Báo cáo thực tập công nghệ sinh học dược

TÓM TẮT LÝ THUYẾT – Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và nuôi c

I TÓM TẮT LÝ THUYẾT

– Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và nuôi cấy bảo quản chúng trong môi trường thích hợp

Công việc này bao gồm các bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống

– Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, có thể dựa vào:

 Chất chuyển hoá tạo ra: tạo kháng sinh, tiết sắc tố, …

 Enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase – tinh bột,

protease – gelatin, …

 Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật

 Sự thay đổi hình thái của vi sinh vật

– Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống trên thạch, giữ giống dưới lớp dầu khoáng, giữ giống trong cát, đông lạnh, đông khô Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường dựa vào kinh nghiệm

– Trong bài thực hành này, ta tiến hành:

 Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại bào

Môi trường phân lập: thạch tinh bột

Thuốc thử: Lugol (dung dịch iod)

Vi sinh vật có sinh amylase sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (tinh bột bị phân giải thành glucose, nên không tạo màu với iod thuốc thử)

 Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại bào

Môi trường phân lập: thạch gelatin

Thuốc thử: TCA (acid trichloroacetic)

Vi sinh vật có sinh protease sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (gelatin bị phân giải nên không tạo tủa với TCA)

 Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của

nó với vi sinh vật khác

Có 2 phương pháp: vạch thẳng vuông góc và khuếch tán

Chủng thử nghiệm sử dụng: S aureus, E coli

BÀI 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

II KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase

Đường kính khóm (mm)

Đường kính vòng phân giải (mm)

Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở

37oC trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào

2 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào

Bảng 2 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease

Đường kính khóm (mm)

Đường kính vòng phân giải (mm)

3 Phân lập và phát hiện vi sinh vật chủng có khả năng tiết kháng sinh

a Phương pháp vạch thẳng vuông góc

Bảng 3 Kết quả của phương pháp vạch thẳng vuông góc

Đĩa Kết quả Khoảng cách từ chủng kiểm tra

I TÓM TẮT LÝ THUYẾT

– Probiotic là vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khoẻ vật chủ

– Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật làm probiotic bao gồm:

 Tính an toàn: không gây bệnh, gây độc, …

 Tính đề kháng kháng sinh: có mang gene đề kháng hay không, nếu có thì có khả

năng lây nhiễm sang vi sinh vật khác không

 Chức năng: có chức năng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, chống tiêu chảy, …

 Các yêu cầu công nghệ: sản xuất qui mô lớn, tính ổn định trong bảo quản, …

 Khả năng sống sót khi đến đường tiêu hoá: chịu được dịch vị, muối mật

– Ở bài thực hành này, ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào sinh

dưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị nhân tạo (ở các pH

1, 3) và dịch mật nhân tạo (ở nồng độ muối mật 0,3%, 0,5%)

II KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo

Tế bào sinh dưỡng

BÀI 3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI

CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC

Trong đó, số lượng tế bào sinh dưỡng giảm rất nhanh, còn bào tử giảm ít hơn

– Tế bào sinh dưỡng không mọc được ở pH 1 và mọc ít ở pH 3

Bào tử ở pH 1 vẫn mọc được nhưng nhỏ hơn pH 3

Giải thích

– Bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những điều kiện khắc nghiệt của môi trường Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, và giảm ít hơn so với tế bào sinh dưỡng

2 Đánh giá khả năng chịu muối mật

Tế bào sinh dưỡng

Thời gian (giờ)

– Theo thời gian, số bào tử giảm không đáng kể

– Số bào tử ở nồng độ muối mật 0,3% mọc nhiều hơn so với nồng độ muối mật 0,5%

I TÓM TẮT LÝ THUYẾT

– Amylase là enzyme thuỷ phân tinh bột, có ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật

– Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, y dược

– Xác định hoạt độ của amylase được thực hiện theo phương pháp Heinkel

Hoạt độ của amylase được tính bằng lượng tinh bột bị phân giải dựa trên mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod

Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 15 phút ở 30o

V: thể tích thu được (ml) n: độ pha loãng (lần)

OD280: mật độ quang của mẫu đo tại bước sóng 280 nm

Bảng 1 Hàm lượng protein

Thể tích thu được Độ pha loãng OD 280 A 280

BÀI 4 TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINATE

2 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

Công thức tính toán

U/ml là số mg tinh bột do 1 ml amylase phân giải trong 15 phút

Trong bài này, ta sử dụng 0,1 ml amylase, nên:

