Khảo sát sự ổn định chủng e coli và bacillus cereus trên nền mẫu và điều kiện bảo quản khác nhau

Chu Nguyên Thanh và CN... DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI U Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus.. Hình 5: Vi khu n Escherichia coli... tài th c hi n trên E.coli và Bacillus cereus.

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T

GVHD: Th.S Nguy n V n Hòa

Th.S Tr n Th Ánh Nguy t SVTH: Nguy n Kim Hoàng

MSSV: 1053012253 Khóa: 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

L I C M N

u tiên em xin g i l i c m n chân thành đ n th y Nguy n V n Hòa, th y

Nguy n V n Minh, cô D ng Nh t Linh, cô Ph m Vân An, ThS Tr n Th Ánh

Nguy t, ThS V Di u Thu, ThS Chu Nguyên Thanh và CN Nguy n Th Ng c Thùy

đã t n tình h ng d n, giúp đ em trong su t th i gian th c t p và khóa lu n t t

nghi p

Em xin c m n Ban giám đ c Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng

3 - QUATEST 3 và các nhân viên Phòng Vi sinh - GMO đã luôn t o đi u ki n t t

nh t, truy n đ t các ki n th c khoa h c và kinh nghi m qúy báu cho em đ em có

th t tin cho công vi c trong t ng lai

Cu i cùng, em xin c m n Ban giám hi u Tr ng i h c M Thành ph H Chí

Minh, các th y cô Khoa Công Ngh Sinh H c cùng gia đình và các b n sinh viên

l p Công Ngh Sinh H c khóa 010 đã h t lòng quan tâm h tr , t n tâm d y d và

đ ng viên em đ em hoàn thành t t khóa lu n t t nghi p này

Thành ph H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

Sinh viên Nguy n Kim Hoàng

M C L C

T V N 6

M c tiêu 6

PH N 1: T NG QUAN 7

1.1 T ng quan v Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng 3 - QUATEST 3 7

1.1.1 Gi i thi u chung v Trung tâm 7

1.1.2 Phòng vi sinh & GMO 11

1.2 i c ng v Bacillus cereus và Escherichia coli 11

1.2.1 i c ng v Bacillus cereus 11

1.2.2 i c ng v Escherichia coli 16

PH N 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 21

2.1 Th i gian vƠ đ a đi m th c hi n 21

2.2 V t li u 21

2.2.1 Thi t b và d ng c 21

2.2.2 Hóa ch t vƠ môi tr ng 21

2.2.3 V t li u thí nghi m 21

2.3 Ph ng pháp th c hi n 22

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 35

3.1 K t qu ki m tra đ nhi m khu n c a m u 35

3.2 K t qu t ng sinh ch ng vi sinh v t 35

3.3 Kh o sát s n đ nh c a Bacillus cereus trên n n m u g o 36

3.4 Kh o sát s n đ nh c a Escherichia coli trên n n m u rau s y 40

PH N 4: K T LU N VÀ NGH 43

4.1 K t lu n 43

4.2 ngh 43

TÀI LI U THAM KH O 44

PH L C 46

DANH SÁCH CÁC CH VI T T T

1) AOAC: Association of Official Analytical Chemists

2) B.cereus: Bacillus cereus

3) DSM: Difco Sporulation Medium

4) E.coli: Escherichia coli

5) EMB: Eosin Methylene Blue Lactose

6) GMO: Genetically Modified Organism

7) IEC: The International Electrotechnical Commission

8) ISO : International organization for standardization

15) TCVN: Tiêu chu n Vi t Nam

16) TSB : Trypticase (tryptic) soy broth

17) VSV: Vi sinh v t

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI U

Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus

Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi đi n t

Hình 3: C u trúc bào t ch ng B cereus S69 không ho t đ ng quan sát d i kính

hi n vi đi n t

Hình 4 :Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi 100X

Hình 5: Vi khu n Escherichia coli

Hình 6: K t qu th nghi m IMViC c a Escherichia coli

Hình 7: M u g o sau khi s y khô

Hình 8: Khu n l c Escherichia coli trên mô tr ng TBX

Hình 9: Khu n l c c a Bacillus cereus trên MYP

Hình 10: Khu n l c Bacillus cereus có vòng phân gi i h ng c u trên th ch máu

Bi u đ 3.1: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr ng TSB các nhi t

đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau

Bi u đ 3.2: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr ng DSM các

nhi t đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau

DANH SÁCH CÁC B NG

B ng 3.3.1: M t đ ch ng Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g)

B ng 3.3.2: M t đ bƠo t Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g)

B ng 3.4: M t đ ch ng Escherichia Coli sau khi b o qu n (CFU/g)

T V N

Vi sinh v t lƠ các c th s ng vô cùng nh bé có các đ c tính sinh lí, sinh hóa

khó n đ nh qua th i gian dài Các vi sinh v t có th phát tri n m nh h n ho c b

ch t đi do tác đ ng c a các đi u ki n b o qu n, v n chuy n, y u t ngo i c nh khác

nhau Vì v y, vi c t o ra m t m u chu n (reference material) có ch a m t đ vi sinh

v t n đ nh trong th i gian dài là r t khó kh n chính xác c a các k t qu phân

tích và thao tác c a k thu t viên là h t s c quan tr ng trong các nghiên c u khoa

h c công ngh c ng nh trong ki m tra, đánh giá ch t l ng s n ph m Trên th c

t , có r t nhi u phòng thí nghi m vi sinh r t c n các m u chu n có ch a vi sinh v t

m c tiêu có m t đ n đ nh Các m u chu n này s giúp các phòng thí nghi m có

th t ki m tra tay ngh c a nhân viên, nâng cao hi u qu ki m soát ch t l ng,

ki m soát quy trình thí nghi m, ki m tra giá tr s d ng c a ph ng pháp th

nghi m và ch ng minh n ng l c k thu t c a phòng thí nghi m đ i v i các bên

quan tâm

Hi n nay, trên th tr ng, các r t nhi u nhà cung c p các m u chu n vi sinh (APLAC, CMS, LGC,ầ) nh ng v i giá c khá cao (kho ng 6,5 tri u/m u) V n đ nƠy gơy khó kh n cho các phòng thí nghi m đ th c hi n công tác đ m b o ch t

l ng VƠ đơy c ng lƠ đòi h i c a c quan qu n lỦ nhƠ n c trong vi c công nh n

phòng th nghi m, phòng xét nghi m và phòng thí nghi m theo ISO/IEC 17025 T nhu c u trên, tôi xin ti n hƠnh đ tƠi “Kh o sát s n đ nh c a c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và đi u ki n b o qu n khác nhau.” tài nh m

xây d ng các m u th ch a vi sinh v t m c tiêu cho ch ng trình ki m tra đánh giá

tay ngh c a ki m nghi m viên ho c s d ng làm m u ki m soát ch t l ng ph c

v quá trình ki m soát quy trình phân tích t i phòng thí nghi m tài th c hi n trên E.coli và Bacillus cereus

 M c tiêu

Kh o sát s n đ nh c a c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u vƠ đi u ki n

b o qu n khác nhau

PH N 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan v Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng 3 - QUATEST 3 [17]:

1.1.1 Gi i thi u chung v Trung tâm

QUATEST 3 là t ch c khoa h c công ngh thu c T ng c c Tiêu chu n o

l ng Ch t l ng ậ B Khoa h c và Công ngh , đ c thành l p t tháng 5 n m

1976 trên c s Vi n nh chu n Qu c gia tr c đơy

QUATEST 3 áp d ng h th ng qu n lý ch t l ng theo tiêu chu n ISO 9001;

