BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học

Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn STT Loại đột biến Bản chất các thay đổi Dấu hiệu phát hiện đột biến 1 Amylase ngoại bào Tạo được amylase ngoại bào Thủy phân tinh bột

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Danh sách sinh viên:

1 Phạm Hữu Lộc

2 Trịnh Hồ Hoàng Lộc

3 Lê Minh Lợi

Lớp DCQ2017 – Sáng thứ 3 Nhóm 08 – Tiểu nhóm 01

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2020

Bài 1 Chọn lọc giống vi sinh vật

1.1 Tóm tắt lý thuyết

1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng

- Trong quá trình chọn lọc giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng từ các nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng (từ những nơi thường có vi sinh vật tự do) hoặc theo kiểu định hướng (lấy mẫu có chủ đích)

- Sau đó, người ta sử dụng môi trường phân lập và nuôi cấy chúng bằng cách kiềm hãm hoặc giết vi sinh vật phổ biến và kích thích cho các vi sinh vật hiếm phát triển Nhờ đó, chúng ta có thể chọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc tính mong muốn Phương pháp này thực hiện tương đối dễ dàng, nhưng nếu các đặc tính chọn lọc phức tạp thì cũng gây khó khăn cho quá trình sàng lọc

1.1.2 Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn

STT Loại đột biến Bản chất các thay đổi Dấu hiệu phát hiện đột biến

1 Amylase ngoại bào Tạo được amylase ngoại bào

Thủy phân tinh bột trong môi trường nên tinh bột không tạo màu tím với lugol Xung quanh khóm khuẩn có vòng sáng

2 Protease ngoại bào Tạo được protease ngoại bào

Thủy phân gelatine trong môi trường nên gelatine không bị tủa khi tráng lên môi trường TCA Xung quanh khóm khuẩn có vòng sáng

3 Kháng sinh Tạo được kháng sinh

Có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác bằng cách tạo vùng ức chế xung quanh lỗ cấy

4 Không di động Mất tiêm mao hoặc tiêm

mao không hoạt động Khuẩn lạc mọc dính vào nhau

5 Không tạo nha bào Mất hoặc thay dổi bề mặt

Mọc trên môi trường có thuốc nồng độ mà bình thường có thể gây ức chế phát triển của vi sinh vật

8 Kháng virus Mất điểm tiếp nhân virus

Phát triển trên môi trường nuôi cấy khi có mặt virus ở nồng độ cao

9 Nhạy cảm với nhiệt

độ bình thường

Thay đổi một protein thiết yếu làm tăng sự nhạy cảm với nhiệt độ

Phát triển có nhiệt độ thấp có thể, không phát triển ở nhiệt độ bình thường

10 Mất sắc tố Mất các enzym có khả năng

tham gia tổng hợp sắc tố Có màu khác hoặc mất màu

11 Lên men đường Mất enzym phân giải các

loại đường

Không tạo ra sự biến đổi màu trên môi trường đặc trưng với chất chỉ thị màu

1.1.3 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật

a Phương pháp cấy truyền vi sinh vật (thời gian cấy truyền 1 tuần – 1 tháng)

- Cấy truyền trên môi trường và định kì cấy truyền sang môi trường mới

- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm

- Nhược điểm: tốn công sức, môi trường và thời gian không ổn định

b Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng

- Giữ giống ở 4 – 5oC và cho lên bề mặt một lớp vaselin, parafin… (giữ chủng nhiều năm)

- Ưu điểm:

• Đơn giản, hiệu quả cao

• Môi trường không bị mất nước

• Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với cấy truyền vi sinh vật

c Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt

- Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử

- Thời gian bảo quản lâu (từ 1 đến nhiều năm)

d Phương pháp đông lạnh: làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật tới -80oC và thêm chất chống đông thích hợp (glycerin, sữa,…)

- Phương pháp đơn giản

- Vi sinh vật giữ được lâu 6 tháng – 10 năm

e Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp

- Làm khô nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp

- Làm giảm hoặc làm ngừng quá trình phân chia của vi sinh vật

- Vi sinh vật không bị biến đổi về các đặc tính di truyền

- Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm

1.2 Kết quả và bàn luận

1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease

a Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym

b Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Bảng 1.1 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Phân lập trên môi trường tinh bột tráng dung dịch Lugol Cấp pha loãng: 5