U/ml = Lượng tinh bột (mg) x 10

Bảng 2 Tương quan giữa lượng tinh bột và giá trị ΔOD560

Đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

3 Thông số qui trình tinh chế

Lượng tinh bột phân giải (mg)

∆OD

560

Bảng 3 Kết quả đo của enzyme thô và sau tinh chế

Enzyme thô Enzyme sau tinh chế

 Hoạt tính chuyên biệt =

 Hiệu suất =

 Mức tinh chế =

Bảng 4 Các thông số của qui trình tinh chế enzyme

Hoạt tính chuyên biệt của enzyme thô Hoạt tính chuyên biệt của enzyme sau tinh chế

Nhận xét

– Sau quá trình tinh chế, hoạt tính chuyên biệt của amylase tăng lên

– Hiệu suất tinh chế còn thấp, lượng amylase bị thất thoát trong quá trình tinh chế

Có thể là do thao tác chưa chính xác, cẩn thận trong bước thôi enzyme (amylase thôi chưa hết), lọc lấy dịch (amylase còn sót trong tủa gel), … cũng như trong quá trình đo quang Ngoài ra cần khảo sát thời gian tối ưu của quá trình ủ

– Để đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế, có thể dựa vào mức tinh chế amylase Theo

lý thuyết, mức tinh chế trên 1 là đạt yêu cầu (tốt nhất là trên 4)

Mức tinh chế trong bài là 2,24 lần, đạt yêu cầu nhưng còn thấp Có thể là do trong quá

trình tinh chế chưa cẩn thận đã làm giảm hoạt tính của amylase

4 Câu hỏi

Sơ đồ tinh chế amylase bằng alginate:

Nghiền khoai lang với đệm phosphate 1 : 1

 Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, …

 Liên kết cộng hoá trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo phức hợp

enzyme – chất mang có liên kết cộng hoá trị

 Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ chất

và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường

 Tạo vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200

o

A (như cellulose, polysaccharid)

– Trong bài thực hành này, enzyme được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ Nguyên tắc là cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám trên

bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel

Đệm Tris–HCl pH = 8 để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu Tránh dùng đệm phosphate vì gel alginate không bền

Bảng 1 Các điểm khác biệt giữa phương pháp hấp phụ và bắt giữ enzyme

Tạo gel Ca–alginate trước, sau đó

mới cho enzyme vào hấp phụ

Gel Ca–alginate được tạo cùng lúc bắt giữ enzyme

Thời gian ủ lâu (45 phút) Thời gian ủ nhanh (10 phút)

BÀI 5 CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINATE

C x n x 2

II KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định

a Xây dựng đường chuẩn định lượng protein

Bảng 2 Tương quan giữa nồng độ BSA và ΔOD595

Đường chuẩn xác định nồng độ protein

b Tính hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase

Công thức tính toán

 Nồng độ protein mẫu đo tính theo đường chuẩn y = 0,0134x – 0,0332

 Hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase tính theo công thức:

y = 0.0134x + 0.0332

R² = 0.9917

0.000 0.150 0.300 0.450 0.600 0.750

∆OD 595

Nồng độ BSA (μg/ml)

C x V

1000

mcố định

mban đầu

Trong đó, mban đầu: hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase (mg)

C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) n: độ pha loãng (lần)

Bảng 3 Kết quả đo protein trong chế phẩm CGTase

C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) V: thể tích dịch gộp (ml)

 Hàm lượng protein không cố định được tính theo công thức:

mcố định = mban đầu – mkhông cố định

Nhận xét

Hiệu suất cố định bằng phương pháp bắt giữ cao hơn so với phương pháp hấp phụ

Có thể giải thích rằng, phương pháp bắt giữ là phương pháp cố định không thuận nghịch, CGTase bị nhốt trong hạt gel không thoát ra được

Còn phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định thuận nghịch, CGTase chỉ bám lên bề mặt hạt gel

2 Kết quả xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và hoạt tính enzyme cố định

a Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin

Bảng 5 Tương quan giữa nồng độ cyclodextrin và ΔOD550

∆OD 550

Nồng độ CD (mg/ml)

Trong đó, A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml)

CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml)

n = 40: độ pha loãng (lần)