l nh v c thí nghi m đ c công nh n phù h p v i tiêu chu n ISO/IEC 17025, l nh

v c giám đ nh hàng hóa đ c công nh n phù h p v i ISO/IEC 17020, l nh v c

ch ng nh n s n ph m đ c công nh n phù h p v i ISO/IEC Guide 65 và l nh v c

t v n, đƠo t o đ c ch ng nh n phù h p v i ISO 9001

Qua 30 n m ho t đ ng, QUATEST 3 đư đ c bi t đ n nh m t đ n v hƠng đ u

t i Vi t Nam trong l nh v c cung c p d ch v k thu t v tiêu chu n, đo l ng và

ch t l ng QUATEST 3 có đ i ng chuyên viên, k thu t viên đ c đƠo t o

chuyên sâu và có nhi u kinh nghi m, h th ng phòng thí nghi m v i trang thi t b

hi n đ i theo chu n m c qu c t

V i n l c nơng cao n ng l c k thu t c a các phòng th nghi m đ đ c th a

nh n qu c t và khu v c, Phòng Th nghi m Vi sinh - GMO c a QUATEST 3 đ c các n c ASEAN ch n là phòng th nghi m đ i ch ng (ASEAN Reference

Laboratory ậ ARL) theo ch ng trình EC - ASEAN và Phòng Th nghi m i n

đ c các n c ASEAN th a nh n k t qu th nghi m đ i v i các s n ph m đi n

gia d ng theo th a thu n th a nh n l n nhau trong l nh v c th nghi m đi n vƠ đi n

t ( ASEAN EE MRA) Ngoài ra, QUATEST 3 đang tri n khai ch ng trình m

r ng s th a nh n c a khu v c và qu c t cho các l nh v c th nghi m khác

Các l nh v c ho t đ ng chính c a trung tâm:

 D ch v th nghi m

Các phòng th nghi m c a QUATEST 3 đ u đ c công nh n phù h p v i tiêu

chu n ISO/IEC 17025, phòng th nghi m th c ph m và phòng th nghi m vi

sinh-GMO c ng đ c công nh n b i t ch c công nh n c a Na Uy (Norway

- Dơy đi n b c nh a PVC, s n ph m đi n gia d ng

- Xim ng Pooc l ng các lo i, t m l p fibro-xim ng, d m bêtông c t thép ng

l c tr c PPB

- S n ph m b o h lao đ ng

 Ch ng nh n

Ho t đ ng ch ng nh n s n ph m c a QUATEST 3 đ c công nh n phù h p v i

chu n m c qu c t ISO/IEC Guide 65

QUATEST 3 là t ch c ch ng nh n (bên th ba) th c hi n vi c ch ng nh n s phù h p c a s n ph m v i tiêu chu n qu c gia, tiêu chu n qu c t ho c quy chu n

k thu t trong nhi u l nh v c: đi n - đi n t , c khí, hóa ch t, xây d ng, hàng tiêu

dùng, d u, khí, th c ph m, rau an toàn s n xu t theo quy trình VietGAP

V i đ i ng h n 40 chuyên gia t v n có nhi u n m kinh nghi m đ c đƠo t o

chuyên sâu trong n c vƠ n c ngoƠi trong l nh v c qu n lý ch t l ng, môi tr ng

vƠ an toƠn, QUATEST 3 đư cung c p d ch v t v n h th ng qu n lý cho g n 1000

t ch c, doanh nghi p và tr thành m t trong nh ng đ n v hƠng đ u trong n c v

cung c p d ch v t v n các h th ng quán lý H u h t các chuyên gia t v n c a QUATEST 3 đ u có ch ng ch chuyên gia đánh giá bên ngoƠi c a IATCA (Hi p

h i công nh n vƠ đƠo t o đánh giá viên qu c t ) ho c IRCA (t ch c ch ng nh n chuyên gia đánh giá viên qu c t ) H th ng qu n lý ch t l ng c a QUATEST 3

cho ho t đ ng t v n đ c ch ng nh n phù h p v i tiêu chu n ISO 9001

QUATEST 3 cung c p d ch v t v n cho các t ch c, doanh nghi p mu n xây

d ng và áp d ng các h th ng qu n lý: Ch t l ng - ISO 9001, Môi tr ng - ISO

14001, An toàn th c ph m - ISO 22000, An toàn thông tin - ISO/IEC 27001, Qu n

lý phòng thí nghi m - ISO/IEC 17025, An toàn s c kh e ngh nghi p - OHSAS

- Ơo t o nghi p v tiêu chu n đo l ng ch t l ng

- Ơo t o k thu t thí nghi m

- Ơo t o chuyên gia t v n

 Thông tin vƠ tiêu chu n

QUATEST 3 cung c p thông tin và các tài li u liên quan đ n tiêu chu n, đo

l ng, ch t l ng theo yêu c u cu t ch c, doanh nghi p và cá nhân:

- Các tiêu chu n Vi t Nam (TCVN)

- Các quy chu n k thu t trong n c (QCVN)

- Các tiêu chu n n c ngoƠi: JIS, GOST, BS, IS, AS, DIN, NF, ANSI, KSầ

- Các tiêu chu n qu c t : ISO, IEC, CODEX, OIMLầ

- Các tiêu chu n c a các hi p h i chuyên ngành: ASTM, AOAC, AOCS, APHA, ASME, API, AWS,ầ

- Các t p chí ho c tài li u chuyên ngành khác

 Mư s - mư v ch

QUATEST 3 là Chi nhánh phía Nam c a T ch c GS1 Vi t Nam (mã s - mã

v ch) v i các nhi m v :

Ti p nh n các yêu c u đ ng kỦ s d ng mã s - mã v ch c a t ch c, doanh nghi p

Cung c p d ch v ki m tra ch t l ng mã s - mã v ch

T v n vƠ đƠo t o tri n khai ng d ng mã s - mã v ch, các gi i pháp nh n d ng

đi n t khác theo các tiêu chu n qu c t v qu n lỦ vƠ đi u hành s n xu t - kinh

doanh ậ d ch v , các công c h tr qu n lý chu i cung ng s n ph m và d ch v ,

truy xu t ngu n g c s n ph m

 D ch v trang b

S n xu t và cung c p chu n đo l ng, ph ng ti n đo ki m nh : chu n kh i

l ng, chu n dung tích, thi t b ki m đ nh đ ng h đo n c l nh, thi t b ki m đ nh công t đi n, cân bàn, cân ô tô

Cung c p các ch t chu n, thi t b , ph ng ti n đo ki m, thi t b và d ng c thí

Phân tích vi sinh trong th c ph m, nông s n, m ph m, n c, th c n ch n nuôi,

đ u ng, phân vi sinh, ch ph m sinh h c và các s n ph m tiêu dùng khác

Phơn tích đ nh tính vƠ đ nh l ng sinh v t bi n đ i gen (GMO) có trong các lo i

s n ph m có ngu n g c t th c v t, các lo i h t gi ng, các lo i th c n dƠnh cho gia súcầ

 Ph ng pháp th nghi m

TCVN, APHA, USFDA, BS, ISO, GS, AOAC,ầ

1.2 i c ng v Bacillus cereus và Escherichia coli

1.2.1 i c ng v Bacillus cereus

B.cereus là tr c khu n k khí, gram d ng, r ng kho ng 1 m, dài kho ng

3-4 m, có kh n ng sinh nha bƠo, bƠo t d ng hình ovan có th s ng sót khi x lý

nhi t và hóa ch t [2], chúng có kh n ng thích nghi v i m t lo t các đi u ki n môi

tr ng, nó đ c phân ph i r ng rãi trong t nhiên nh trong b i, đ t, các loài

 Là lo i vi khu n d m c trên các môi tr ng nuôi c y vi khu n thông th ng

 T ng tr ng đ c trong kho ng nhi t đ 5-500C, t i u 35-400C

 pH 4,5-9,3, thích h p pH 7-7,2

 Trên môi tr ng th ch MYP vƠ môi tr ng th ch Mossel (cereus selective

agar) vi khu n B cereus m c t o thành d ng khu n l c có màu h ng ph n chung quanh có vòng sáng

 B (order) Bacillales

 H (family) Bacillaceaem

 Chi (genius) Bacillus

 Loài (species) Cereus

 Bào t Bacillus cereus:

Bào t vi khu n là các t bƠo đ c bi t, đ c hình thƠnh đ vi khu n có th t n t i

trong đi u ki n b t l i Chúng đ c hình thành bên trong các t bào vi khu n và do

đó đ c g i là n i bào t Có nhi u lo i t bào chuyên bi t đ c hình thành t các

vi khu n đ t n t i trong các đi u ki n nghèo dinh d ng và kh c nghi t khác nhau,

nh ng n i bào t c a vi khu n là nh ng t bào có kh n ng t n t i b n v ng và dài

nh t

C u trúc c a bào t r t khác so v i c u trúc c a t bào vi khu n sinh d ng bình

th ng Bào t không ho t đ ng trao đ i ch t và có kh n ng ch ng l i đi u ki n

b t l i nh môi tr ng s ng nghèo dinh d ng, nhi t đ cao, b c x ion hóa, dung

môi hóa ch t, ch t t y r a, các enzym th y phơn, đ m th p, thay đ i pH và kháng

sinh

Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi đi n t Bào t Bacillus

cereus có l p exosporium nhìn nh m t l p màng l ng l o bao xung quanh [13]

C u trúc c a bào t Bacillus cereus g m [13,14]:

 Màng exosporium: nhi u loài vi khu n, áo bào t đ c bao quanh b i m t

c u trúc màng l ng l o g i là exosporium (Hình 2) Màng exosporium r t quan

tr ng đ i v i tính k n c và tính k t dính c a bào t T lâu, đư phát hi n th y

bào t B cereus và B.anthracis có l p màng exosporium ch a các kháng nguyên quan tr ng có th phát hi n và nh n d ng; ngoài ra còn có ch a m t s enzyme,

m t s trong đó có th liên quan đ n vi c n y m m

 Áo bào t : là m t c u trúc protein ph c t p g m ba l p riêng bi t Áo bào t

b o v l p v peptidoglycan c a bào t kh i các enzyme t n công H n n a, áo bào t có liên quan đ n kh n ng ch ng b c x tia UV t môi tr ng và nhi u

lo i hóa ch t bao g m các ch t oxy hóa Tuy nhiên, áo bào t không có kh n ng

ch ng l i h p t Áo bào t có ch a các enzyme nh t đ nh, ch ng h n nh

laccases, m t enzyme có th ho t đ ng ngay c khi lõi bào t không có các ho t

đ ng trao đ i ch t Các l p bên trong c a l p áo bào t ch a m t enzyme phân

h y, giúp làm tan v bào t trong quá trình n y m m

 V bào t : là l p vách t bào khá dày g m l p peptidoglycan, r t quan tr ng

cho vi c duy trì tr ng thái m t n c và tr ng thái ti m sinh c a lõi bào t Nó

nh m t c u trúc t nh giúp duy trì tình tr ng m t n c C u trúc c th c a v

bào t đ c b o t n gi a các loài và có th đóng vai trò quan tr ng trong kh

n ng ch u nhi t c a bào t , m c dù m i t ng quan rõ ràng gi a c u trúc v bào

t và kh n ng ch u nhi t ch a đ c tìm th y Trong quá trình n y m m, các l p

v peptidoglycan nhanh chóng b phân h y b i các enzyme l p áo bào t

 Lõi bào t :ch a t bào ch t v i các thành ph n gi ng t bƠo sinh d ng, nh

protein, ribosome và DNA Tuy nhiên, tr ng thái c a t bào ch t trong lõi bào t khác xa so v i t bào ch t c a t bƠo bình sinh d ng, hàm l ng n c ch 30-

50%, còn t bƠo sinh d ng là 70-88% Tr ng thái m t n c nƠy đóng m t vai

trò quan tr ng trong tu i th , kh n ng ti m sinh và s c đ kháng c a bào t pH

trong lõi bào t là 6,3-6,5, th p h n nhi u so v i đ pH c a t bào ch t c a các t

bào sinh d ng T bào ch t c a bào t thi u h u h t các h p ch t n ng l ng

cao th ng đ c tìm th y trong t bào ch t c a các t bào sinh d ng và ch

ch a s l ng l n m t lo i protein, g i là SASP (small acid soluble proteins)

Nh ng protein này t o m t ph c h p v i các DNA c a bào t , bu c các DNA

t n t i tr ng thái nén đ c bi t, giúp b o v DNA ch ng l i nhi u lo i tác đ ng