(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược chọn lọc giống vi sinh vật

Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzyme Phân lập trên môi trường tinh bột Cấp pha loãng: 5 Phân lập trên môi trường tinhbột tráng dung dịch lugol Cấp pha loãng: 5...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC - BỘ MÔN VI SINH – KÍ SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Tiểu nhóm 02 – Nhóm 15 – Chiều thứ 5

Bài 1 Chọn lọc giống vi sinh vật

1.1 Tóm tắt lý thuyết

1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng

- Bước đầu tiên trong quá trình chọn lọc giống si sinh vật thuần chủng là phânlập chủng từ các nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng hoặc theo kiểu định hướng

- Sau đó sử dụng môi trường phân lập và môi trường nuôi cấy để phân lập chủng có đặc tính mong muốn

1.1.2 Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn

Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại

Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại

2 Protease ngoại bào bào thủy phân gelatin trong môi trườngnên gelatin không bị tủa khi tráng lên môi

trường TCA Xung quanh khóm có vòngsáng

3 Kháng sinh Khả năng ức chế sự tăng trưởng của các visinh vật khác bằng cách tạo vùng ức chế

xung quanh lỗ cấy

1.1.3 Phương pháp bảo quản giống

a Phương pháp giữ giống trên thạch bằng cách cấy truyền

- Cấy truyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới (thời gian cấy truyền từ 1tuần đến 1 tháng)

- Ưu điểm: đơn giản, dễ làm

- Nhược điểm: tốn nhiều công sức, có thể dẫn đến thoái hóa chủng

b Giữ giống dưới lớp dầu khoáng

- Giữ giống ở 4 – 5℃ và cho lên bề mặt một lớp dầu trơ vaselin, parafin,… giữmôi trường không bị khô

- Ưu điểm: giữ chủng được lâu đến nhiều năm

c Giữ giống trong cát

- Chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử Cát được thanh trùng đổ vào bào tử đã được nuôi cấy chin cho bào tử bám vào cát

- Thời gian bảo quản lâu

d Đông lạnh và đông khô

- Đông lạnh: làm lạnh ống chứa môi trường chwuas vi sinh vật ở -80℃ vớichất bảo quản chống đông thích hợp (glycerine, sữa,…) Thời gian giữ lâu khoảng 6tháng – 10 năm.

- Đông khô: thêm chất bảo quản (sữa gầy, đường) vào môi trường chứa vi sinhvật rồi đem đông lạnh và thăng hóa nước ở nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông đặc củamẫu) Thời gian bảo quản lâu, khả năng phục hồi cao mà ít ảnh hưởng đến hoạt tính

1.2 Kết quả và bàn luận

1.2.1 Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease

a Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzyme

Phân lập trên môi trường tinh bột

Cấp pha loãng: 5 Phân lập trên môi trường tinhbột tráng dung dịch lugol

Cấp pha loãng: 5

Phân lập trên môi trường gelatin

Cấp pha loãng: 4

Phân lập trên môi trường gelatin

tráng TCA 50%

Cấp pha loãng: 4

b Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào

1 Mặt lồi, mép răng cưa, màu Đường kính vòng

Đường kính 3 mm

Mọc trên môi trường tinh bột

Mọc trên môi trường gelatin

1.2.2 Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

a Phát hiện vi sinh vật sinh amylase và protease ngoại bào

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh

bột và ủ ở 37℃ trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào

Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột của môi trường nên tinh bột không bắt màu tím với dung dịch lugol → Xung quanh khóm vi khuẩntiết amylase sẽ có vòng sáng

- Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch

gelatin và ủ ở 37℃ trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào

Protease ngoại bào thủy phân gelatin của môi trường nên gelatin không

bị đục màu với dung dịch TCA 50% → Xung quanh khóm vi khuẩn tiết protease sẽ có vòng sáng

b Phát hiện khả năng sinh kháng sinh

- Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng

của nó với vi sinh vật khác

E coli trong 5 lỗ chỉ có lỗ B4 và lỗ chứng (không có chủng chỉ có môitrường) không xuất hiện vòng ức chế xung quanh lỗ, còn lại 3 lỗ B1-B3 đều có vòng ức chế xung quanh lỗ

S aureus trong 5 lỗ thì chỉ có lỗ chứng không có vòng ức chế xung quanh lỗ, còn lại 4 lỗ B1-B4 đều có vòng ức chế xung quanh lỗ

→ Kết luận: Trong 4 chủng Bacillus

Cả 4 chủng Bacillus đều sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của E.coli

Chủng Bacillus 1, 2, 3 sinh kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của S aureus

Bài 2 Tinh chế enzyme amylase bằng alginat

2.1 Tóm tắt lý thuyết

- Enzym amylase là enzyme xúc tác cho sự thủy phân tinh bột thành đường.Enzym amylase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp, thực phẩm, ydược… Trong y học, enzyme amylase được ứng dụng để trợ tiêu hóa, làm dịch tiêmtruyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sảnxuất một số thuốc

