Flow cytometry là kỹ thuật đo và xử lý đồng thời nhiều tính chất sinh lý của các phần tử đơn, thường là tế bào, khi chúng di chuyển theo dòng chất lỏng xuyên qua một chùm tia sáng. Khi tế bào hay các phần tử trên bị va đập bởi ánh sáng tập trung, chúng phát ra tín hiệu. Tín hiệu này sẽ được cảm nhận bởi máy dò (detector) và được chuyển đến máy tính. Trên máy tính, các số liệu được xử lý và cung cấp thông tin về thuộc tính tế bào. Thuộc tính các phần tử có thể được đo đạc bao gồm: kích thước của phân tử, độ phức tạp bên trong cấu trúc, hay tính chất hạt của phân tử và mật độ huỳnh quang. Flow cytometry thường được dùng để chẩn đoán các rối loạn sức khỏe, đặc biệt là bệnh ung thư máu, nhưng cũng có nhiều ứng dụng khác trong cả nghiên cứu và thực hành lâm sàng. Một ứng dụng phổ biến khác là sự phân loại vật lý các đơn vị, dựa trên tính năng, nhằm thu được những quần thể mong muốn.
2.5.1. Lƣợc sử nghiên cứu [22]
Thiết bị flow cytometry dựa vào sự phát huỳnh quang đầu tiên được phát triển vào năm 1968 bởi Wolfgang Gửhde từ Đại học Mỹnster và thương mại húa đầu tiờn ở Đức (1968/69) bởi nhà phát triển và sản xuất Partec thông qua Phywe AG tại Gửttingen. Khi đú, cỏc phương phỏp hấp thu vẫn tiếp tục được ưa chuộng bởi cỏc nhà khoa học hơn là các phương pháp huỳnh quang. Sau đó các thiết bị flow cytometry
19
được phát minh, bao gồm Cytofluorograph (1971) của Bio/Physics Systems Inc. (sau đó đổi tên thành : Ortho Diagnostics), the PAS 8000 (1973) của Partec, thiết bị FACS đầu tiền từ Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) từ Partec/Phywe và Epics từ Coulter (1977/78).
Tên gọi ban đầu của công nghệ flow cytometry là "pulse cytophotometry "
(tiếng Đức: Impulszytophotometrie). Chỉ 20 năm sau, vào năm 1988, tại Hội nghị của Hiệp hội Kỹ sư sáng chế Mỹ (American Engineering Foundation) tại Pensacola, Florida, phương pháp này đã được đổi tên thành “flow cytometry”, một thuật ngữ sau đó nhanh chóng trở thành phổ biến.
2.5.2. Nguyên tắc hoạt động [2]
Một chùm ánh sáng có bước sóng đơn (thường sử dụng ánh sáng laser) hướng vào một dòng chất lỏng. Có một số máy dò nhắm vào những điểm mà dòng chảy đi qua các chùm ánh sáng: một máy dò nằm trên đường đi của chùm sáng (Forward Scatter hoặc FSC) và vài cái khác nằm vuông góc với nó (Side Scatter (SSC) cùng với một hay nhiều mỏy dũ huỳnh quang). Mỗi đơn vị cú kớch thước 0,2-150 àm đi qua cỏc chùm ánh sáng và phân tán ánh sáng, và chất nhuộm huỳnh quang gắn trên các tế bào đó có thể được kích thích tạo thành ánh sáng phát có bước sóng dài hơn so với các nguồn ánh sang ban đầu.
Sự kết hợp của ánh sáng tán xạ và huỳnh quang được thu nhận bởi các máy dò và bằng cách phân tích biến động trong độ sáng ở mỗi đ ầu dò, ta có thể có được thông tin về cấu trúc vật lý và hóa học của từng tế bào. FSC tỷ lệ với diện tích bề mặt tế bào.
FSC giúp nhận biết những phần tử lớn hơn một kích thước nhất định mà không c ần phải khảo sát tính chất phát huỳnh quang của chúng. Nói cách khác FSC giúp phân biệt những tế bào, dựa vào sự khác nhau về kích thước của chúng. Bên cạnh đó, SSC tỷ lệ với tính chất hạt hay độ phức tạp bên trong tế bào.
20 2.5.3. Thiết bị flow cytometry [2]
Hình 2.6. Nguyên tắc hoạt động của Flow cytometry[18]
Một thiết bị flow cytometry tương tự như kính hiển vi, ngo ại trừ, thay vì tạo nên 1 tấm ảnh của tế bào, flow cytometry tự động định lượng một số lượng lớn tế bào với những thông số đã được thiết lập.
Kỹ thuật Flow cytometry được thực hiện trên thiết bị Flow cytometer gồm 3 bộ phận chính:
2.5.3.1. Hệ thống dòng lỏng
Hệ thống dòng lỏng vận chuyển các phần tử thao một dòng qua tia laser để phân tích. Để đạt được mức độ chiếu sáng tối ưu, hệ thống cần thõa mãn hai điều kiện:
(1) Dòng lỏng vận chuyển các phần tử đặt tại trung tâm chùm tia laser, (2) chỉ một phần tử được di chuyển qua chùm tia laser tại một thời điểm nhất định.
