BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng từ tự nhiên hay gây đột biến và phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên Để chọn lọc được giống vi sinh vậ

1.1 Tóm tắt lý thuyết……… …1

1.2 Kết quả……….………….………5

1.3 Bàn luận……… ……… ……9BÀI 2 TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT………

….12

2.1 Tóm tắt lý

thuyết……….12

2.2 Kết quả………16

4.3 Bàn luận……… 32

BÀI 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

1.1 Tóm tắt lý thuyết

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình công nghệ do các ưu thế như dễ nuôicấy ở qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng được các cơ chất rẻ tiền và khả năng chonhiều sản phẩm đa dạng Phân lập và tuyển chọn giống vi sinh vật từ các nguồn gen tự nhiênhoặc cải tạo từ việc gây đột biến nhằm tạo ra giống có hoạt tính, có các đặc tính mong muốn

và khả năng cạnh tranh cao Bên cạnh đó việc chọn lọc giống sẽ không có ý nghĩa nếu chủngkhông được bảo quản để có thể sống sót và ổn định các tính trạng thu được

1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng từ tự nhiên hay gây đột biến và phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn

Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên

Để chọn lọc được giống vi sinh vật thích hợp, bước đầu tiên là chúng ta có thể phân lậpchúng theo kiểu “săn lùng” từ các nguồn tự nhiên như mô, xác của động vật, thực vật, đất,chất thải, nước thải hoặc khu trú và định hướng vào các nơi sinh sống tự nhiên của vi sinhvật như lớp bùn trầm tích dưới ao hồ, các lò mổ, giếng dầu,…

Nguyên tắc của phương pháp

 Trước hết chọn và kiểm tra sơ bộ địa điểm lấy mẫu để thu được mẫu vi sinh vật có đặctính mong muốn Lấy mẫu (ví dụ trong bài thực tập mẫu sẽ được lấy từ đất), thêm 10 mlPBS, vortex, để lắng và pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp số 10 đến ống số 6

 Hút 100 µl huyền phù vi sinh vật ở 3 cấp độ cuối (4, 5, 6), trải lên môi trường thích hợp

và ủ ở nhiệt độ thích hợp (37 ˚C trong 24 giờ đối với vi khuẩn, nhiệt độ phòng trong 7ngày đối với vi nấm, xạ khuẩn)

Các phương pháp đột biến

Các tác nhân gây đột biến chia thành ba nhóm:

- Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y hoặc bắn phá bằng hạt nơtronhay electron

- Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozomethylguanidin,methyldicloroetylamin, nitrit, hydroxylamin hay ethylametansunfonat

- Những tác nhân sinh học: Gây đột biến bằng Transposon Thông qua tiếp hợp, cácplasmid mang Transposon (yếu tố Tn) đến tế bào cần gây đột biến và có thể chuyển đếncác vị trí khác trên nhiễm sắc thể hay plasmid và làm gián đoạn các gen tại đó dẫn đếnđột biến

Để phân lập và tăng sinh thể đột biến có thể đạt được bằng một số cách thông dụng sau

- Nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa chất ức chế như kháng sinh, chất độchay thực khuẩn, chỉ những thể đột biến kháng chất ức chế mới mọc được

- Nuôi cấy trên môi trường thiếu chất tăng trưởng nhưng chứa kháng sinh như Penicillinhay các chất khác chỉ để tiêu diệt tế bào đang tăng trưởng, thể đột biến khuyết dưỡngkhông mọc trên môi trường tối thiểu nên sống sót Sau đó trải lên môi trường hoànchỉnh thì môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên thể đột biến mọc được

- Thêm môi trường nuôi cấy chất kháng chuyển hóa, do có cấu trúc giống với chấtchuyển hóa thông thường nên các chất kháng chuyển hóa tham gia vào quá trình traođổi chất, nhưng do không có chức năng sinh học nên làm các tế bào bình thườngkoong thực hiện được đầy đủ chức năng sống dẫn tới tác dụng ức chế và chết tế bào.Các thể đột biến mất khả năng sử dụng được các chất này hoặc do đột biến mất khảnăng điều hòa nên sản xuất vượt mức chất chuyển hóa bình thường nên không sử dụngcác chất kháng chuyển hóa dẫn tới vẫn tăng trưởng bình thường

Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn

Bảng 1.1 Bảng trình bày một số loại đặc tính của vi sinh vật và phương pháp sàng lọc

1 Amylase ngoại bào Tạo được amylase ngoại bào

Thủy phân tinh bột trongmôi trường nên tinh bột khôngtạo màu tím với lugol Xungquanh khóm khuẩn có vòngsáng

2 Protease ngoại bào Tạo được protease ngoại bào

Thủy phân gelatine trong môitrường nên gelatine không bịtủa khi tráng lên môi trườngTCA Xung quanh khóm khuẩn

có vòng sáng

3 Kháng sinh Tạo được kháng sinh

Có khả năng ức chế sự tăngtrưởng của các vi sinh vật khácbằng cách tạo vùng ức chế xungqunah lỗ cấy

4 Không di động Mất tiêm mao hoặc tiêm maokhông hoạt động Khuẩn lạc mọc dính vào nhau

5 Không tạo nha bào màn nhầyMất hoặc thay dổi bề mặt Khuẩn lạc bé, xù xì

6 Khuẩn lạc xù xì ngoài lipopolysaccharideMất hoặc thay đổi lớp bên Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ,không đều.

7 Dinh dưỡng Mất 1 hoặc nhiều enzymsinh tổng hợp Không mọc trên môi trườngtổng hợp tối thiểu.

8 Lên men đường Mất enzym phân giải cácloại đường

Không tạo ra sự biến đổi màutrên môi trường đặc trưng vớichất chỉ thị màu

9 Kháng thuốc

Thay đổi khả năng thẩmthấu, ngăn cản sự xâm nhậpvào tế bào của các loạithuốc, hoặc phá hủy cácthuốc

Mọc trên môi trường có thuốcnồng độ mà bình thường cóthể gây ức chế phát triển của visinh vật

10 Kháng virus Mất điểm tiếp nhân virus

Phát triển trên môi trường nuôicấy khi có mặt virus ở nồng độcao

11 độ bình thườngNhạy cảm với nhiệt

Thay đổi một protein thiếtyếu làm tăng sự nhạy cảmvới nhiệt độ

Phát triển có nhiệt độ thấp cóthể, không phát triển ở nhiệt độbình thường

12 Mất sắc tố Mất các enzym có khả năngtham gia tổng hợp sắc tố Có màu khác hoặc mất màu

Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định được khả năng sinh enzym phùhợp với yêu cầu sản xuất qui mô lớn trong công nghiệp hoặc hoạt tính kháng khuẩn,kháng nấm, virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập Để xác định khảnăng sinh enzym, phương pháp áp dụng là trải vi khuẩn lên môi trường có chứa chất cảmứng và sử dụng chỉ thị thích hợp để phát hiện Phương pháp chủ yếu được sử dụng trongviệc tìm chủng sản xuất các chất kháng sinh thường dùng hai kiểu kỹ thuật:

 Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định

 Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định

Đối với trong bài thực tập thì sẽ sử dụng 4 chủng Bacillus và khảo sát tác dụng với 2 chủng thử nghiệm là Staphylococcus và E.coli.

1.1.2 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật

Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: (thời gian cấy truyền 1 tuần - 1 tháng)

- Cấy truyền trên môi trường dịch thể

- Cấy truyền trên môi trường thạch

 Ưu điểm: đơn giản, dễ làm

 Nhược điểm: tốn công sức, môi trường và thời gian: không ổn định

Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng: vaselin, parafin,

(giữ chủng 1- nhiều năm)

- Đơn giản, hiệu quả cao

- Môi trường không bị mất nước

- Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với cấy truyền vi sinh vật

Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát và trên hạt

- Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử

- Thời gian bảo quản 1- nhiều năm

Phương pháp đông lạnh

- Phương pháp đơn giản

- Vi sinh vật giữ được lâu 6 tháng - 10 năm

Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp

- Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp

- Làm giảm hoặc làm ngừng quá trình phân chia của vi sinh vật

- Vi sinh vật không bị biến đổi về các đặc tính di truyền

- Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm

- Được dùng nhiều trong sản xuất

1.2 Kết quả

1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease

 Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym

Môi trường phát hiện ở mức pha

Môi trường phát hiện ở mức pha

Hình 1.2.Khuẩn lạc được phân lập trên môi trường thạch gelatin tương ứng từng cấp độ pha loãng

