BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược chọn lọc giống vi sinh vật

Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muôn STT Loại đột biến Dấu hiệu phát hiện đột biến 1 Amylase ngoại bào Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thủy phân tinh bột trong mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC - BỘ MÔN VI SINH - KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP

CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Tiểu nhóm 02 - Nhóm 15 - Chiều thứ 5

1 Tiêu Đức Lợi

2 Lưu Gia Linh

3 Nguyễn Thanh Gia Hân

4 Nguyễn Thị Ngọc Hiệp

TP HỒ CHÍ MINH - 2021

Bài 1 Chọn lọc giông vi sinh vật

1.1 Tóm tắt lý thuyết

1.1.1 Phân lập giông vi sinh vật thuần chủng

- Bước đầu tiên trong quá trình chọn lọc giống si sinh vật thuần chủng là phân lập chủng từ các nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng hoặc theo kiểu định hướng

- Sau đó sử dụng môi trường phân lập và môi trường nuôi cấy để phân lập chủng có đặc tính mong muốn

1.1.2 Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muôn

STT Loại đột biến Dấu hiệu phát hiện đột biến

1 Amylase ngoại bào

Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thủy phân tinh bột trong môi trường nên tinh bột không thể tạo màu tím với thuốc thử lugol Xung quanh khóm có vòng sáng

2 Protease ngoại bào

Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thủy phân gelatin trong môi trường nên gelatin không bị tủa khi tráng lên môi trường TCA Xung quanh khóm có vòng sáng

Khả năng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác bằng cách tạo vùng ức chế xung quanh lỗ cấy

1.1.3 Phương pháp bảo quản giông

a Phương pháp giữ giống trên thạch bằng cách cấy truyền

- Cấy truyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới (thời gian cấy truyền từ 1 tuần đến 1 tháng)

- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm

- Nhược điểm: tốn nhiều công sức, có thể dẫn đến thoái hóa chủng

b Giữ giống dưới lớp dầu khoáng

- Giữ giống ở 4 - 5OC và cho lên bề mặt một lớp dầu trơ vaselin, paraíin, giữ môi trường không bị khô

- Ưu điểm: giữ chủng được lâu đến nhiều năm

c Giữ giống trong cát

- Chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử Cát được thanh trùng đổ vào bào tử đã được nuôi cấy chin cho bào tử bám vào cát

- Thời gian bảo quản lâu

d Đông lạnh và đông khô

2

- Đông lạnh: làm lạnh ống chứa môi trường chwuas vi sinh vật ở -80oc với chất bảo quản chống đông thích hợp (glycerine, sữa, ) Thời gian giữ lâu khoảng 6 tháng - 10 năm

- Đông khô: thêm chất bảo quản (sữa gầy, đường) vào môi trường chứa vi sinh vật rồi đem đông lạnh và thăng hóa nước ở nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông đặc của mẫu) Thời gian bảo quản lâu, khả năng phục hồi cao mà ít ảnh hưởng đến hoạt tính

1.2 Kết quả và bàn luận

1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease

a Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzyme

Phân lập trên môi trường tinh bột

Cấp pha loãng: 5 Phân lập trên môi trường tinhbột tráng dung dịch lugol

Cấp pha loãng: 5

3

b Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Chủn

g 1 Mặt lồi, mép răng cưa, màuMô tả khuẩn lạc Amylase Protease

trắng đục

Đường kính 3 mm

Mọc trên môi trường tinh bột

Đường kính vòng sáng: 4 mm

2 Mặt lồi, mép răng cưa, màu

trắng đục

Đường kính 5 mm

Mọc trên môi trường gelatin

Đường kính vòng sáng: 6 mm

3 Mặt phẳng, mép tròn, màu

trắng đục

Đường kính 4 mm

Mọc trên môi trường gelatin

Đường kính vòng sáng: 4 mm

1.2.2 Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

Phân lập trên môi trường gelatin

Cấp pha loãng: 4

Phân lập trên môi trường gelatin

tráng TCA 50%

Cấp pha loãng: 4

4

Bảng 2 Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh

1.2.3 Bàn luận

a. Phát hiện vi sinh vật sinh amylase và protease ngoại bào

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở 37C trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào

+ Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột của môi trường nên tinh bột không bắt màu tím với dung dịch lugol ^ Xung quanh khóm vi khuẩn tiết amylase sẽ có vòng sáng

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37C trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào

+ Protease ngoại bào thủy phân gelatin của môi trường nên gelatin không

bị đục màu với dung dịch TCA 50% ^ Xung quanh khóm vi khuẩn tiết protease sẽ có vòng sáng

b. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

- Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó với vi sinh vật khác

+ E coli trong 5 lỗ chỉ có lỗ B4 và lỗ chứng (không có chủng chỉ có môi trường) không xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ, còn lại 3 lỗ B1-B3 đều có vòng ức chế xung quanh lỗ