2.5.3.2. Hệ thống quang học
Hệ thống quang học bao gồm các nguồn tia laser và các bộ phận lọc quang học.
Tia laser chiếu sáng các phần tử trong chất lỏng, sau đó, bộ phận lọc quang học điều khiển các tín hiệu ánh sáng đến các bộ phận cảm nhận. Tia laser argon thường được dùng trong Flow cytometry vì phát ra ánh sáng bước sóng 488nm, có khả năng kích
21
thích nhiều phân tử phát huỳnh quang. Một trong những phân tử phát huỳnh quang thưởng được sử dụng là fluorescein isothiocyanate (FITC) .
2.5.3.3. Hệ thống điện tử
Hệ thống điện tử chuyển các tín hiệu ánh sáng đã được nhận bởi bộ phận cảm nhận thành các tín hiệu điện tử và xử lý bằng máy tính.
Các thiết bị hiện đại thường có nhiều laser và đầu dò huỳnh quang (kỷ lục hiện tại cho một công cụ thương mại là 4 laser và 18 đầu dò huỳnh quang). Việc tăng số lượng các thiết bị dò laser cho phép có thể đánh dấu được nhiều kháng thể hơn, và có thể xác định chính xác hơn quần thể mục tiêu qua các marker bề mặt của chúng. Một số thiết bị khác có thể ghi lại hình ảnh kỹ thuật số của từng cá thể tế bào, cho phép các phân tích về vị trí tín hiệu huỳnh quang bên trong hoặc trên bề mặt tế bào.
2.5.4. Phương pháp phân loại tế bào dựa trên sự phát huỳnh quang (FACS) [2]
FACS là một dạng đặc biệt của phương pháp flow cytometry, phân loại một hỗn hợp đồng nhất các tế bào sinh học thành hai hay nhiều loại, dựa trên sự tán xạ ánh sáng và đặc điểm huỳnh quang của tế bào. FACS là một công cụ khoa học đắc lực, vì nó cung cấp nhanh chóng, khách quan và ghi định lượng các tín hiệu huỳnh quang từ các tế bào đơn cũng như phân chia theo tính chất vật lý của các tế bào mà ta quan tâm đặc biệt. Sự phân loại tế bào đầu tiên được phát minh bởi Mack Fulwyler vào năm 1965, sử dụng nguyên tắc của Coulter volume , một kỹ thuật tương đối khó khăn và không còn được sử dụng trong các thiết bị hiện đại . Kỹ thuật này được mở rộng bởi Len Herzenberg. Herzenberg đoạt giải thưởng Kyoto năm 2006 cho những đóng góp của ông trong việc phát triển phương pháp flow cytometry.
Tùy loại máy flow cytometry, bộ phận bắt tế bào được thiết kế khác nhau. Máy FACSCalibur (kiểu benchtop), sử dụng một thiết bị cơ học gọi là ống bắt để phân loại tế bào. Ống bắt di chuyển ra vào qua dòng mẫu để thu nhận tế bào quan tâm với tốc độ 300 tế bào/giây. Khi một tế bào đi qua chùm laser, máy FACSCalibur sử dụng tính chất của cổng phân loại, nhanh chóng xác định và bắt giữ tế bào đích tùy vào kiểu phân loại đã chọn trước. Kiểu phân loại là tiêu chuẩn bắt giữ tế bào đích, liên quan đến tổng số và độ tinh sạch của tế bào được bắt.
22
Đối với máy FACSVantage SE (kiểu stream in air cytometer), các giọt chứa tế bào được tích điện phù hợp với tiêu chuẩn phân loại. Một bảng mang điện dương và một bản mang điện âm được đặt hai bên của dòng. Khi một giọt mang điện tích đi qua các tấm tích điện, chúng chuyển hướng đến các ống nhận khác nhau, tùy thuộc vào điện tích của giọt.
Hình 2.7. P hân loại tế bào bằng cách sử dụng các bản tích điện[18]
2.5.5. Ứng dụng
Kỹ thuật này được sử dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm sinh học phân tử, bệnh lý học, miễn dịch học, thực vật học và hải dương học. Nó đặc biệt hữu ích trong lĩnh vực sinh học phân tử khi được sử dụng với những kháng thể gắn huỳnh quang.
Những kháng thể xác định (khoảng 10.000 kháng thể kháng với vài nghìn gen) gắn với kháng nguyên trên tế bào mục tiêu và đưa ra những thông tin về đặc điểm xác định của tế bào mà ta quan tâm. Kỹ thuật này có thể mở rộng ứng dụng vào lĩnh vực y dược (đặc biệt trong việc cấy ghép, huyết học, miễn dịch và hóa học trị liệu khối u, di truyền học và chọn lọc tinh trùng để lựa chọn trước giới tính). Trong lĩnh vực hải dương học, đặc điểm tự phát sáng của các sinh vật phù du có thể được khai thác bằng phương pháp flow cytometry.
23