 Đĩa phân lập Amylase ngoại bào trên thạch tinh bột và Protease ngoại bào trên thạchgelatin

Phát hiện Amylase ngoại bào

Hình 1.3. Đĩa thạch tinh bột hiện màu tím than sau khi tráng bề mặt với dung dịch Lugol dùng để

phát hiện Amylase ngoại bào

Phát hiện Protease ngoại bào

Hình 1.4. Đĩa thạch gelatin bị đục sau khi tráng bề mặt với TCA 50% dùng để phát hiện Protease

ngoại bào

1.2.2 Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

Hình 1.1. Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2, B3, B4 kí hiệu tương ứng

trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải Staphylococcus

Mặt trước Mặt sau

Hình 1.2. Kiểm tra khả năng sinh kháng sinh của 4 chủng Bacillus B1, B2, B3, B4 kí hiệu tương

ứng trên cả 2 đĩa là 1, 2, 3, 4 trên đĩa thạch trải E.coli

1.2.3 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào và sinh kháng

sinh

Bảng 1.1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

(**)

Protease (**)

Đường kính vòng phân giải: 6 mm

 Đường kính vùng kháng khuẩn: 3 mm

nheo, bìa răng cưa, không nhô,

giải: 4 mm

 Đường kính vùng kháng khuẩn: 2 mm

*Mô tả khuẩn lạc gồm: hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc

** Ghi nhận đường kính vòng phân giải, hoặc đường kính vùng kháng khuẩn

1.2.4 Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

Bảng 1.1. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh

Đường kínhvùng khángkhuẩn

Đườngkính lỗ

Đường kínhvòng phângiải

Đường kínhvùng khángkhuẩn

Ghi nhận đường kính vùng kháng khuẩn, trong đó đường kính vùng kháng khuẩn = đường kính

vòng phân giải – đường kinh lỗ

1.3 Bàn luận

Hinh 1.2 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch tinh bột tương ứng 3 cấp độ pha loãng khác

nhau và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng

và kích thước khác nhau sau khi nuôi cấy 24 giờ Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên

các đĩa thạch tương ứng

Hinh 1.3 thể hiện 3 đĩa môi trường thạch gelatin tương ứng 3 cấp độ pha loãng khác nhau

và xuất hiện các khóm khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng bởi 2 loại khóm có hình dạng và

kích thước khác nhau sau khi nuôi cấy 24 giờ Bảng 1.2 thể hiện kết quả phân lập trên các

đĩa thạch tương ứng

Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch tinh bột số 4 (Hình 1.2) tương ứng với cấp độ pha loãng 10-4

có tổng cộng 63 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Amylase Khi tráng bề mặt môi

trường thạch tinh bột với dung dịch Lugol, nền môi trường sẽ có màu tím than do màu

của iod với tinh bột (Hình 1.4), ngoài vòng sáng do các khóm để lại sau khi đã bị rửa trôi

và đổ bỏ cùng với dung dịch Lugol còn tồn dư trên bề mặt thạch, không thấy sự xuất hiệncủa vòng sáng đặc trưng xung quanh vị trí các khóm ban đầu (vòng sáng đặc trưng dotinh bột bị amylase ngoại bào thủy phân nên không tạo màu với iod làm cho xung quanh

vị trí đó không có màu tím) Như vậy, khuẩn lạc mọc trên thạch tinh bột không có khảnăng sinh ra Amylase ngoại bào

Nhóm 3 đã chọn đĩa thạch gelatin số 4 (Hình 1.3) tương ứng với cấp độ pha loãng 10-4 cótổng cộng 59 khóm để khảo sát khả năng sinh enzym Protease Sau khi đã nuôi cấy sau