+ S aureus trong 5 lỗ thì chỉ có lỗ chứng không có vòng ức chế xung quanh lỗ, còn lại 4 lỗ B1-B4 đều có vòng ức chế xung quanh lỗ

5

^ Kết luận: Trong 4 chủng Bacillus

+ Cả 4 chủng Bacillus đều sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của E coli

+ Chủng Bacillus 1, 2, 3 sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của S aureus

6

Bài 2 Tinh chế enzyme amylase bằng alginat

2.1 Tóm tắt lý thuyết

- Enzym amylase là enzyme xúc tác cho sự thủy phân tinh bột thành đường Enzym amylase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong y học, enzyme amylase được ứng dụng để trợ tiêu hóa, làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc

- Enzym amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật,

vi sinh vật và thực vật Enzym amylase dùng trong y dược cần độ tinh khiết cao nên cần được tinh chế từ enzyme thô

- Nguyên tắc tinh chế enzyme amylase: dùng alginate để bắt giữ enzyme từ hỗn hợp thô Sau đó, thêm CaCl2, gel Ca-alginate sẽ giúp tách enzyme ra khỏi dung dịch Cuối cùng, enzyme amylase sẽ được thôi ra nhờ dung dịch glucose

- Xác định hoạt độ của enzyme amylase bằng phương pháp Heinkel thông qua lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch lode

2.2 Kết quả và bàn luận

2.2.1 Hàm lượng protein

Bảng 2.1 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

Mẫu OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg)

Enzym tinh chế 0,8148 Vtinh chế = 37 30,15

2.2.2 Hoạt tính enzym

a Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560

Bảng 2.2 Thông số đường chuẩn tinh bột

3 0,4993 0,6244 0,8071

Vẽ đường chuẩn

Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

b Hoạt tính enzyme

Bảng 3 Hoạt tính enzym thô và tinh chế

560 chứng

OD560 thử

Độ pha loãng

Hoạt tính tổng enzym (U)

Hoạt tính riêng (U/protein)

Enzym tinh

Tính: Hiệu suất tinh chế và Mức tinh chế

- Hiệu suất tinh chế: HS = HTCenzyme tinh / HTCenzyme thô = 364,66/783,99 = 0,4651

Vậy HS = 46,51%

- Mức tinh chế: HTRenzy m e tinh / HTRenzy m e thô = 12,09/11,01 = 1,1

c Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế

- Quá trình tinh chế enzyme amylase đạt được hiệu suất thấp 46,51%

- Mức tinh chế thấp, enzyme amylase sau tinh chế có hoạt tính không tang không nhiều so với enzyme thô

2.2.3 Bàn luận

- Về tổng lượng protein:

Ban đầu, hàm lượng protein trong enzyme thô là 71,22 (mg)

Sau tinh chế, hàm lượng protein trong enzyme tinh chế là 30,15 (mg)

Như vậy, sau quá trình tinh chế, ta đã loại đi một lượng protein, trong đó là các protein không phải là enzyme amylase Nhờ đó mà enzyme sau tinh chế tinh khiết hơn so với enzyme thô ban đầu

- Về hoạt tính chung của enzyme:

Ban đầu, hoạt tính tổng của enzyme thô là: 783,99 (U)

Sau tinh chế, hoạt tính tổng của enzyme tinh chế là: 364,66 (U)

Do sau quá trình tinh chế, ta đã loại đi một lượng enzyme nên hoạt tính tổng của enzyme tinh chế sẽ giảm đi so với hoạt tính tổng của enzyme thô

- Về hoạt tính riêng của enzyme:

Hoạt tính riêng của enzyme thô: 11,01 (U/protein)

Hoạt tính riêng của enzyme tinh chế: 12,09 (U/protein)

Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh chế cao hơn so với enzyme thô ban đầu nhưng mức tinh chế này khá thấp

Bài 3: Cố định CGTase lên alginat

3.1 Tóm tắt lý thuyết

- Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin

- Cố định giúp tận dụng và tăng cường tính ổn định, hoạt tính của CGTase đắt tiền

- Dựa vào bản chất liên kết giữa chất mang và enzyme, cố định enzyme bao gồm các phương pháp:

+ Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước,

+ Liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo nên phức hợp enzyme - chất mang có liên kết cộng hóa trị

+ Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường

+ Tạo vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200 Ả (như cellulose, polysaccharide)

- Cố định CGTase lên chất mang là alginat Xác định hàm lượng protein cố định bằng thuốc thử Bradford, đo OD 595nm

- Hoạt tính CGTase cố định được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin do CGTase tạo ra từ maltodextrin trong điều kiện xác định dựa vào khả năng hấp phụ và làm mất màu phenolphtalein của cyclodextrin

