ẢNH HƯỞNG CỦA GIỐNG CHÈ VÀ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG BACILLUS SUBTILIS, BACILLUS CEREUS VÀ PROTEUS SP

ẢNH HƯỞNG CỦA GIỐNG CHÈ VÀ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG BACILLUS SUBTILIS, BACILLUS CEREUS VÀ PROTEUS SP

Người hướng dẫn:ThS GIANG TRUNG KHOA

Bộ môn: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN, KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM, TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Hà Nội - 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo này là

trung thực và chưa hề được sử dụng

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện chuyên đề này

đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã đượcghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2010 Sinh viên

Phạm Thị Hồng Diệu

LỜI CẢM ƠN

Chuyên đề tốt nghiệp này được thực hiện tại Khoa Công Nghệ ThựcPhẩm, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội dưới sự hướng dẫn của Ths GiangTrung Khoa –Trưởng Bộ môn Công Nghệ Chế Biến – Khoa Công Nghệ ThựcPhẩm, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

Để hoàn thành chuyên đề, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đãnhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể

Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ môn Công Nghệ Chế Biến – Khoa CôngNghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội cho phép tôi thực hiệnchuyên đề này

Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy hướng dẫn Giang Trung Khoa đã dànhnhiều thời gian, công sức tận tình hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báugiúp tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành chuyên đề

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công Nghệ Thực Phẩmcác anh chị trong Viện bảo tàng giống vi sinh vật trường Đại học Quốc Gia HàNội đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các bạn, các em, anh chị trong nhóm sinh viênthực tập tốt nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành chuyên đề

Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thântrong gia đình luôn dành sự cảm thông chia sẻ và điều kiện giúp đỡ tôi có đủnghị lực để hoàn thành chuyên đề này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2010 Sinh viên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Phần I: MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

1.2.2 Yêu cầu

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2.1.2 Đặc điểm thực vật và giống chè chính

2.1.2.1 Chè Trung Quốc (Camellia sinensis var sinensis)

2.1.2.2 Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica)

2.1.2.3 Đặc điểm một số giống chè trồng ở Việt Nam

2.1.2.3.1 Giống Trung Du

2.1.2.3.2 Giống Shan

2.1.2.3.3 Giống PH1

2.1.2.3.4 Giống 1A

2.1.2.3.5 Giống TRI777

2.1.3 Thành phần hóa học cơ bản trong lá chè nguyên liệu

2.1.3.1 Nước

2.1.3.2 Polyphenol - tanin chè

trang

2.1.3.3 Protein và chất chứa nitơ

2.1.3.4 Ankaloid

2.1.3.5 Hợp chất pectin

2.1.3.6 Nhóm chất thơm

2.1.3.7 Các chất tro

2.1.3.8 Các sắc tố

2.1.3.9 Vitamin

2.1.3.10 Enzyme

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới

2.2.1.1 Tình hình sản xuất

2.2.1.2 Tình hình tiêu thụ

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình sản xuất

2.2.1.2 Tình hình tiêu thụ

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình sản xuất

2.2.2.2 Về tình hình tiêu thụ

2.3 GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOL CHÈ

2.3.1 Bản chất của Polyphenol chè

2.3.2 Đặc tính của Polyphenol

2.3.2.1 Hoạt kháng oxy hóa

2.3.2.2 Hoạt tính chống khuẩn

2.3.3 Tiềm năng ứng dụng của Polyphenol chè

2.4 GIỚI THIỆU VỀ 3 CHỦNG VI KHUẨN

2.4.1 Bacillus subtilis

2.4.2 Bacillus cereus

2.4.3 Proteus

Phần III: VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP

3.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm

3.1.2 Nguyên vật liệu

3.1.3 Hóa chất sử dụng

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị sử dụng

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu

3.3.2 Phương pháp xác định polyphenol tổng số trong chè

3.3.2.1 Chiết xuất polyphenol

3.3.2.2 Pha loãng

3.3.2.3 Xây dựng đường chuẩn acid gallic

3.3.2.4 Xác định hàm lượng polyphenol

3.3.2.5 Tính kết quả

3.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol

3.3.3.1 Nguyên lý

3.3.3.2.Tiến hành

3.3.3.3 Đọc kết quả

3.3.3.4 Bố trí thí nghiệm

3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU

Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ TRONG 3 GIỐNG CHÈ THEO PHƯƠNG PHÁP ISO 14502-1:2005

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA GIỐNG VÀ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

