CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
3.2. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.2.1. Thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly giải hồng cầu
Nguyên tắc:
Trong mẫu máu có chứa hai loại tế bào là tế bào có nhân và tế bào không nhân.
Tế bào không nhân là những tế bào hồng cầu và tiểu cầu. Còn những tế bào có nhân bao gồm các loại tế bào gốc, tế bào tiền thân và các loại tế bào bạch cầu.
Sử dụng phương pháp ly gi ải hồng cầu nhằm mục đích xử lý mẫu máu, loại bỏ bớt các loại tế bào không nhân, chỉ thu nhận quần thể tế bào đơn nhân, phục vụ cho mục đích cuối cùng là thu nhận được tế bào EPC ứng viên. Giai đoạn này cũng có mục đích loại bỏ hồng cầu, tránh ảnh hưởng cho quá trình nuôi c ấy tế bào sau này,
Sơ đồ 3.2. Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuố ng rốn người Lặp lại 2 lần
Mẫu máu
Nuôi tế bào ở 370C, 5% CO2 Chuyền huyền phù vào đĩa 6 giếng
Huyền phù tế bào trong 1,5-2ml môi trường nuôi cấy
Loại dịch nổi, rửa lại bằng PBS- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.
Vortex nhẹ, ủ 10 phút trong tối Cho vào 2ml máu cuống rốn
Cho 12ml dung dịch ly giải hồng cầu vào ống falcon 15 ml
29
- Mẫu máu đem về phải được bảo quản trong điều kiện 4oC và phải sử dụng trong vòng 6 tiếng tính từ khi nhận mẫu về.
- Có thể lặp lại bước ly giải hồng cầu lần nữa nếu thấy vẫn còn nhiều hồng cầu - Sau khi thí nghiệm xong, tất cả các dụng cụ đã sử dụng và nước bỏ phải được hấp vô trùng lại lần nữa trước khi rửa để tái sử dụng.
(a) Cho dung dịch ly giải vào ống falcon (b) Dùng syringe 10ml lấy máu
(c) Cho 2ml máu vào ống falcon (d) Ly tâm 3000 vòng/ phút, 5 phút
(e) Cho huyền phù tế bào vào đĩa 6 giếng (f) Nuôi tế bào ở 370C, 5% CO2 Hình 3.3. Hình minh họa quy trình thu nhận tế bào đơn nhân
30
3.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên Nguyên tắc chọn lọc
- Quần thể tế bào trong máu cuống rốn bao gồ m:
Tế bào máu trưởng thành như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu....
Các loại tế bào gốc: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô, tế bào tiền thân nội mô.
- Khi ly tâm với dung dịch ly giải, các tế bào hồng cầu vỡ gần như hoàn toàn.
Vì thế, hồ ng cầu và các mảnh vỡ tế bào bị loại bỏ.
- Trong các tế bào đơn nhân thu được, các tế bào trưởng thành không sống được do không bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy.
- Khi nuôi cấy hỗn hợp các tế bào trên, chỉ có các loại tế bào gốc bám dính và phát triển trên bề mặt nuôi cấy. Các tế bào còn lại sẽ bị loại bỏ thông qua quá trình nuôi và thay môi trường.
Tiến hành
Thí nghiệm 1: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS.
Thí nghiệm 2: Nuôi tế bào trong môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF.
Thí nghiệm 3: Nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS.
Thí nghiệm 4: Nuôi tế bào trong môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF.
Phương pháp đánh giá trạng thái bám dính và so sánh số lượng tế bào bám dính giữa các môi trường.
- Trạng thái bám dính được đánh giá bằng khả năng cố định trên bề mặt giếng.
Khi di chuyển đĩa 6 giếng, các tế bào bám cố định, không trôi nổi theo dòng môi trường lay động.
- Sau khoảng thời gian 24 giờ, ta thu dịch nổi ở giếng cũ, ly tâm thu cặn. Sau đó huyền phù với 2ml môi trường nuôi cấy rồi cho vào giếng tiếp theo. Để so sánh số lượng tế bào bám dính trong các môi trường khác nhau, tiến hành đếm số lượng tế bào/cụm tế bào bám dính trên bề mặt nuôi trong 30 thị trường (được chọn ngẫu nhiên) khác nhau ở các mốc thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ (độ phóng đại 20X của kính hiển vi đảo ngược).
31
- Kết quả sau khi đếm sẽ được tính trung bình cộng. Mỗi môi trường được khảo sát với 5 mẫu tế bào.
(a) Hút môi trường cho vào ống falcon (b) Ly tâm 3000 vòng/phút, 5 phút
(c) Loại dịch nổi, rửa lại bằng PBS (d) Huyền phù với môi trường và cho tế bào vào đĩa bên cạnh.
Hình 3.4. Hình minh họa thao tác thay môi trường sau kho ảng thời gian 24h, 48h, 72h.
- Sau 3-4 ngày, ta tiến hành thay môi trường. Sau mỗi lần thay môi trường, tế bào tạp bị loại dần, chỉ còn tế bào sống trong môi trường nuôi. Tế bào tiền thân nội mô ứng viên được đánh giá là phát triển khi các tế bào đã bám và trải thành những hình dạng đặc trưng.
Sơ đồ 3.3. Quy trình thay môi trường nuôi cấy tế bào.
Đĩa 6 giếng đang nuôi cấy
Nuôi tế bào ở 370C, 5% CO2 .