24 giờ, môi trường thạch gelatin mọc lên 2 loại khuẩn lạc, tiếp đó cho TCA 50% vào môitrường thạch gelatin, nền môi trường sẽ đục vì gelatin bị kết tủa trắng (Hình 1.5) Trong

đó, vòng sáng bao quanh các khóm trên đĩa là do vi sinh vật có sinh Protease ngoại bàolàm gelatin bị thủy phân nên không bị tủa nên đường kính của vòng phân giải gelatin tỷ lệvới hoạt tính Quan sát kĩ hơn thì nhóm thấy xung quanh chủng 4 xuất hiện vòng sángnhỏ, rõ, bao xung quanh khuẩn lạc, chủng 3 thì vòng sáng to hơn và rõ hơn, chứng tỏchủng 3 có hoạt tính enzym cao hơn so với chủng 4 Như vậy, nhìn chung thì khuẩn lạcmọc trên thạch gelatin có khả năng sinh ra Protease ngoại bào

Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng

trưởng của nó với vi sinh vật khác, trên đĩa trải E coli (Hình 1.7), trong 4 lỗ gồm B1-B4

xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ với kích thước vòng kháng khuẩn lớn nhất là B1,giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất là B4 Lỗ chứng chỉ chứa môi trường và khôngxuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ, điều đó chứng tỏ môi trường không bị tạp nhiễm từmôi trường bên ngoài

Đối với S aureus (Hình 1.6), lỗ chứng chỉ chứa môi trường và không xuất hiện vòng ức

chế xung quanh lỗ, trong 4 lỗ B1-B4 xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ trong đó khi

quan sát đường kính vòng kháng khuẩn, khả năng sinh enzym mạnh nhất vẫn là B1 và

giảm dần từ B2 xuống B3 và thấp nhất vẫn là B4 Điều này tương tự với bên đĩa trải

E.coli nên chứng tỏ hoạt tính sinh kháng sinh mạnh nhất là B1, thấp nhất là B4, hai chủng

B2 và B3 ở cả 2 đĩa trải 2 chủng thử nghiệm khác nhau đều có kích thước gần nhau và cóhoạt tính sinh kháng sinh ở mức trung bình

Tuy nhiên, khi so sánh đường kính vòng kháng khuẩn giữa hai đĩa trải 2 chủng thử

nghiệm bao gồm 1 vi khuẩn Gram dương (S.aureus) và 1 vi khuẩn Gram âm (E.coli) thì

có thể thấy vòng kháng khuẩn ở đĩa S.aureus có kích thước lớn hơn rất nhiều so với kích

thước vòng kháng khuẩn bên đĩa E.coli Từ đó nhóm có nhận xét là cả 4 chủng Bacillus

B1-B4 dùng để khảo sát có khả năng sinh kháng sinh có phổ kháng khuẩn nghiêng vềGram dương nhiều hơn và có tác động ít hơn trên vi khuẩn Gram âm Các vòng kháng

khuẩn bên đĩa trải S.aureus có sự tiếp xúc và chồng lấp ở phần mép ngoài vòng khoáng

khuẩn với nhau Tuy nhiên điều này không gây ảnh hưởng gì nhiều tới việc nhận định vàbàn luận của nhóm

Vì thời hạn cho phép của bài thực tập nên việc sàng lọc hoạt tính sinh kháng sinh của 4chủng Bacillus chỉ dừng lại ở việc cung cấp sơ bộ thông tin về hoạt tính của từng chủngcũng như phổ kháng khuẩn của cả 4 chủng khảo sát lên 2 chủng thử nghiệm Để có thểđưa ra thêm nhiều nhận định khách quan và chính xác hơn, Nhóm 3 đề nghị thực hiệnthêm một vài khảo sát như phương pháp Kirby-Bauer, phương pháp E-test để có thể xácđịnh được mức độ kháng khuẩn và các giá trị MIC mà các chủng B1-B4 có thể mang lại

Từ đó có thể chọn lọc và cải tạo giống theo chiều hướng tốt hơn

BÀI 2. TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT2.1 Tóm tắt lý thuyết

2.1.1 Enzym Amylase

Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glycosidic bên trongtinh bột thành các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, chẳng hạn như các đơn vịglucose, maltose và maltotriose