4.2 ĐỀ NGHỊ

Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN

4.3 QUAN HỆ GIỮA HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TRONG

NGUYÊN LIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA

PolyphenolEpicatechinEpicatechingallateEpigallocatechinEpigallocatechin gallateGalocatechin

Thị trường xuất khẩu chè 6 tháng đầu năm 2009

Tương quan giữa giá trị mật độ quang và nồng độ acid gallic

Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè nguyên liệu (%CK)

Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng

kháng của chủng Bacillus subtilis

Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng

kháng của chủng Bacillus cereus

Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng

Đồ thị chuẩn acid gallic

Hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu chè

Tương quan giữa hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu

đến hoạt

Hình ảnh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của các giống chè

nghiên cứu

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nước chiết chè có khả năng chống oxyhoá, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng nấm và vi rút rất hiệu quả [1,11].Điều này là do trong chè có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học nhưankaloid, tanin, catechin, methylxanthine và đặc biệt là các polyphenol, [4,21].

Do đó chè và các sản phẩm từ chè đã được ứng dụng nhiều trong y học, dược

mỹ phẩm và trong công nghiệp thực phẩm

Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của polyphenol chè hay nướcchiết chè thường được tập chung chủ yếu trên đặc tính chống oxy hoá Nhìnchung việc làm rõ đặc tính kháng khuẩn của polyphenol chè còn nhiều bất cập, ítthông tin, đặc biệt đối với các vi khuẩn vừa gây bệnh cho người, vừa gây thốihỏng thực phẩm Tuy vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hoạt tính khángkhuẩn của polyphenol chè hay nước chè pha phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:loại chè (chè đen, chè xanh ), giống chè (nguyên liệu trong chế biến), chủng visinh vật thử nghiệm, nhiệt độ và dung môi trích ly

Trong nghiên cứu này, với mục đích xác định ảnh hưởng của giống chèđến khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm, bướcđầu xác lập cơ sở khoa học cho việc định hướng sử dụng polyphenol chè, chúng

tôi tiến hành đề tài “Ảnh hưởng của giống chè và chất lượng nguyên liệu đến

hoạt tính kháng Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Proteus sp”

1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU

1.2.1.1 Mục đích

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 03 giống chè phổ biến ở nước ta, làm

cơ sở khoa học cho việc ứng dụng polyphenol chè/nước chiết chè trong bảoquản chế biến nông sản thực phẩm

1.2.1.2 Yêu cầu

- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong 03 giống chè thí nghiệm

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn đối với 03 chủng: Bacillus subtilis,

Bacillus cereus, Proteus sp.

Phần II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người TrungQuốc vào năm 2700 trước công nguyên Đầu tiên được sử dụng như một dượcliệu, sau trở thành một thứ đồ uống mang đậm tính dân tộc của Trung Quốc.Dựa vào di tích khảo cổ học và điều kiện sinh thái của cây chè, căn cứ ở cácvùng chè hoang dại và tập quán sử dụng chè, nhiều tài liệu của Trung Quốc,Liên Xô cũ đã đi đến kết luận: cây chè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phíaNam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núi phía Bắc Việt Nam Ngày nay, câychè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới, trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,trải dài từ 30 vĩ độ nam đến 45 vĩ độ bắc, tập trung chủ yếu ở các nước châu Áchiếm 80 – 90% tổng diện tích chè thế giới.[5] Trong đó, nổi tiếng là Ấn Độ,Trung Quốc, Kenya, Sri Lanka, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam.[27]

Ở Việt Nam, chè được trồng trong khoảng 30 tỉnh, tập trung ở 14 tỉnh,trong đó vùng Trung du và miền núi phía Bắc chiếm khoảng trên 60%, TâyNguyên khoảng 14%, còn lại là các vùng khác.[5]

Loài: Camellia sinensis

Trên thế giới để dễ phân loại, người ta chia ra làm 2 loại: Chè Trung Quốc

và chè Ấn Độ[5]

2.1.2.1 Chè Trung Quốc (Camellia sinensis var sinensis)

Đặc điểm: Lá nhỏ, rất cứng Thuộc loại thân độc thân hoặc đa thân Cókhả năng thích nghi với điều kiện khí hậu khắc nghiệt như nhiệt độ thấp

Có hàm lượng tanin không cao Thích hợp cho sản xuất chè xanh

2.1.2.2 Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica)

Đặc điểm: Lá to, mềm, bóng Thuộc loại độc thân Có khả năng thích nghivới điều kiện nhiệt đới

Có hàm lượng tanin cao Thích hợp cho sản xuất chè đen

2.1.2.3 Đặc điểm một số giống chè trồng ở Việt Nam[5,25,27]