- Enzym amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật,

vi sinh vật và thực vật Enzym amylase dùng trong y dược cần độ tinh khiết cao nên cần được tinh chế từ enzyme thô

- Nguyên tắc tinh chế enzyme amylase: dùng alginate để bắt giữ enzyme từ hỗnhợp thô Sau đó, thêm CaCl2, gel Ca-alginate sẽ giúp tách enzyme ra khỏi dung dịch.Cuối cùng, enzyme amylase sẽ được thôi ra nhờ dung dịch glucose

- Xác định hoạt độ của enzyme amylase bằng phương pháp Heinkel thông qualượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗnhợp phản ứng với dung dịch Iode

2.2 Kết quả và bàn luận

2.2.1 Hàm lượng protein

Bảng 2.1 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

2.2.2 Hoạt tính enzym

a Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD 560

Bảng 2.2 Thông số đường chuẩn tinh bột

b Hoạt tính enzyme

Bảng 3 Hoạt tính enzym thô và tinh chế

Mẫu OD560 OD560 thử Độ pha loãng Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng

Tính: Hiệu suất tinh chế và Mức tinh chế

- Hiệu suất tinh chế: HS = HTCenzyme tinh / HTCenzyme thô = 364,66/783,99 = 0,4651 Vậy HS

= 46,51%

- Mức tinh chế: HTRenzyme tinh / HTRenzyme thô = 12,09/11,01 = 1,1

c Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế

- Quá trình tinh chế enzyme amylase đạt được hiệu suất thấp 46,51%

- Mức tinh chế thấp, enzyme amylase sau tinh chế có hoạt tính không tang không nhiều

so với enzyme thô

2.2.3 Bàn luận

- Về tổng lượng protein:

Ban đầu, hàm lượng protein trong enzyme thô là 71,22 (mg)

Sau tinh chế, hàm lượng protein trong enzyme tinh chế là 30,15 (mg)

Như vậy, sau quá trình tinh chế, ta đã loại đi một lượng protein, trong đó là các proteinkhông phải là enzyme amylase Nhờ đó mà enzyme sau tinh chế tinh khiết hơn so vớienzyme thô ban đầu

- Về hoạt tính chung của enzyme:

Ban đầu, hoạt tính tổng của enzyme thô là: 783,99 (U)

Sau tinh chế, hoạt tính tổng của enzyme tinh chế là: 364,66 (U)

Do sau quá trình tinh chế, ta đã loại đi một lượng enzyme nên hoạt tính tổng của enzyme tinh chế sẽ giảm đi so với hoạt tính tổng của enzyme thô.

- Về hoạt tính riêng của enzyme:

Hoạt tính riêng của enzyme thô: 11,01 (U/protein)

Hoạt tính riêng của enzyme tinh chế: 12,09 (U/protein)

Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh chế cao hơn so với enzyme thô ban đầu nhưng mức tinh chế này khá thấp

Bài 3: Cố định CGTase lên alginat

+ Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước,

+ Liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo nên phức hợp enzyme - chất mang có liên kết cộng hóa trị

+ Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường.+ Tạo vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200 Å (như cellulose, polysaccharide)

- Cố định CGTase lên chất mang là alginat Xác định hàm lượng protein cố định bằng thuốc thử Bradford, đo OD 595nm

- Hoạt tính CGTase cố định được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin doCGTase tạo ra từ maltodextrin trong điều kiện xác định dựa vào khả năng hấp phụ và làmmất màu phenolphtalein của cyclodextrin

3.2 Kết quả và bàn luận

3.2.1 Hàm lượng protein

a Đường chuẩn BSA

Bảng 1 Thông số đường chuẩn BSA

Hình 3.1 Đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và nồng độ

protein (mg/ml) theo phương pháp Bradford

b Hàm lượng protein

Bảng 3 Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế

11

loãng chung (U/mg protein)

(U/ml)0,7244 0,3496

= 0,7663 = 0,6514Tính: Hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ:

- Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ:

12

c Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym.

- Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao hơn phương pháp hấp phụ (72,40% so với 13,19% ,gấp 5,49 lần)

- Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng thấp hơn phương pháp hấp phụ (67,84% so với 112,99% ,gấp 1,67 lần)

2.2.5 Bàn luận

- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp bắt giữ đạt khá cao (72,40%), do đây là phương pháp cố định enzym không thuận nghịch, vì vậy enzym không thể thoát khỏi chấtmang là gel alginat sau khi đã cố định

- Hiệu suất cố định protein ở phương pháp hấp phụ đạt khá thấp (13,19%) Do pửphương pháp này, enzyme và chất mang chỉ dựa trên các tương tác bề mặt của gel vàenzym như liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên enzym

có thể quay trở lại môi trường, sự cố định là thuận nghịch, do đó hiệu suất cố định chỉ đạt13,19%