Hình 2.1. Hình minh họa quá trình thủy phân liên kết α-1,4-glycosidic của Amylase để tạo thành các

tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử thấp chẳng hạn glucoseAmylase là một trong những enzym quan trọng nhất và có ý nghĩa to lớn đối với côngnghệ sinh học Chúng có thể được lấy từ một số nguồn, chẳng hạn như thực vật, động vật

và vi sinh vật Ngày nay, một số lượng lớn các amylase của vi sinh vật được bán trên thịtrường và chúng đã gần như thay thế hoàn toàn quá trình thủy phân hóa học tinh bột trongcông nghiệp chế biến tinh bột

2.1.2 Ứng dụng của enzym Amylase

Ứng dụng của enzym amylase trong chế biến thực phẩm gia súc

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn Trongkhối lượng này, thành phần tinh bột rất cao Để tăng hiệu suất sử dụng nguồn tinh bột,người ta thường cho thêm enzym amylase vào

Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trìnhchuyển hóa tinh bột tốt hơn

Ứng dụng của enzym amylase trong dược phẩm

Amylase được sử dụng đế phối hợp với coenzym A, cytocrom c, ATP, carboxylase điềuchế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh Mặt khác amylase phối hợp với enzymthủy phân đế chữa bệnh thiếu enzym đường tiêu hóa

Trong cơ thể, amylase là hormon tuyến tuỵ ngoại tiết, có tác dụng chống phù nề sau chấnthương hoặc sau mổ Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuấn đuờng hô hấptrên hoặc dưới Các sản phầm chứa enzym alpha- amylase sẽ kiểm soát lượng calo của cơthể

Sản phẩm chứa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chốngsuy dinh dưỡng

Sử dụng enzym amylase trong chuẩn đoán bệnh viêm tụy cấp ở trẻ em

Ứng dụng của enzym amylase trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinhbột và làm cho vải mềm

Ứng dụng của enzym amylase trong việc tẩy màu giấy

Nguyên lý hoạt động của enzym là: chúng bẻ gẫy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéotheo sự lảm lỏng các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho qúa trình khửmực

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất bia

Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase: khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sangtrạng thái nảy mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thủyphân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm.

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất cồn

Quá trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa.Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase (không thể sử dụngphương pháp thủy phân tinh bột bằng acid)

Ứng dụng của enzym amylase trong sản xuất HFCS

HFCS (High Fructose Com Syrup) là một nhóm bất kì của siro bắp mà trải qua quá trìnhenzym để làm tăng hàm lượng fructose và sau đó được pha trộn với siro bắp sạch (100%glucose) để tạo thành dạng sản phẩm cần thiểt

Ngoài ra, enzym amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đườngbột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose fructose, sản xuất tương vànước chấm ở quy mô công nghiệp

Enzym amylase có thể thu nhận từ các nguồn vi sinh vật (nấm sợi, nấm men hay vikhuẩn), thực vật (có trong ngũ cốc nảy mầm với hàm lượng cao), động vật (trong tuyếntụy và tuyến nước bọt)

2.1.3 Gel alginate

Tổng quan về gel alginate

Alginate là một polyme anion có nguồn gốc tự nhiên thường thu được từ rong biển nâu,

và đã được nghiên cứu rộng rãi và sử dụng cho nhiều ứng dụng y sinh, do tính tương hợpsinh học, độc tính thấp, giá thành tương đối thấp

Các phân tử thuốc, từ thuốc hóa dược đến protein đại phân tử, có thể được giải phóngkhỏi gel alginate một cách có kiểm soát, tùy thuộc vào loại liên kết chéo và phương phápliên kết Ngoài ra, gel alginate có thể được dùng bằng đường uống hoặc tiêm vào cơ thể

và cho phép ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm Gel alginate cũng có triển vọng

để cấy ghép tế bào trong kỹ thuật mô Kỹ thuật mô nhằm mục đích cung cấp các mô và

cơ quan thay thế nhân tạo cho những bệnh nhân bị mất hoặc hỏng cơ quan hoặc mô.Trong cách tiếp cận này, hydrogel được sử dụng để đưa các tế bào đến vị trí mong muốn,