Chè là loại cây dễ lai chéo, nên có khả năng tạo ra nhiều giống mới Dướiđây là đặc điểm của một số giống chè được trồng chủ yếu ở nước ta

2.1.2.3.1 Giống Trung Du

Đây thực chất là giống chè Trung Quốc, được du nhập vào nước ta từ rấtlâu đời, ở vùng Trung du Bắc Bộ Giống có khả năng thích nghi với vùng đấtkhô cằn, khả năng kháng chịu sâu bệnh tốt và thích hợp ở mức trung bình cho cảsản xuất chè đen và chè xanh Hiện nay, giống này chiếm khoảng 60% tổng diệntích chè của cả nước

2.1.2.3.2 Giống Shan

Chiếm khoảng trên 20% diện tích, được phát triển chủ yếu ở vùng núi caonhư: Hà Giang, Sơn La,…Cây thuộc loại độc thân, lá to, thích nghi với điều kiệntương đối lạnh Giống có hàm lượng tanin khá cao, năng suất cao, chất lượngsản phẩm tốt Thích hợp cho cả sản xuất chè đen lẫn chè xanh

2.1.2.3.3 Giống PH1

Đây là giống được chọn tạo từ chè Assam-manipur tại trại chè Phú Hộ,hiện chiếm khoảng 10% diện tích Giống này có đặc điểm búp to, cuộng mập,thuỷ phần cao, năng suất cao nhưng chất lượng sản phẩm thấp do hàm lượngEGCG cao và để lại dư vị đắng cho sản phẩm

2.1.3 Thành phần hóa học cơ bản trong lá chè nguyên liệu [5,7,27,28]

Thành phần hoá học của chè rất đa dạng và phong phú Trong đó, có một

số lượng lớn các chất có giá trị sinh học cao Các hợp chất này vừa quyết địnhđến chất lượng chè thành phẩm, vừa quyết định đến tính chất dược lý của chè

Bảng 2.1: Thành phần hóa học trong lá chè tươi[28]

2.1.3.1 Nước[27,28]

Nước là thành phần lớn nhất ở búp chè, có vai trò quan trọng trong quátrình sinh trưởng của cây chè cũng như trong quá trình chế biến Hàm lượngnước trong các đọt chè tươi thường chiếm khoảng 75-82%, và phụ thuộc vào:

Độ non già của nguyên liệu, niên vụ, chế độ canh tác và phụ thuộc vào chất kíchthích sinh trưởng

2.1.3.2 Polyphenol - tanin chè [27,28]

Tanin chè là một hỗn hợp phức tạp các hợp chất có đặc tính polypenol,bao gồm các polyphenol catechin đơn giản và các sản phẩm oxy hóa của chúng

Tanin chè là thành phần hoá học quyết định đến các tính chất màu sắc,hương vị của các loại chè sản phẩm do chính chúng tạo ra hoặc do những biếnđổi hoá học của chúng đem lại Hàm lượng tuyệt đối của tanin chè càng cao thìchất lượng của chè càng tốt Tanin bị phân huỷ ở nhiệt độ cao (180-2000C)

Hợp chất polypenol thường chiếm khoảng 20-30% chất khô Theo kết quảnghiên cứu các giống chè, thành phần của tanin trong chè tươi nguyên liệu gồmcó:

- Nhóm chất catechin (tiền chất của tanin) đơn phân tử chiếm khoảng trên80% tổng lượng tanin chè, có vị chát - đắng

- Nhóm tanin đặc biệt: là polyphenol đa phân tử, chúng tạo màu và vị chátdịu cho chè

- Nhóm chất phi tanin: Nhóm này gồm 7 catechin khác nhau đó làEpicatechin (EC), Epigalocatechin (EGC), Galocatechin (GC), Epicatechingalat(ECG), Epigalocatechingalat (EGCG), Galocatechingalat (GCG) và Catechin.Trong đó EGCG có vị đắng đặc trưng còn EC, EGC và GC có vị chát dịu Nhómchất phi tanin có vị đắng ở dạng glucozit và có màu thuộc họ flavonol

Hợp chất polyphenol là sản phẩm của quá trình quang hợp do đó nó bị ảnhhưởng của các yếu tố: mức độ sinh trưởng của lá, chế độ bón phân, cường độchiếu sáng