Phân lập trên môi trường tinh bột

1.2.2 Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

Bảng 1.2 Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh

a Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease ngoại bào

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và

ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào

• Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột của môi trường, nên xung quanh khóm

vi khuẩn tiết amylase sẽ có vòng sáng, không bắt màu tím với dung dịch Lugol (Iod)

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và

ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào

• Protease ngoại bào thủy phân gelatin của môi trường, nên xung quanh khóm

vi khuẩn tiết protease sẽ có vòng sáng, không bị đục màu với dung dịch TCA 50%

• Do lượng gelatin trong thạch có nồng độ quá thấp nên đĩa thạch không đục

rõ với TCA 50%, phải soi dưới đèn huỳnh quang mới thấy được vòng sáng mờ

b Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

- Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự

tăng trưởng của nó với vi sinh vật khác

• S aureus trong 5 lỗ gồm B1 – B4 và lỗ chứng đều không xuất hiện vòng ức

chế xung quanh lỗ

• E coli trong 5 lỗ gồm B1 – B4 và lỗ chứng có 2 lỗ B2, B3 xuất hiện vòng ức

chế xung quanh lỗ

- Kết luận: Trong các chủng Bacillus:

• Chủng Bacillus 2, 3 sinh ra kháng sinh có hoạt tính tác động đến E coli

• Không có chủng nào sinh kháng sinh có hoạt tính tác động đến S aureus

Bài 2 Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic

2.1 Tóm tắt lý thuyết

2.1.1 Khái niệm probiotic

- Probiotic là các vi sinh vật sống khi được cung cấp với số lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ (FAO/WHO 2001)

- Các chủng vi sinh vật được dùng chủ yếu trong các chế phẩm probiotic là

Lactobacillus và Bifidobacteria, ngoài ra còn các nấm men và Bacilli

2.1.2 Vai trò của probiotic

- Tăng cường hấp thu khoáng chất, vitamin

- Hạ cholesterol, huyết áp

- Tăng đáp ứng miễn dịch, giảm phản ứng viêm

- Phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh

- Ngăn chặn vi sinh vật có hại khi bị stress

- Có khả năng chống các yếu tố gây ung thư…

2.1.3 Các yêu cầu của vi khuẩn probiotic

a Yêu cầu chung

- Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với yêu cầu công nghệ để có thể đưa vào sản xuất

- Có khả năng sống sót và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm

- Không gây các mùi khó chịu cho sản phẩm

- Có khả năng sống sót khi đi qua đường tiêu hóa nếu được sử dụng qua đường này

và đi đến được nơi tác động của chúng

- Có khả năng thực hiện được chức năng định hướng

b Yêu cầu an toàn

- Được định danh chính xác

- Phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh, không có khả năng lây bệnh

- Không gây khử liên hợp muối mật

- Không mang gen đề kháng kháng sinh có thể di truyền được

c Yêu cầu chức năng

- Có khả năng dụng nạp với acid dịch vị của người

- Có khả năng dung nạp với muối mật

- Có khả năng bám dính, tồn tại lâu dài, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong đường tiêu hóa

- Có khả năng sản xuất kháng sinh vi sinh vật có hoạt tính chống lại các tác nhân sinh vật gây bệnh khác

d Yêu cầu công nghệ

- Có đặc tính tốt về cảm quan

- Đề kháng với thực khuẩn

- Dễ sản xuất, tăng trưởng đủ mạnh, dễ thu hoạch

- Có khả năng sống sót, ổn định trong quá trình sản xuất và bảo quản

- Có thể đánh giá chất lượng khi trộn vào sản phẩm cuối cùng

2.2 Kết quả và bàn luận

2.2.1 Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic

a Hình ảnh của thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị nhân tạo

- Mẫu chứng

- pH = 2

TBSD pha loãng cấp 2 sau 60 phút

- pH = 3

TBSD pha loãng cấp 2 sau 60 phút

Bào tử pha loãng cấp 2

sau 90 phút

Bào tử pha loãng cấp 3 sau 90 phút

b Kết quả khả năng chịu acid dịch vị nhân tạo

Bảng 2.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo

c So sánh khả năng chịu acid dịch vị và muối mật của dịch mật ở các nồng độ khác nhau

- Dịch vị:

• Khả năng chịu được trong môi trường dịch vị nhân tạo ở pH 2 tốt hơn trong môi trường dịch vị nhân tạo có pH 3 Thời gian trong môi trường thí nghiệm càng lâu, tỷ lệ % sống sót càng giảm

• Bào tử chịu đựng sống sót tốt hơn TBSD trong điều kiện khắc nghiệt của dịch vị Điều này là có thể là do bào tử có khả năng chịu được môi trường dịch vị và sinh trưởng được nên tốc độ phát triển nhanh hơn so với TBSD

• Nhìn chung, khả năng chịu đựng dịch vị của Bacillus subtilis là tốt do loại vi

khuẩn này sống được trong ruột non, cần có khả năng chịu được dịch vị dạ dày để đến được ruột non, có thể chịu đựng tới pH 2 nên được ứng dụng để làm probiotic

- Dịch mật:

• Khả năng chịu được trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,3% tốt hơn trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,5% Thời gian trong môi trường thí nghiệm càng lâu, tỷ lệ % sống sót càng giảm

• Bào tử chịu đựng sống sót tốt hơn tế bào sinh dưỡng trong điều kiện khắc nghiệt của dịch mật Điều này là hợp lý bởi bào tử là một dạng biến đổi của vi sinh vật nhằm chống lại những điều kiện bất lợi từ môi trường

• Nhìn chung, khả năng chịu đựng muối mật của Bacillus subtilis là rất tốt do

loại vi khuẩn này sống được trong ruột non, có khả năng dung nạp muối mật, có thể chịu đựng nồng độ lên tới 3 – 5% nên được ứng dụng để làm probiotic

Bài 3 Tinh chế enzym amylase bằng alginat

3.1 Tóm tắt lý thuyết

3.1.1 Vai trò của enzym amylase

- Amylase là enzyme có trong nước bọt và dịch mật của người, có chức năng phân hủy tinh bột thành maltose và sau cùng thành glucose

- Amylase ứng dụng nhiều trong công nghiệp và thực phẩm

- Trong y dược, amylase được sử dụng để sản xuất glucose làm dung dịch tiêm truyền,

sản xuất tinh bột biến tính làm tá dược

3.1.2 Sản xuất enzym amylase

- Enzym amylase có thể được chiết từ nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động vật, vi

sinh vật…

- Amylase dùng trong y dược phải có độ tinh khiết cao nên cần được tinh chế từ enzyme thô

- Nguyên tắc tinh chế amylase là dùng một cơ chất tương tự tinh bột (alginat) để bắt

giữ enzyme từ hỗn hợp thô Tủa phức hợp amylase-alginat bằng cation Ca2+ rồi ly trích lại enzyme tinh chế bằng cách hòa tan ngược lại trong glucose Nhờ ái lực của enzyme với glucose cao hơn với alginate, ta thu được enzyme tinh chế tan trong dung dịch

glucose

3.2 Kết quả và bàn luận

3.2.1 Hàm lượng protein

Bảng 3.1 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

Mẫu OD 280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg)

Enzym tinh chế 0,6944 Vtinh chế = 22 15,28

3.2.2 Hoạt tính enzym

a Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560

Bảng 3.2 Thông số đường chuẩn tinh bột

Hoạt tính tổng enzym (U)

Hoạt tính riêng (U/protein)

- Mức tinh chế:

𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡𝑖𝑛ℎ𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ℎô =

11,816,82 = 1,73

c Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế

- Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất khá thấp: 34,41%

- Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng 1,73 lần

3.2.3 Bàn luận

a Tổng lượng protein

- Tổng lượng trong mẫu dịch enzym thô = 76,90 (mg)

- Tổng lượng trong mẫu dịch enzym sau tinh chế = 15,28 (mg)

→ Như vậy, quá trình tinh chế đã giúp loại đi một lượng các protein, trong đó

có các protein không phải là enzym amylase Nhờ đó mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh khiết hơn so với mẫu dịch enzym thô ban đầu

y = 0.2443x + 0.0121 R² = 0.996

0 0.05

0.1 0.15

0.2 0.25

0.3

Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

b Tổng hoạt tính của enzym

- Tổng hoạt tính của enzym thô = 524,6 (U)

- Tổng hoạt tính của enzym sau tinh chế = 180,5 (U)