3.2 Kết quả và bàn luận

3.2.1 Hàm lượng protein

a Đường chuẩn BSA

Bảng 1 Thông số đường chuẩn BSA

Nồng độ BSA

(mg/ml) theo phương pháp Bradford.

b Hàm lượng protein

Bảng 3 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

Thể tích (ml) Hệ số phaloãng protein (mg)Hàm lượng

0,7689

=> OD 595 = 0,7545

Vban đầu = 1

Enzym không CĐ

theo bắt giữ _1,08780,9775

=> OD 595 = 1,0327

Enzym CĐ theo bắt

giữ

2,9533

Enzym không CĐ

theo hấp phụ 0,86720,8635

=> OD 595 = 0,8654

Enzym CĐ theo

hấp

phụ

0,5385

2.2.4 Hoạt tính enzym

a Đường chuẩn CD

_ Bảng 3 Thông số đường chuẩn CD

AOD550 = OCC - OD T 0 0,0952 0,1559 0,2248 0,2706 0,2983

Hình 3.1 Đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và nồng độ protein

Q

Ọ

Vẽ dường chuấn CD.

Hình 3.2 Đường biêu dien sự phụ thuọc đọ nap thu vao nong đọ CD

b Hoạt tính enzym

Bảng 4 Hoạt tính enzym

Mẫu ODchứng550 OD550 thử AOD550nm Hệ sốpha

loãng

Hoạt tính chung (U/ml)

Hoạt tính riêng (U/mg protein)

Enzym

ban đầu

0,7244 0,7117

=>ƠĐ

550cnứ ng

= 0,7181

0,3496 0,3665

=>^^550thử

= 0,3581

Enzym

CĐ theo

bắt giữ

0,7438 0,7414

=>ơu

550cnứ ng

= 0,7426

0,3937 0,4484

=>^^550thử

= 0,4211

Enzym

CĐ theo

hấp phụ

0,7663 0,7663

=>OD 550cnứ

ng

= 0,7663

0,6432 0,6595

=>^^550thử

= 0,6514

Tính: Hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ:

H% = ! - X 100% = 4:::-: X 100% = 72,40%

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ:

tnPr cỗ định 0/5385

H% = X 100% = 4-2::: X 100% = 13,19%

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp bắt giữ:

HTR enzym CĐ 3,29

TLHT = H-í X 100% = rh X 100% = 67,84%

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym theo phương pháp hấp phụ:

TLHT = H-í X 100% = X 100% = 112,99%

c Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym

- Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao hơn phương pháp hấp phụ (72,40% so với 13,19% ,gấp 5,49 lần)

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng thấp hơn phương pháp hấp phụ (67,84% so với 112,99% ,gấp 1,67 lần)

2.2.5 Bàn luận

- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp bắt giữ đạt khá cao (72,40%), do đây là phương pháp cố định enzym không thuận nghịch, vì vậy enzym không thể thoát khỏi chất mang là gel alginat sau khi đã cố định

- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp hấp phụ đạt khá thấp (13,19%) Do pử phương pháp này, enzyme và chất mang chỉ dựa trên các tương tác bề mặt của gel và enzym như liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên enzym có thể quay trở lại môi trường, sự cố định là thuận nghịch, do đó hiệu suất cố định chỉ đạt 13,19%

- Đối với phương pháp cố định bắt giữ, tuy không thay đổi cấu trúc enzym nhưng sự giảm sút hoạt tính được giải thích do sự cản trở về mặt không gian nên các enzym được cố định bằng phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với cơ chất, chỉ những enzym nằm ở bề mặt hạt gel mới dễ dàng gặp cơ chất Đối với phương pháp hấp phụ, enzym nằm ở bề mặt hạt gel, nên tỷ lệ hoạt tính riêng của enzym có thể đạt cao

- Đối với phương pháp cố định theo phương pháp hấp phụ, hoạt tính riêng của enzym sau cố định cao hơn so với enzym ban đầu Nguyên nhân là do lượng enzym cố định được quá thấp mà lượng cơ chất trong môi trường cao nên enzym tiếp xúc nhiều hơn với cơ chất, khả năng thể hiện hoạt tính cao hơn so với enzym ban đầu

Bài 4: Tinh chế Lysozym bằng sắc ký trao đổi ion

4.1 Tóm tắt lý thuyết

- Các phương pháp tinh chế protein đều dựa trên những tinh chất hóa lý của protein như điện tích, kích thước phân tử, hòa tan Đối với phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion thì dựa trên sự tích điện khác nhau trước sự thay đổi của

pH Mỗi protein có một giá trị pH mà tại đó tổng điện tích âm và dương của nó bằng nhau, hay nói cách khác là điện tích bằng 0, pH này được gọi là pl (điểm đẳng điện) Khi pH dung dịch lớn hơn pl protein sẽ tích điện và ngược lại

