Các yếu tố về mẫu máu (thể tích mẫu, thời điểm lấy mẫu...), điều kiện, vật liệu, mật độ nuôi cấy và công thức môi trường đều ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh và khả năng biệt hóa của EPC.
2.4.1. Điều kiện nuôi cấy [1],[2]
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn thể hiện qua các yếu tố sau:
2.4.1.1. Giá thể
Do không có vách như tế bào thực vật và vi sinh vật, hầu hết tế bào cần trải rộng trên một giá thể trong quá trình tăng trưởng. Trong cơ thể (in vivo) là cấu trúc mô, còn trong nuôi cấy in vitro là các giá thể nhân tạo. Đặc tính này được gọi là “tính cần giá thể”. Các đĩa, bình nuôi bằng nhựa được sử dụng phổ biến hiện nay có 2 thuận lợi chính:
- Giá thể có bề mặt phù hợp cho tế bào bám và thấm được O2, CO2.
- Nhựa mỏ ng rất thích hợp cho việc quan sát tế bào, mô dưới kính hiển vi quang học hay điện tử.
Các yếu tố tăng cường sự bám dính: là các yếu tố được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng bám dính của tế bào vào giá thể, từ đó nâng cao khả năng sống và phát triển của tế bào. Một số yếu tố tăng độ bám dính thường được sử dụng như:
- Chất nền ngo ại bào (extracellular matrix-ECM): là thành phần màng cơ bản trong liên kết mô, có ở tất cả các cơ quan sống (thường là collagen, lamimin và fibronectin...). Sử dụng các thành phần này bao phủ trên bề mặt dụng cụ nuôi có thể tăng tường sự bám dính của tế bào. Tế bào có các thụ thể (receptor) có thể gắn vào protein ECM, từ đó chúng có thể bám dính vào đáy dụng cụ nuôi có xử lý với ECM.
15
- Huyết thanh cũng chứa các yếu tố bám dính ở dạng hoà tan như fibronectin, đóng vai trò quan trọng, giúp tế bào bám vào bề mặt nuôi tốt hơn. Fibronectin nhanh chóng bám vào đĩa nhựa nuôi cấy và cung cấp bề mặt biến đổi cho tế bào bám.
2.4.1.2. Pha khí
Thành phần quan trọng của pha khí là O2 và CO2
(a) Oxy: Nhu cầu về O2 của tế bào nuôi cấy thấp hơn nhu cầu O2 của mô sống.
Áp suất O2 trong tủ nuôi tế bào thường thấp hơn áp suất O2 trong không khí. Nồng độ O2 phổ biến dùng trong t ủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%. Độ sâu c ủa môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ oxy khuếch tán vào tế bào, khuyến cáo nên giữ độ sâu của môi trường kho ảng 2 – 5mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong nuôi cấy tĩnh.
(b) Carbonic: có vai trò khá phức tạp do nhiều hoạt động tương hỗ giữa CO2 hoà tan, pH và nồng độ HCO3- trong môi trường nuôi. Áp suất CO2 không khí sẽ điều khiển trực tiếp nồng độ CO2 hoà tan, với sự tham gia c ủa yếu tố nhiệt độ.
H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-
Chính sự biến đổi thuận nghịch CO2 thành HCO3- có thể sẽ làm thay đổi pH của môi trường nuôi, do vậy, nồng độ CO2 trong tủ nuôi có tính quyết định đến pH của môi trường nuôi c ấy. Như vậy, ta có thể dùng nồ ng độ CO2 để ổn định pH của môi trường nuôi. Nồng độ CO2 ở 5% là thích hợp cho hầu hết các tế bào nuôi cấy, trong đó có EPC.
2.4.1.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ đề nghị để nuôi các dòng tế bào của người và động vật máu nóng là 370C. Nhiệt độ cao thường gây ảnh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ thấp.
Tế bào EPC sau khi phân lập từ máu cuống rốn được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C; 5% CO2.
2.4.1.4. pH
pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt.[2]
Hầu hết các dòng tế bào mọc tốt ở pH 7,4. Tế bào gốc máu cuống rốn tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4 – 7,7.
16 2.4.1.5. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của chất nguyên sinh ở người kho ảng 290 - 310 mOsm/kg.
Đây là điều kiện tối ưu cho nuôi cấy in vitro các tế bào, mô người.
2.4.2. Môi trường dinh dưỡng
Thành phần môi trường nuôi c ấy tế bào được thiết lập giống như thành phần dịch lỏng trong cơ thể số ng gồm muối, carbohydrate, vitamin, amino acid, các tiền chất biến dưỡng, nhân tố tăng trưởng, hormone và các yếu tố vi lượng.