- Đối với phương pháp cố định bắt giữ, tuy không thay đổi cấu trúc enzym nhưng sựgiảm sút hoạt tính được giải thích do sự cản trở về mặt không gian nên các enzym được

cố định bằng phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với cơ chất, chỉ những enzym nằm ở bềmặt hạt gel mới dễ dàng gặp cơ chất Đối với phương pháp hấp phụ, enzym nằm ở bề mặthạt gel, nên tỷ lệ hoạt tính riêng của enzym có thể đạt cao

- Đối với phương pháp cố định theo phương pháp hấp phụ, hoạt tính riêng của enzym sau cố định cao hơn so với enzym ban đầu Nguyên nhân là do lượng enzym cố định được quá thấp mà lượng cơ chất trong môi trường cao nên enzym tiếp xúc nhiều hơn với

cơ chất, khả năng thể hiện hoạt tính cao hơn so với enzym ban đầu

Bài 4: Tinh chế Lysozym bằng sắc ký trao đổi ion

4.1 Tóm tắt lý thuyết

Các phương pháp tinh chế protein đều dựa trên những tinh chất hóa lý của proteinnhư điện tích, kích thước phân tử, hòa tan… Đối với phương pháp tinh chế proteinbằng sắc ký trao đổi ion thì dựa trên sự tích điện khác nhau trước sự thay đổi của pH.Mỗi protein có một giá trị pH mà tại đó tổng điện tích âm và dương của nó bằng nhau,hay nói cách khác là điện tích bằng 0, pH này được gọi là pI (điểm đẳng điện) Khi pHdung dịch lớn hơn pI protein sẽ tích điện và ngược lại

Nhựa sắc ký trao đổi ion bao gồm một chất nền không tan được gắn các nhóm mangđiện tích bằng liên kết cộng hóa trị, các nhóm mang điện tích này sẽ liên kết với cácđối ion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện Có 2 loạinhựa trao đổi ion là: cation, anion

Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên proteinvới các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion và pH trong dungdịch mà protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra khỏi nhựa

Nguyên tắc tinh chế trong bài thực tập: Dựa vào sự khác biệt về pI của lysozym

(pI=10) so với các protein khác trong lòng trắng trứng(pI ≤ 6), do đó tại pH 8 trênnhựa trao đổi cation lysozym có pI > pH sẽ tích điện dương và bị giữ lại trong cột còncác protein khác có pI Lysozym được thôi ra khỏi cột bằng cách nâng ph lên 10 hoặctăng nồng độ ion trong dung dịch đệm lên để cạnh tranh đẩy lysozym ra ngoài

4.2 Kết quả và bàn luận

4.2.1 Kết quả xác định hàm lượng protein

*Thông số đường chuẩn BSA:

Ta có phương trình đường chuẩn BSA:

Nhận xét về hiệu suất tinh chế

Dịch A chứa toàn bộ lượng protein (gồm cả lysozym và protein tạp) nên có lượng protein lớn nhất

Dịch B, B1, C* là lượng protein không phải

lysozym Dịch D là lượng lysozym tinh chế được

Ta thấy:

x 100% = x 100% = 81,51%

Hiệu suất tinh chế lysozym rất thấp (2,02%).

15

1.1.1 Bàn luận

Thực tế lượng lysozym trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất thấp (dưới 5%)

Nguyên nhân dẫn đến hiệu suất tinh chế chưa đạt:

Rửa cột nhiều lần với đệm chạy, mỗi lần rửa ion H+ trong đệm chạy cạnh tranh với lysozym để gắn trên nhựa trao đổi cation, làm một phần lysozym bị đẩy ra ngoài

Thao tác tinh chế chưa cẩn thận: không lấy hoàn toàn dịch từ cột (cụ thể khi rửacột với đệm chạy, không lấy được hết đệm chạy ra ngoài, khi nạp mẫu và lấy dịch ra bị lẫn với đệm), thao tác cho mẫu hay đệm vào cột không nhẹ nhàng làm tung nhựa trao đổi sepharose lên

Thao tác bơm hút dịch vào eppendoff chưa chính xác làm ảnh hưởng đến kết quả đo OD

Khi pha loãng hay hút mẫu để đo, lắc dịch không đều dẫn đến sai số trong quá trình đo

Chưa hoạt hóa tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc

ký Chất lượng cột sắc ký không tốt

Giai đoạn để yên 10 phút nhằm đảm bảo gắn kết giữa lysozym và nhựa sắc ký

có thể chưa đảm bảo đủ thời gian

Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh của cột không đủ để bắt giữ hết lysozym

1.3 Sơ đồ quá trình tinh chế:

5 thể tích đệm chạy

Để yên 10 phút

Dịch B

Đệm chạy(protein tạp)

Dịch C

Đệm thôi(protein tạp)

Dịch D(Lysozym)

16