Định lượng Bacillus cereus

Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ biến. Người ăn phải thực phẩm này thường mắc hai triệu chứng điển hình là tiêu chảy và nôn mửa.Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện, chiếm khoảng 2% số ca ngộ độc thực phẩm.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

TPHCM KHOA:CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Nhóm 7

GVHD: cô Phan Thị Kim Liên

Đề tài: Định lượng Bacillus cereus

1.Tình hình ngộ độc

2.Đặc điểm của B.cereus

3.Định lượng B.cereus bằng phương pháp

1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

o Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ

biến Người ăn phải thực phẩm này thường mắc hai triệu chứng điển hình là tiêu chảy và nôn mửa

o Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52

trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện, chiếm khoảng 2% số

ca ngộ độc thực phẩm

o Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận hơn 5.600.000 ca tiêu chảy do nhiễm trùng qua thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong

o Riêng 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có

12 ca tử vong

o Thực tế, theo các chuyên gia,phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố

1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

• Mới đây,15/10/2015 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra ở trường mầm non Thốt Nốt ( quận Thốt Nốt, TP Cần Thơ ) làm cho 30 trẻ mầm non bị ngộ độc Nguyên nhân được xác định

là do các trẻ ăn phải thức ăn có nhiễm

Bacillus cereus

• Vi khuẩn này nhiễm vào thức ăn do quá trình bảo quản, tiếp xúc và chế biến không kỹ.

1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Mô hình cấu tạo B.cereus

2 ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS

• Trên môi trường chọn lọc,vi khuẩn này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn.

2 ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS

Phân bố nhiều trong tự nhiên.

Nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm

Vi khuẩn này xâm nhập vào sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô.

Có khả năng tiết ra hai loại độc tố:

diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa.

3.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

3.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

PHẠM VI ÁP DỤNG

• Dùng để định lượng B.cereus giả định có

khả năng mọc trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C

• Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người và thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm

• Cấy một lượng mẫu thử quy định lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri.

• Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều

kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.

• Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30 o C trong khoảng 18-48 giờ

• Tính số lượng B.cereus trong 1ml (1g) mẫu từ

số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn.

NGUYÊN TẮC

MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT:

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW ( Saline Peptone Water )  

MYP agar base ( Mannitol- Egg

Yolk-Polymixin ).

   Nuôi cấy

Môi trường MYP

0,1ml

CÁCH TIẾN HÀNH

Pha loãng mẫu.

Cấy và ủ mẫu Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

1

2

3

4

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù

ban đầu.

Bước 2: Pha loãng mẫu

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đọc kết quả: Chọn các đĩa có số khuẩn lạc mọc dưới

150 sau 24h nuôi cấy ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Đếm các khuẩn lạc giả định.

Lấy 5 khuẩn lạc giả định.

Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn

lên mặt thạch máu cừu, ủ ở 30 o C trong 24h.

Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn

lên mặt thạch máu cừu, ủ ở 30 o C trong 24h.

Đọc kết quả.

• n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất.

• n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai.

• d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất.

• R: Tỉ lệ khẳng định dương tính.

•  

Lấy 5 khuẩn lạc giả định 5 ống nghiệm thạch máu cừu tan

máu cừu dương tính (+).

Kiểm tra những mẫu thực phẩm có tinh bột khô mà phương pháp đếm khuẩn lạc không thích hợp

 Dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân

bố vsv trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.

 Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần ( 3- 10 lần).

 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.

 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đoán số lượng vsv trong mẫu.

4.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MPN

4.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MPN

Quy trình phân tích

Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, độ

pha loãng 10 -1

Pha loãng đến các độ pha loãng 10 -2 , 10 -3

Sử dung độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 cho loạt MPN

3 ống nghiệm.

Ủ trong canh TSP, ủ ở 30 o C, 48h.

(+): xuất hiện sinh khối.

Cấy ria từ những ống (+) lên MYP, ủ ở 30 o C,

Tra bảng MPN

Canh Trypticase Soy Polymycin

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù

ban đầu.

Bước 2: Pha loãng mẫu

Bước 3 : Chuyển

1ml dung dịch mẫu pha loãng ở mỗi nồng độ 10 -

1 ,10 -2 , 10 -3 vào ống nghiệm có chứa 10ml canh TSP, mỗi nồng độ

có 3 ống lặp lại.

Bước 3 : Chuyển 1ml dung dịch mẫu pha loãng ở mỗi nồng độ 10 -

1 ,10 -2 , 10 -3 vào ống nghiệm có chứa 10ml canh TSP, mỗi nồng độ

có 3 ống lặp lại.

Bước 6 :

+ Chọn những

khuẩn lạc có màu hồng eosine

lecithine (+)

+ Cấy sang môi trường thạch

nghiêng Nutrient agar để tiến hành các test sinh hóa

Bước 6 :

+ Chọn những

khuẩn lạc có màu hồng eosine

lecithine (+)

+ Cấy sang môi trường thạch

nghiêng Nutrient agar để tiến hành các test sinh hóa

Nhuộm gram :Tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía , tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng

Thử nghiệm lên men glucose

N- (l-naphthyl)

ethylenediamine

( dung dịch B)

N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride

0,25g Acid acetic 5N 200ml

Thử nghiệm Nitrate

Voges – Proskauer

carbinol trong quá trình lên men glucose.

+ Naphtol (chất tăng cường màu)

+ KOH 40% (chất oxi hóa)

+ creatine

Voges – Proskauer

(+) dung dịch chuyển sang

Khả năng thủy phân tyrosine

Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth.

lysozyme

ủ 35 0 C trong 24h

Đọc kết quả

Thử nghiệm tính di động

Sự hình thành rễ giả

Huyền phù

Đĩa Nutrient Agar

Kiểm tra sự phát triển của rễ giả

Cấy

Ủ 30 0 C trong 48-72h

Sự hình thành rễ giả

Bacillus cereus (không có cấu trúc

Thử nghiệm làm tan máu

Môi trường Tryticase Soy Agar

Thử nghiệm làm tan máu

Chủng VSV

Khẳng định loàimôi trường thạch máu Trypticase Soy

Thử nghiệm làm tan máu

Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể

-Tính kết quả

Môi trường MOSSEL

Disodium hydrogen phosphate 2.5

Potassium dihydrogen phosphate 0.25