M = 1135: khối lượng phân tử cyclodextrin

t = 15 phút: thời gian phản ứng

10: tỷ lệ enzyme phản ứng (có 0,1 ml enzyme tham gia phản ứng)

 Tổng hoạt tính CGTase ban đầu = A x 2

Giá trị 2 là số ml CGTase ban đầu được dùng

 Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu (U/mg) =

Bảng 6 Kết quả đo hoạt tính enzyme ban đầu

c Xác định hoạt tính enzyme sau cố định

Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu Hoạt tính riêng của CGTase sau cố định

Tổng hoạt tính CGTase sau cố định Hàm lượng protein cố định

Trong đó, A: hoạt tính CGTase cố định trong 1 ml dung dịch (U/ml)

CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml)

 Tổng hoạt tính CGTase sau khi cố định = A x V

Trong đó, A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml)

Tỉ lệ hoạt tính (%) 39,43% 58,75%

Nhận xét

Hoạt tính của enzyme cố định giảm nhiều so với enzyme tự do ban đầu

Vì cố định enzyme ít nhiều làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme cũng như cản trở không gian tiếp xúc giữa cơ chất – enzyme, dẫn đến hoạt tính enzyme sau cố định thường giảm đi

3 Câu hỏi

Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp hấp phụ

Rửa 2 lần với đệm Tris–HCl

Nhỏ từ từ 15 ml alginate 2% vào 30 ml CaCl2

Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp bắt giữ

Rửa 2 lần với đệm Tris–HCl

2 ml enzyme + 15 ml dung dịch alginate

I TÓM TẮT LÝ THUYẾT

– Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp được sử dụng phổ biến để tinh chế protein Đây là phương pháp tách các chất tan dựa vào lực hút tĩnh điện trái dấu giữa các phân

tử chất tan với các nhóm mang điện tích trên nhựa trao đổi ion

– Nhựa trao đổi ion được chia làm 2 loại: nhựa cationit và nhựa anionit

Nhóm mang điện tích trên nhựa mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào mức biến động của sự ion hoá theo pH, chứ không phải là độ mạnh của liên kết

Nhựa trao đổi mạnh có khả năng hoạt động trong dải pH rộng hơn, bị ảnh hưởng bởi

pH môi trường

– Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion dựa trên cơ sở điểm đẳng điện pI Nó là giá trị

pH mà protein có tổng điện tích bằng 0 Như vậy:

 Khi pH > pI, protein sẽ tích điện âm

 Khi pH < pI, protein sẽ tích điện dương

– Lysozyme có pI = 10, còn các protein khác trong lòng trắng trứng có pI ≤ 6

Do đó, ta sử dụng nhựa cationit tại pH = 8 thì lysozyme tích điện dương và bị giữ lại trên cột sắc ký, các protein khác tích điện âm và đi ra khỏi cột Sau đó lysozyme được thôi ra bằng cách nâng pH lên 10, hoặc tăng nồng độ ion trong dung dịch để cạnh tranh

và đẩy lysozyme ra ngoài

II KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford bài 5:

y = 0,0134x + 0,0032 (R2 = 0,9917)

1 Mẫu thử protein

Công thức tính toán

Lượng protein (μg) = Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) x Độ pha loãng x Thể tích (ml)

BÀI 10 TINH CHẾ LYSOZYME

BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

pI

Protein tích điện (–) Protein tích điện (+)

Mẫu gộp D Mẫu A

13,52 304,48

Bảng kết quả sắc ký trao đổi ion

Tổng lượng protein trong mẫu gộp D = 6,03 + 3,64 + 1,48 + 2,37 = 13,52 (µg)

Tổng lượng protein trong mẫu B, C và D = 61,80 + 16,55 + 13,52 = 91,87 (µg)

– Thực tế lysozyme trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất nhỏ

– Hiệu suất thấp có thể do:

 Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, còn làm tung nhựa trao đổi

 Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả đo quang

 Chưa hoạt hoá tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký

2 Câu hỏi

Sơ đồ tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion

Ly tâm lấy dịch 1ml lòng trắng trứng nạp lên cột

Rửa cột với đệm chạy, tốc độ 1–2 ml/phút, đến khi

không còn protein

Thôi lysosym bằng đệm thôi, tốc độ 1 ml/phút

Hứng thu dịch B Tốc độ 0,5–1 ml/phút

Hứng dịch chảy ra C

Thu dịch theo từng ml Kiểm tra đến khi hết protein

Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích đệm chạy

Định lượng đo quang