Mỗi thành phần trong môi trường giữ những chức năng khác nhau:
2.4.2.1. Muối vô cơ
Muối vô cơ giúp giữ cân bằng áp suất thẩm thấu của các tế bào và điều hòa điện thế màng bởi các ion Na+, K+ và Ca++. Tất cả chúng đều cần trong chất nền tế bào với vai trò bám gắn và ho ạt động như các cofactor, đồng thời duy trì cơ chế vận chuyển chất qua màng.
2.4.2.2. Carbohydrate
Là nguồn năng lượng chính của tế bào, chủ yếu là đường. Các loại đường chính được sử dụng là glucose và galactose. Một số môi trường còn sử dụng maltose hay fructose. Môi trường chứa nồng độ đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào.
2.4.2.3. Amino acid
Nguồn bổ sung dưỡng chất, năng lượng cho tế bào là các amino acid thiết yếu như cysteine, tyrosine… và các amino acid không thiết yếu như glutamine.
2.4.2.4. Vitamin
Huyết thanh là nguồn cung cấp vitamin quan trọng trong nuôi cấy tế bào. Ngoài ra, môi trường nuôi cũng có thể được bổ sung trực tiếp các vitamin thích hợp. Nhiều vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B cần thiết cho sự phát triển và khuếch đại của tế bào. Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi tế bào là riboflavin, thiamine và biotin.
2.4.2.5. Các protein và peptide
Thành phần này rất quan trọng trong môi trường không huyết thanh. Các protein và peptide thường sử dụng là albumin, transferrin, fibronectin và fetuin.
17 2.4.2.6. Acid béo và lipid
Thành phần này hiện diện trong huyết thanh với các dạng như cholesterol và steroid cần thiết cho một số tế bào đặc biệt. Do đó, các chất này giữ vai trò rất quan trọng trong nuôi tế bào không huyết thanh.
2.4.2.7. Những nguyên tố vi lượng
Những nguyên tố này bao gồm kẽm, đồng, selenium và các acid tricarboxylic trung gian. Selenium là chất giúp giữ các gốc oxy tự do.
2.4.2.8. Huyết thanh
Huyết thanh (FBS_Fetal Bovine Serum) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để tạo điều kiện tối ưu cho nuôi cấy tế bào. Thành phần chủ yếu trong huyết thanh là protein. Ngoài ra, nó còn chứa nhiều polypeptid, các nhân tố tăng trưởng, lipid, hormone, amino acid, glucose, ketoacid, và các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm.
Vai trò c ủa huyết thanh:
- Cung c ấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng....
- Cung c ấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích s ự tăng trưởng và phân chia.
- Kích thích s ự phục hồi các tổn thương tế bào khi tách bằng cách tác dụng lực cơ học hay dùng enzym mạnh như trypsin.
- Bất ho ạt trypsin.
- Cải thiện tính tan c ủa các chất dinh dưỡng.
- Cải thiện khả năng bám c ủa tế bào lên bề mặt bình nuôi.
- Chống oxy hóa.
Tuy nhiên, huyết thanh làm tăng chi phí nuôi c ấy (chiếm 90% chi phí môi trường nuôi cấy). Ngoài ra, huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma. Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng công thức môi trường nuôi không dùng huyết thanh hay dùng với lượng thấp.
2.4.2.9. Dung dịch đệm
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường luôn thay đổi, do:
1/ Ở các đĩa mở, CO2 giải phóng làm tăng pH.
18
2/ Các dòng tế bào nuôi ở mật độ cao thường sản sinh nhiều CO2 và acid lactic làm giảm pH.
Do đó, môi trường nuôi cấy phải được đệm. Các hệ đệm thường sử dụng trong nuôi c ấy tế bào:
Hệ đệm bicarbonat: khả năng đệm kém ở pH sinh lí nhưng vì ít độc, giá rẻ và bổ sung dinh dưỡng cho môi trường nuôi cấy nên được sử dụng phổ biến.
HBSS, EBSS, PBS là các dung dịch đệm phosphat yếu, hầu hết có hiệu quả kém ở pH sinh lí.
HEPES là hệ đệm mạnh và hiệu quả nhất ở pH 7,2 – 7,6. Đệm HEPES không cần phase khí CO2. Tuy nhiên, giá thành của chúng tương đối cao và có tính độc với một số tế bào ở nồng độ cao.