2.1.3.3 Protein và chất chứa nitơ [5,27,28]

Trong đọt chè tươi có chứa một lượng lớn các hợp chất chứa nitơ, chiếmkhoảng 18% chất khô, nhờ quá trình phân giải protein dưới tác dụng của enzymeproteaza tạo nên mùi thơm và một phần vị cho chè Các axit amin trong lá chèđóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo hương thơm mới cho chè sản phẩmkhi lên men chè hoặc khi chế biến nhiệt

Hàm lượng protein trong lá chè luôn luôn thay đổi và phụ thuộc vào nhiềuyếu tố như mùa vụ, chế độ chăm sóc, độ non già của nguyên liệu

2.1.3.4 Ankaloid [5,7,27,28]

Nhóm hợp chất ankaloid trong chè có nhiều nhưng về hàm lượng thì nhiềunhất là cafein Hàm lượng cafein trong đọt chè non một tôm 2,3 lá non chiếmkhoảng 2-4% chất khô, cao hơn hai lần trong hạt cà phê Cafein bị thăng hoa ởnhiệt độ 1800C nên ít bị tổn thất nhiều khi sấy

Hàm lượng cafein trong chè cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giốngchè, điều kiện canh tác, kỹ thuật chăm bón và nhất là độ trưởng thành của đọtchè, lá chè càng non càng chứa nhiều cafein

2.1.3.5 Hợp chất pectin [27,28]

Pectin là hợp chất thuộc nhóm glucid Hàm lượng pectin trong chè chiếmkhoảng 2% chất khô, thay đổi phụ thuộc vào độ trưởng thành của lá chè, lá càngnon thì hàm lượng pectin hoà tan trong nước càng tăng Pectin có tính keo, khi

bị hydrat hoá thì tính keo tăng lên, có vai trò định hình cho chè thành phẩm, tạo

vị ngọt dịu, tạo độ sánh, độ nhớt cho nước chè pha Nhưng pectin cũng là chấthút ẩm mạnh nên gây khó khăn trong việc bảo quản chè lâu dài

2.1.3.6 Nhóm chất thơm [27,28]

Hương thơm của chè trước hết phụ thuộc vào thành phần và hàm lượngcác cấu tử tinh dầu có trong nguyên liệu và được tạo mới trong quá trình chếbiến chè Sự tích luỹ các chất thơm phụ thuộc vào giống chè, điều kiện khí hậu

và đất đai Hàm lượng chất thơm trong lá chè khoảng 0,02-0,2% chất khô

2.1.3.7 Các chất tro [1,5,28]

Chất tro trong nguyên liệu chè non chiếm khoảng 4-5% chất khô vàkhoảng 5-6% trong chè sản phẩm Trong chè, chất tro chia làm 2 nhóm chính:hòa tan trong nước và không hòa tan trong nước Chất tro là chỉ tiêu đánh giáchất lượng vệ sinh công nghệ trong chế biến chè

- Trong nhóm enzyme thuỷ phân, proteaza và glucosidaza đóng vai tròquan trọng trong sự tạo thành hương vị đặc trưng cho chè sản phẩm sau này

- Nhóm enzym oxy hoá khử trong chè gồm: polyphenoloxydaza, catalaza,peroxydaza Nhóm này đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men chè đen

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ

của FAO, có hơn 58 nước trồng và chế biến chè Trong đó, Ấn Độ, Sri Lanka,Kenya và Trung Quốc luôn đứng đầu về năng suất và chất lượng[6] Trước nhucầu tiêu thụ chè chất lượng cao ngày càng tăng, các nước sản xuất và tiêu thụchè buộc phải đầu tư chiều sâu cho vùng trồng chè như cải thiện giống, thựchiện nghiêm các kỹ thuật canh tác, thu hái, công nghệ chế biến…[29]

Hàng năm, 45% sản lượng chè thế giới dành cho xuất khẩu Công nghiệpchè đã chiếm một vai trò quan trọng đối với nền kinh tế của nhiều nước Theonghiên cứu, xuất khẩu chè đã mang lại 33% thu nhập từ các sản phẩm nôngnghiệp của Kenya, 55% ở Srilanca, 2% ở Indonexia và 5% tại Tanzania.[6]

2.2.1.2 Tình hình tiêu thụ[30]

Giá chè thế giới năm 2009 đã tăng gấp đôi so với năm 2008 lập kỷ lục caocủa nhiều năm nay do hạn hán ở Ấn Độ, Sri Lanka và Kenya, trong khi nhu cầuchè thế giới tăng mạnh