→ Như vậy, sau tinh chế thì tổng hoạt tính của dịch enzym bị giảm đi so với dịch thô

c Hoạt tính chuyên biệt của enzym

- Hoạt tính riêng của enzym thô là 6,82 (U/protein)

- Hoạt tính riêng của enzym tinh chế là 11,81 (U/protein)

- Mức tinh chế là 1,73 lần

→ Như vậy, sau tinh chế thì hoạt tính của enzym amylase trong 1 mg protein tăng so với trước tinh chế

d Quy trình tinh chế enzym

→ Kết luận: Vậy quá trình tinh chế đã có hiệu quả

10 ml enzym thô + 30 ml sodium alginate 2%

Lọc lấy tủa

Lọc lấy dịch (amylase tinh chế)

+ 20 ml glucose 2%

Ở 4oC, trong 12 giờ Khuấy đều, ủ trong 1 giờ + 20 ml CaCl2 0,7M

Bài 4 Cố định CGTase lên alginat

4.1 Tóm tắt lý thuyết

- Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin

- Cố định giúp tận dụng và tăng cường tính ổn định, hoạt tính của CGTase đắt tiền

- Phân loại phương pháp cố định:

• Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…

• Phương pháp liên kết cộng hóa trị

• Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel

• Phương pháp tạo vi nang

- Cố định CGTase lên chất mang là alginat Xác định hàm lượng protein cố định bằng thuốc thử Bradford, đo OD 595nm

- Hoạt tính CGTase cố định được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin do CGTase tạo ra từ maltodextrin trong điều kiện xác định dựa vào khả năng hấp phụ và làm mất màu phenolphtalein của cyclodextrin

4.2 Kết quả và bàn luận

4.2.1 Hàm lượng protein

a Đường chuẩn BSA

Bảng 4.1 Thông số đường chuẩn BSA

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Hàm lượng protein (mg)

Enzym không CĐ theo bắt giữ 0,7929 Vgộp = 41 1/17 1,58

Enzym không CĐ theo hấp phụ 0,8065 Vgộp = 40 3/17 4,84

Hoạt tính chung (U)

Hoạt tính riêng (U/mg protein)

Enzym CĐ theo bắt giữ 0,6015 0,3677 10/0,6 8,59 1,609

Enzym CĐ theo hấp phụ 0,6186 0,5282 10/0,6 2,77 1,332

y = 0.2412x + 0.0221 R² = 0.9659

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ:

𝐻% = 𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ

𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 𝑥 100% =

5,346,92 𝑥 100% = 77,17%

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ:

𝐻% = 𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ

𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 𝑥 100% =

2,086,92 𝑥 100% = 30,06%

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp bắt giữ:

𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ

𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝑥 100% =

1,6092,828 𝑥 100% = 56,90%

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp hấp phụ:

𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ

𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝑥 100% =

1,3322,828 𝑥 100% = 47,10%

c Nhận xét về hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym

- Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao hơn phương pháp hấp phụ (gấp 2,57 lần)

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng cao hơn phương pháp hấp phụ (gấp 1,21 lần)

b Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp hấp phụ

c Trong bài thực tập

- Enzym được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ

- Nguyên tắc: Cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel

- Đệm Tris-HCl pH 8 để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu Tránh dùng đệm phosphate vì gel alginate không bền

10 ml alginate 2%

Cốc chứa 20 ml CaCl2 0,2M

Nhỏ từng giọt

Để yên 45 phút Lọc + 20 ml đệm Tris-HCl pH 8

Bài 5 Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

- Bài thực tập thực hiện tinh chế protein có chứa his-tag bằng IMAC (sắc ký ái lực ion kim loại) Các ion này có ái lực với đoạn peptid có nhiều histidine (polyHistidine), đặc biệt là 6 – 10 histidine Chất dùng để thôi protein là imidazole nồng độ > 100mM

- Trong sắc ký IMAC, vai trò của Imidazol trong từng loại đệm:

• Đệm chạy: Loại protein tạp không gắn với cột

• Đệm rửa: Loại protein tạp gắn không đặc hiệu với cột

• Đệm thôi: Loại protein đích có đoạn peptid chức năng

5.2 Kết quả và bàn luận

5.2.1 Kết quả xác định hàm lượng protein

Áp dụng kết quả đường chuẩn BSA trong bài 5 có 𝑦 = 0,2412𝑥 + 0,0221

Bảng 5.1 Hàm lượng protein trong các phân đoạn