môi trường EBM-2 khi đã c ải biến cho kết quả tốt nhất. Điều này càng cho thấy rõ vai trò của GF trong sự bám của tế bào tiền thân nội mô ứng viên khi nuôi cấy sơ cấp.
Ở giếng 3, khi khảo sát trên 30 thị trường, tại thời điểm 24h có trung bình 12,80 tế bào, ở 48h có 35,40 tế bào và đến 72h có 44,40 tế bào. Số tế bào bám tăng đáng kể theo các mốc thời gian khảo sát. Kết quả này cho thấy, môi trường EBM-2 khi bổ sung các nhân tố tăng trưởng giúp cho tế bào ở trạng thái ổn định, sống tốt và tăng khả năng bám của chúng trong thời gian đ ầu nuôi cấy.
Kết quả số tế bào bám dính thu được khi nuôi c ấy trong môi trường 3 và môi trường 4 cho thấy sự vượt trội của môi trường EBM-2 so với môi trường M199 cả khi có hay không có bổ sung các nhân tố tăng trưởng.
52
4.1.1.5. So sánh số lượng tế bào bám dính trong 4 môi trường nuôi cấy
Hình 4.6. Tế bào bám dính trong 4 môi trường ở giếng 1 sau 48h nuôi cấy (a) Môi trường 1; (b) Môi trường 2; (c) Môi trường 3; (d) Môi trường 4 Bảng 4.5. So sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường
ở giếng 1 tại 3 thời điểm khảo sát
GIẾNG 1 24h 48h 72h
Trung bình tế bào bám dính (30 thị trường ở 5 mẫu nuôi cấy)
M199 3,00 7,00 12,40 M199+GF 10,00 17,40 8,00
EBM-2 11,80 18,20 7,00 EBM-2+GF 19,60 54,20 18,20 (c)
(a) (b)
(d)
53
Biểu đồ 4.5. Tương quan so sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường ở giếng 1 tại 3 thời điểm khảo sát
Giải thích – Biện luận:
Trong môi trường 1 (M199 bổ sung 15%FBS/KS) số lượng tế bào bám dính trung bình rất thấp ở cả 3 thời điểm khảo sát (thấp hơn 15,00 tế bào ở 30 thị trường).
Tương tự cho môi trường 2 (M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF), số lượng tế bào bám dính trung bình rất thấp. Kết quả này cho thấy, môi trường M199 mặc dù là môi trường cơ bản cho nuôi cấy các dòng tế bào động vật nhưng không thích hợp cho nuôi cấy sơ cấp các dòng tế bào thu nhận từ máu cuống rốn người. Khi nuôi cấy trong môi trường này, tế bào bám dính rất kém và không có khả năng tăng sinh sau một thời gian nuôi cấy. Trong môi trường 4 (EBM-2 bổ sung 15%FBS + GF) số lượng tế bào bám dính cao nhất so với 3 môi trường còn lại. Điều này có thể giải thích rằng, môi trường EBM-2 thích hợp cho nuôi cấy tế bào có nguồn gốc nội mô, giúp các tế bào đơn nhân bám dính tốt. Đồng thời, các nhân tố tăng trưởng cũng phát huy tác dụng giúp tế bào bám dính tốt hơn (kết quả tế bào bám dính ở môi trường 4 cao hơn so với môi trường
Thời gian Số tế bào
trung bình
54
3). Theo các nghiên cứu trên thế giới, liều lượng các nhân tố tăng trưởng cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào chiếm nồng độ khoảng 2 – 10 ng/ml.