Bổ sung 1,5 – 2ml môi trường nuôi cấy Rửa tế bào bằng PBS- (1 – 2 lần)
Đổ bỏ môi trường cũ
32
3.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên Nguyên tắc
Sau khi các tế bào đã bám và trải thành hình dạng xác định, tiến hành nuôi cấy tăng sinh với 2 mục đích:
- Cung cấp môi trường với các chất dinh dưỡng cần thiết và không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh.
- Thu được lượng tế bào cần thiết cho quy trình phân tích marker bằng hệ thống Flow Cytometry.
Tiến hành
- Chọn các giếng có sự phát triển tốt nhất của tế bào tiền thân nội mô ứng viên.
Tất cả các thao tác được tiến hành trong tủ thao tác vô trùng.
Sơ đồ 3.4. Quy trình cấy chuyền tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên Các giếng có tế bào EP C ứng viên phát tri ển tốt
Bỏ môi trường cũ
Chia đều dịch huyền phù tế bào cho 3 giếng khác Thêm vào giếng 2-4 ml môi trường chọn lọc Thêm vào giếng 2-3ml Trysin / EDTA 0,25%
Rửa tế bào với 2 ml PBS-
Đặt vào tủ ấm 37OC từ 2-3 phút
Lắc nhẹ giếng
Nuôi trong tủ ấm ở 370C, 5% CO2
33
3.2.1.4. Phương pháp xác định tính gốc của EPC từ máu cuống rốn người a. Dựa vào hình thái
Các đĩa nuôi tế bào được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá hình dạng và trạng thái bám dính c ủa tế bào.
Các tế bào tiền thân nội mô có dạng hình thoi, thuôn dài hoặc hình viên sỏi. Các tế bào có thể mọc rãi rác ho ặc tập hợp thành những cụm sát nhau.
Hình 3.5 Hình thái của tế bào tiền thân nội mô ứng viên [23]
(a) Tế bào có dạng hình thoi sau 48h nuôi cấy (b) Tế bào tạo thành các cụm sau 6-7 ngày nuôi cấy b. Xác định marker bề mặt bằng phương pháp Flow cytometry Nguyên tắc:
Các tế bào khác nhau luôn có sự biểu hiện những protein đặc trưng nằm trên bề mặt. Những protein này nằm trên bề mặt tế bào gọi là marker bề mặt. Người ta thường dựa vào sự biểu hiện của các protein này để nhận diện tế bào. Có nhiều phương pháp khác nhau có thể sử dụng để thực hiện mục tiêu này, nhưng phương pháp tốt nhất và hiệu quả nhất là phương pháp Flow Cytometry.
Phương pháp Flow Cytometry sử dụng kháng thể đơn dòng gắn chuyên biệt với các protein đặc trưng trên bề mặt tế bào. Những tế bào có gắn kháng thể được phát hiện và đếm thông qua sự kích hoạt phát quang bởi tia laser với chất phát quang gắn sẵn trên kháng thể.
(a) (b)
34
Sơ đồ 3.5. Quy trình phân tích marker bằng hệ thống Flow Cytometry Cho vào tủ mát 4oC trong 15 phút
Ủ lắc với kháng thể kháng CD34 trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
Thu c ặn tế bào
Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 5 phút ở 23oC Bổ sung 1ml Trypsin/EDTA 0,25%
Đổ bỏ môi trường cũ
Rửa tế bào bằng PBS không kháng sinh, rửa 2 lần Mẫu tế bào
Ủ ấm 2-3 phút, ở nhiệt độ phòng
Thu toàn bộ dịch nổi vào falcon 15ml
Thu kết quả
Đƣa vào hệ thống FACS để phân tích Huyền phù tế bào trong dung dịch F ACSflow
Ly tâm loại bỏ kháng thể thừa
35 Tiến hành
- Lựa chọn các giếng có tế bào phát triển tốt để thu tế bào đơn chuẩn bị cho quy trình phân tích Flow Cytometry.
- Hút bỏ môi trường cũ trong các giếng.
- Sau đó bổ sung 1 ml Trypsin/EDTA 0,25% vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút. Quan sát qua kính hiển vi xem các tế bào đã được tách ra khỏi bề mặt giếng chưa.
- Thu toàn bộ dịch nổi cho vào ống falcon 15ml.
- Ta ly tâm ở 3000 vòng/ phút trong 5 phút, ở 23oC để thu cặn tế bào.
- Cho vào ống falcon 10ml dung dịch PBS không kháng sinh để rửa lại tế bào.
- Sau đó ly tâm ở vận tốc 3500 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào.
- Cho kháng thể kháng CD34 vào các ống chứa tế bào và ủ lắc trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào t ủ mát ở 4oC trong 15 phút.
- Huyền phù tế bào được ly tâm để loại bỏ kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch FACSflow.
- Cặn tế bào được huyền phù trong 0,5ml FACSflow
- Đưa các tế bào đã nhuộm kháng thể vào hệ thống máy FACS để phân tích.
- Thu kết quả trên máy tính, s ử dụng phần mềm CellQuest Pro.
- Tất cả các thao tác được tiến hành trong phòng thao tác vô trùng.
36
(a) Rửa tế bào bằng PBS (b) Cho Trysin/EDTA 0.25% vào giếng
(c) Thu dịch nổi cho vào ống falcon 15ml (d) Ly tâm 3000 vòng/ phút, 5 phút
(e) Các ống chứa tế bào và kháng thể kháng C D34 (f) Ủ lắc, 30 phút trong tối
(g) Đưa vào hệ thống FACS để phân tích
Hình 3.6. Hình minh họa quy trình phân tích tế bào bằng Flow Cytometry
37