BÁO cáo THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH học ỨNG DỤNG TRONG bảo vệ THỰC vật

Phân lập và làm thuầnChọn mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu + 10ml nước cất vô trùng Dùng chày vô trùng nghiền mịn mẫu 200µl dịch nghiền mẫu cho vào ống môi trường NA bán đặc ủ 300C, 1-3 ngày

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ

THỰC VẬT

GVHD: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

TS Hồ Bảo Thùy Quyên

Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 3

1 Trần Hồng Ngọc Huyền 1753010090

2 Thái Thị Thúy Kiều 1753010106

3 Lê Thị Ý 1753010310

Ngày 31 tháng 8 năm 2020

Bài 1: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH

I Các bước thực hiện

1 Thu thập và xử lý mẫu (Khử mẫu)

Mẫu cây cúc xuyến chi

Rửa sạch dưới vòi nước chảy mạnh Lấy phần lá làm mẫu khử

(Cắt đoạn 2 – 4cm)

Ngâm mẫu trong ethanol 70%, 5 phút

Ngâm trong trung dịch javel, 3-5 phút

Ngâm trong ethanol 70%, 30s – 2 phút

Rửa mẫu với 5 lần nước cất vô trùng

Kiểm tra mẫu

(200µl nước cất vô trùng đã

rửa mẫu ở lần 5 trang lên đĩa

môi trường NA và PDA, ủ

370C 24 giờ

Đặt mẫu lên giấy thấm vô trùng cho ráo nước

2 Phân lập và làm thuần

Chọn mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu + 10ml nước cất vô trùng

Dùng chày vô trùng nghiền mịn mẫu

200µl dịch nghiền mẫu cho vào ống môi trường NA bán đặc

ủ 300C, 1-3 ngày

Lấy sinh khối vi khuẩn đã tăng sinh, cấy ria trên đĩa môi trường NA

ủ 300C, 1-3 ngày

Chọn khuẩn lạc rời cấy cấy ria trên đĩa môi trường NA

(làm thuần lần 1)

Tiếp tục làm thuần đến khi chỉ có một loại khuẩn lạc trên đĩa

Cấy giữ chủng vào ống thạch nghiêng NA (40C)

II Kết quả

1 Kiểm tra mẫu khử trùng

Hình 1: Kết quả kiểm tra mẫu khử trùng A: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Thái Thị Thúy Kiều

C: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Lê Thị Ý

 Nhận xét:

- Trên đĩa môi trường NA có sự hiện diện của một số khuẩn lạc

 Đại diện 1 nhóm khử mẫu lá nên việc thao tác chưa được thực hiện

 Có thể vẫn còn một số vi khuẩn bề mặt do xử lý chưa đạt

 Do thao tác thực hiện gây vấy nhiễm VSV khác

- Trên đĩa môi trường PDA không có sự hiện diện của nấm

B A

C

 Mẫu khử trùng cũng chưa loại bỏ được nấm bề mặt

 Vì chỉ có một mẫu nước khử duy nhất để sử dụng nên đĩa C có thể đốt que trang quá nóng nên cả đĩa NA và PDA đều không có sự xuất hiện của khuẩn lạc hay nấm

2 Phân lập và làm thuần

a. Kết quả của quá trình tăng sinh mẫu cần phân lập

Hình 2: Kết quả của quá trình tăng sinh mẫu

b Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn sau tăng sinh

Có xuất hiện một lớp

màng mỏng pellicle cách

môi trường nuôi khoảng

0.5cm chỉ thị có sự xuất

hiện của vi sinh vật nội

sinh

A

Hình 3: A: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Thái Thị Thúy Kiều C: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Lê Thị Ý

c Kết quả của quá trình làm thuần

Hình 4: A: Kết quả của quá trình làm thuần lần 1 của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kết quả của quá trình làm thuần lần 1 của Thái Thị Thúy Kiều

C: Kết quả của quá trình làm thuần lần 1 của Lê Thị Ý

 Nhận xét:

- Trên đĩa phân lập A xuất hiện các khuẩn lạc có hình thái giống nhau, cần

nhuộm gram để so sánh với mẫu Bacillus trong PTN

- Đĩa B và C cũng có các khuẩn lạc có hình thái giống nhau

C B

A

d Kết quả quá trình giữ chủng

Hình 6: A: Kết quả cấy giữ chủng của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kết quả cấy giữ chủng của Thái Thị Thúy Kiều

C B

A

 Nhận xét:

- Kết quả quá trình cấy giữ chủng không bị xâm nhiễm bới các sinh vật lạ.

III. Khảo sát một số đặc điểm của chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập được

1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và trạng thái sống

Hình 7: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch

2 Nhuộm gram

a Các bước nhuộm gram

Nhỏ giọt nước lên phiến kính Tạo huyền phù với vi khuẩn

Hơ nóng nhẹ, cố định mẫu Nhuộm với Crystal violet (1-2 phút), rửa sạch bằng nước Nhỏ dung dịch lugol (30 giây), rửa nhẹ lại với nước Tẩy cồn 960 (15-30 giây), rửa lại với nước Nhuộm với safarin O (1 phút), rửa lại với nước Thấm khô phiến kính, rồi quan sát dưới kính hiển vi

b Kết quả nhuộm gram

Hình 8

A: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp phòng thí nghiệm của Trần Hồng Ngọc

Huyền

B: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp phòng thí nghiệm của Thái Thị Thúy Kiều

C: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp phòng thí nghiệm của Lê Thị Ý