Bảng 4.6. So sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường ở giếng 2 tại 3 thời điểm khảo sát
GIẾNG 2 24h 48h 72h
Trung bình tế bào bám dính (30 thị trường ở 5 mẫu nuôi cấy)
M199 8.20 5.20 6.20 M199+GF 7.00 12.20 7.80 EBM-2 9.60 11.60 6.80 EBM-2+GF 85.00 18.20 9.60
Biểu đồ 4.6. Tương quan so sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường ở giếng 2 tại 3 thời điểm khảo sát
Giải thích – Biện luận:
Khi khảo sát ở 30 thị trường ở giếng 2 trong môi trường 1 và môi trường 2 số lượng tế bào bám dính thấp và giảm dần qua các thời điểm khảo sát. Có thể là do một số các tế bào bám dính nhưng không phát triển được và chết đi, bong tróc lên và mất đi sau những lần thay môi trường. Kết quả thu được ở môi trường 3 trong giếng 2 cho thấy sự tăng số lượng tế bào bám dính trong kho ảng 24h đến 48h nhưng lại giảm đi tại
Số tế bào trung bình
Thời gian
55
thời điểm 72h, kết quả này cho thấy rằng, tế bào nuôi cấy trong môi trường EBM-2 có khả năng bám dính tốt nhưng lại thiếu một số nhân tố giúp duy trì sự bám dính này. Ở thời điểm 24h, khi khảo sát ở môi trường 4, số tế bào bám là cao nhất so với 3 môi trường còn lại nhưng số lượng này giảm dần đến thời điểm 48h và 72h. Kết quả này cho thấy phải chăng có sự ảnh hưởng của các nhân tố tăng trưởng đến sự bám dính của tế bào đơn nhân khi nuôi cấy sơ c ấp.
Hình 4.7. Tế bào bám dính trong 4 môi trường ở giếng 2 sau 72h nuôi cấy (a) Môi trường 1; (b) Môi trường 2; (c) Môi trường 3; (d) Môi trường 4 Bảng 4.7. So sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường ở
giếng 3 tại 3 thời điểm khảo sát
GIẾNG 3 24h 48h 72h
Trung bình tế bào bám dính (30 thị trường ở 5 mẫu nuôi cấy)
M199 4,20 2,20 8,80 M199+GF 7,40 5,20 7,40 EBM-2 5,00 1,80 4,60 EBM-2+GF 12,80 35,40 44,40
(c) (d)
(a) (b)
56
Biểu đồ 4.7. Tương quan so sánh số lượng tế bào bám dính trung bình trong 4 môi trường ở giếng 3 tại 3 thời điểm khảo sát
Hình 4.8. Tế bào bám dính trong 4 môi trường ở giếng 3 sau 72h nuôi cấy (a) Môi trường 1; (b) Môi trường 2; (c) Môi trường 3; (d) Môi trường 4
Số tế bào trung bình
Thời gian
(c)
(a) (b)
(d)
57 Giải thích – Biện luận:
Kết quả ở giếng 3 cho thấy môi trường 4 vẫn tối ưu cho sự bám dính của tế bào hơn hẳn 3 môi trường còn lại. Trong môi trường 1 và môi trường 2, tế bào bám rất thấp và giảm dần qua các thời điểm khảo sát. Tế bào bám và sống không khỏe, sau một thời gian nuôi cấy, các tế bào không thích nghi và chết đi. Trong môi trường 3, số lượng các tế bào bám có tăng theo thời gian khảo sát nhưng vẫn thấp hơn so với môi trường 4. Đến thời điểm khảo sát 72h, ta thấy trong môi trường này có tế bào bám nhưng hình dạng của tế bào không đặc trưng (tế bào bám vô định hướng).
Tóm lại, khi khảo sát trong 3 giếng, ở 4 môi trường tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h đều cho thấy sự tối ưu của môi trường 3 so với 3 môi trường còn lại. Tuy nhiên, số lượng tế bào bám dính là không cao ở cả 4 môi trường và sự tăng sinh của tế bào trong thời gian nuôi cấy sau này là rất hạn chế. Các tế bào hầu như chưa thấy sự tăng sinh sau 6 ngày nuôi cấy và có hiện tượng chết đi của nhiều tế bào. Có thể giải thích rằng, trong quá trình thu nhận tế bào đơn nhân có lẫn những tế bào hồng c ầu, tiểu cầu (số lượng nhỏ), các tế bào này chết đi do không sống được trong các môi trường nuôi cấy và vỡ ra, giải phóng nguyên sinh chất bên trong tế bào làm cho pH của môi trường nuôi trong flask thay đổi và ảnh hưởng đến sự sống của các tế bào đơn nhân đã bám dính