- Nhựa sắc ký trao đổi ion bao gồm một chất nền không tan được gắn các nhóm mang điện tích bằng liên kết cộng hóa trị, các nhóm mang điện tích này sẽ liên kết với các đối ion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện Có 2 loại nhựa trao đổi ion là: cation, anion

- Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên protein với các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion và pH trong dung dịch mà protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra khỏi nhựa

- Nguyên tắc tinh chế trong bài thực tập: Dựa vào sự khác biệt về pl của lysozym

(pI=10) so với các protein khác trong lòng trắng trứng(pI < 6), do đó tại pH 8 trên nhựa trao đổi cation lysozym có pl > pH sẽ tích điện dương và bị giữ lại trong cột còn các protein khác có pl Lysozym được thôi ra khỏi cột bằng cách nâng ph lên 10 hoặc tăng nồng độ ion trong dung dịch đệm lên để cạnh tranh đẩy lysozym ra ngoài

4.2 Kết quả và bàn luận

4.2.1 Kết quả xác định hàm lượng protein

*Thông số đường chuẩn BSA:

*Đồ thị đường chuẩn BSA:

Ta có phương trình đường chuẩn BSA:

y = -0.7188x + 1.548x + 0.0109

R2 = 0.9966 _

Thông số mẫu:

ODđệm chạy = 0,4597

ODđệm thôi = 0,4254

Bảng 1 Hàm lượng protein trong các phân đoạn

Mẫu gộp D**

OD 59

5

0,785

4

0,860 1

0,805 2

0,748 5

0,619 5

0,527 1

0,495 0

0,480 8

0,473 4

0,453 2

AO

D

0,36 0,434

7

0,379 8

0,323 1

0,194 1

0,101 7

0,069 6

0,055 4

0,048 0,027

8

Thể

Lượ

ng

0,128

0

0,161 0

0,136 5

0,112 6

0,062 9

0,030 2

0,019 3

0,014 6

0,012 1

0,005 5

0,682 7

* C*: 0,5ml dịch C1-5 và 0,1ml mỗi dịch từ C6 đến C15

**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến D10

***n: hệ số pha loãng

Hiệu suất: HS = x 100% = 33 S4 x 100% = 2,02%

Nhận xét về hiệu suất tinh chế

- Dịch A chứa toàn bộ lượng protein (gồm cả lysozym và protein tạp) nên có lượng protein lớn nhất

- Dịch B, B1, C* là lượng protein không phải lysozym

- Dịch D là lượng lysozym tinh chế được

Ta thấy:

x 100% = x 100% = 81,51%

=>Lượng protein tổng (lysozym và protein tạp) lấy ra chưa hết (81,51% so với mẫu A ban đầu)

Hiệu suất tinh chế lysozym rất thấp (2,02%)

1.1.1 Bàn luận

Thực tế lượng lysozym trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất thấp (dưới 5%)

Nguyên nhân dẫn đến hiệu suất tinh chế chưa đạt:

• Rửa cột nhiều lần với đệm chạy, mỗi lần rửa ion H+ trong đệm chạy cạnh tranh với lysozym để gắn trên nhựa trao đổi cation, làm một phần lysozym bị đẩy ra ngoài

• Thao tác tinh chế chưa cẩn thận: không lấy hoàn toàn dịch từ cột (cụ thể khi rửa cột với đệm chạy, không lấy được hết đệm chạy ra ngoài, khi nạp mẫu và lấy dịch ra bị lẫn với đệm), thao tác cho mẫu hay đệm vào cột không nhẹ nhàng làm tung nhựa trao đổi sepharose lên

• Thao tác bơm hút dịch vào eppendoff chưa chính xác làm ảnh hưởng đến kết quả đo OD

• Khi pha loãng hay hút mẫu để đo, lắc dịch không đều dẫn đến sai số trong quá trình đo

• Chưa hoạt hóa tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký

• Chất lượng cột sắc ký không tốt

• Giai đoạn để yên 10 phút nhằm đảm bảo gắn kết giữa lysozym và nhựa sắc ký

có thể chưa đảm bảo đủ thời gian

• Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh của cột không đủ để bắt giữ hết lysozym

1.3 Sơ đồ quá trình tinh chế:

Dịch A

(lysozym và protein tạp) Cột sắc ký

-Rửa cột lần lượt với:

3 thể tích nước cất vô trùng

5 thể tích đệm chạy

Để yên 10 phút

Dịch B

Dịch C

Dịch D (Lysozym)

Cân bằng, bảo quản cột