Hình 9: A: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Thái Thị Thúy Kiều C: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Lê Thị Ý

C B

A

C B

A

3 Thử nghiệm catalase

a Cách thực hiện

Nhỏ một giọt H2O2 3% trên lam kính Dùng que cấy lấy một ít sinh khối của khuẩn lạc hòa vào giọt H2O2

b Kết quả

Hình 10: Kết quả thử nghiệm catalase của chủng Bacillus sp phòng thí nghiệm

Hình 11: A: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Thái Thị Thúy Kiều

C: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Lê Thị Ý

C B

A

IV Báo cáo kết quả

Bảng 1: So sánh các chỉ tiêu quan sát đại thể và vi thể vi khuẩn

Các chỉ tiêu

Chủng

Bacillus sp.

phòng thí nghiệm

Chủng phân lập của Trần Hồng Ngọc Huyền

Chủng phân lập của Thái Thị Thúy Kiều

Chủng phân lập của Lê Thị Ý

Khuẩ

n lạc

Hình dạng Mép răng cưa Mép tròn, lồi Mép răng cưa Mép răng cưa Màu sắc Vàng nhạt Trắng đục Vàng xanh Vàng xanh

Bề mặt Nhăn nheo Trơn Hơi nhăn Hơi nhăn

Hiển

vi

Hình thái Hình trực

ngắn Hình cầu Hình trực ngắn

Hình trực ngắn

Cách bắt màu Tím Tím Tím Tím Bào tử Hình bầu duc Chưa xác định* Chưa xác định* Chưa xác định*

Di động Có Chưa xác

định**

Chưa xác định**

Chưa xác định** Catal

+

*: Cần phải thực hiện kỹ thuật nhuộm bào tử mới có thể xác định được có bào từ hay không

**: vi khuẩn quá nhỏ nên không thể quan sát đc

Bài 2: ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH ( DNA BARCODE) HỖ TRỢ DDIHJ DANH

CÔN TRÙNG I: Quy trình thực hiện

Dùng dao cắt chân côn trùng

Ly trích (ngâm mẫu trong cồn tuyệt đối)

Thấm khô mẫu

Nghiền mẫu trong 20µl NaOH 50%

Ủ ở 95°C, 15 phút

Làm trung tính mẫu bằng 2µl strip HCL

II: phản ứng PCR

1 Thành phần phản ứng PCR

- Master mix: 6µl

- Mồi xuôi COI 1490 ( 10µM/ml): 0.75µl

- Mồi ngược COI 2198 ( 10µM/ml): 0.75µl

- DNA: 4µl

- H2O: 0.5µl

- Tổng: 12µl

2 Chu kỳ cho phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ

2

95 30 giây

35

30 giây

72 30 giây

3 Đổ gel và chạy điện di

a Đổ gel

1g agarose + 100 ml dung dịch TAE

Đun bằng lò vi sóng đến khi tan

Để nguội 60°C và đổ vào khuôn có để sẵn lược

Để nguội và chô khuôn vào bể

b Chạy điện di

Đổ đầy TAE 1X ngập khay điện di

Hút 1µl dung dịch Gelred + 4µl DNA trộn đều trên mảnh paraffin

( thang chuẩn: 1µl thang chuẩn ladder + 1µl Gelred)

Cắm điện cực cho dòng điện chạy từ (-) sang (+)

III: Kết quả

1 Kết quả đo OD

Hình 12 A: Kết quả đo OD của Trần Hồng Ngọc Huyền

B: Kết quả đo OD của Thái Thị Thúy Kiều

C: Kết quả đo OD của Lê Thị Ý

- Hàm lượng DNA:

Huyền: OD260 × 50 × nồng độ pha loãng = 0,358 × 50 × 100= 1790 µg/ ml

Ý: OD260 × 50 × nồng độ pha loãng = 0,598 × 50 × 100 = 2990 µg/ ml

Kiều: OD260 × 50 × nồng độ pha loãng = 0,378 × 50 × 100 = 1890 µg/ ml

C B

A

- Độ tinh sạch của DNA:

Tỉ lệ 260/280 < 1,8: Mẫu bị tạp nhiễm

260 nm 0,358 0,598 0,378

280 nm 0,367 0,419 0,367

260/280 0,97 1,43 1,03

- Kết quả: Cả ba mẫu đều có tỉ lệ 260/280 < 1,8 => Mẫu bị tạp nhiễm, chưa được tinh sạch

- Biện luận:

+ Mẫu nhiễm tạp chất có thể do sai sót trong quá trình thao tác, dụng cụ đo mật độ quang chưa vệ sinh kĩ

+ Trong sản phẩm chứa nhiều protein cần phải sử lý thêm Protease K

2 Kết quả điện di

C A

B

Hình 14: A: Kết quả điện di mẫu DNA côn trùng của Ngọc Huyền

B: Kết quả điện di mẫu DNA côn trùng của Thúy Kiều

A: Kết quả điện di mẫu DNA côn trùng của Lê Thị Ý

 Kết quả:

- Mẫu DNA C xuất hiện sản pahmar 700 bp giống với kích thước lúc khảo sát, 2 mẫu A và B xuất hiện smear, chưa khuyếch đại thành công gen mong muốn

 Biện luận:

- Nguyên nhân có thể là: Mẫu bị tạp nhiễm, nhiệt độ bắt cặp DNA không đảm bảo

 Giải trình tự

- Các sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen COI có kết quả dương tính (kích thước khoảng 700 bp với COI sẽ được gửi giải trình tự ở công ty)