Từ mức giá trung bình 2,38 USD/kg năm 2008, giá chè hảo hạng BP1scủa Kenya đã tăng lên 2,74 USD/kg vào đầu năm 2009, tiếp tục tăng lên 3,18USD/kg vào tháng 9/2009 và kết thúc năm 2009 ở mức 5,45 USD/kg Nhu cầuchè cao ngay cả trong giai đoạn kinh tế suy thoái, nhất là với các loại chè chếbiến Giá chè tăng đã không ảnh hưởng nhiều tới tiêu thụ ở các nước phát triểnbởi sức cạnh tranh của mặt hàng này rất cao trên thị trường đồ uống nói chung

Dự báo tình trạng thiếu cung chè sẽ càng thêm trầm trọng trong năm 2010 dosản lượng ở Châu Phi, Sri Lanka và Ấn Độ tăng không theo kịp mức tăng củanhu cầu về chè Theo Ông Aditya Khaitan, Giám đốc công ty McLeod RusselIndia Ltd - công ty sản xuất chè lớn nhất thế giới, dự báo thị trường chè thế giới

có thể thiếu cung cao hơn so với dự báo hồi tháng 10/2009, giá có thể lập kỷ lụccao mới trong năm nay do tình trạng thiếu hụt kéo dài quá lâu

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam[29,30]

2.2.2.1 Tình hình sản xuất [29]

Việt Nam có lịch sử trồng chè từ lâu đời, nhưng cây chè chỉ mới đượctrồng và phát triển với quy mô lớn từ khoảng 100 năm nay, tập trung ở vùngTrung du miền núi phía Bắc và Tây nguyên như: Thái Nguyên, Sơn La, BắcThái, Hà Tuyên, Lâm Đồng, Gia Lai, [5] Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn, năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5nghìn ha, tăng 1.900 ha so với năm 2007 Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiếnđạt 6,5 tấn búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha của năm 2007 Mặc dù tốc độtăng diện tích chè cao đến chóng mặt trong vòng 10 năm qua (1996 - 2005), lêntới gần 150%, nhưng sản lượng chè nguyên liệu vẫn thiếu hụt do không chạytheo nổi số lượng nhà máy, cơ sở chế biến được thành lập mới và do năng suấtchè không cao Trên 70% diện tích chè hiện sử dụng là các giống chè chất lượngtrung bình

2.2.2.2 Về tình hình tiêu thụ [30]

Năm 2009, kim ngạch xuất khẩu chè của Việt Nam tăng khoảng 40 triệuUSD so với năm trước Đây là một trong số ít những ngành giữ được phong độxuất khẩu trong bối cảnh kinh tế toàn cầu sa sút Việt Nam hiện có 270 doanhnghiệp sản xuất, kinh doanh chè Trong đó, 75% lượng chè khô làm ra hàng nămđược xuất khẩu sang 110 nước và vùng lãnh thổ và hiện đứng thứ 5 thế giới sauTrung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Kenya về sản lượng cũng như kim ngạch xuấtkhẩu

Triển vọng thiếu cung chè trong những tháng tới sẽ là cơ hội tốt cho ngànhchè Việt Nam Tuy nhiên, điểm yếu của chè nước ta là chất lượng không đồngđều, nên giá chưa cao, chỉ bằng nửa giá thế giới Trong khi giá chè trung bìnhtoàn cầu năm 2009 là 2,2 USD/kg thì chè Việt Nam chỉ khoảng 1,1 USD/kg Dovậy, trong khi khối lượng xuất khẩu tăng mạnh thì trị giá xuất khẩu chỉ tăngkhoảng 13,6%, đạt 167 triệu USD Trong 6 tháng đầu năm 2009, thị trường xuất

khẩu chè nhiều nhất của Việt Nam là Pakistan, thứ hai là Nga, xuất sang TrungQuốc tăng nhẹ.

Bảng 2.2: Thị trường xuất khẩu chè 6 tháng đầu năm 2009 [30]

Thị trường XK Lượng (tấn) Trị giá (USD)

cơ sở áp dụng tiêu chuẩn về chất lượng, ATVSTP đối với chè như 9001:2000 và HACCP Bên cạnh đó, từng địa phương phải đảm bảo điều tiết,phân vùng nguyên liệu các cơ sở chế biến để khắc phục cả hai xu hướng: tranhchấp trong thu mua hoặc ép cấp, ép giá đối với người sản xuất

ISO-2.3 GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOL CHÈ

2.3.1 Bản chất của Polyphenol chè

Trong cây chè, polypenol là thành phần hóa học chủ yếu chiếm khoảng20-30% khối lượng chất khô Trong đó, catechin chiếm tỷ lệ cao hơn cả (chiếmkhoảng 15- 20% chất khô và trên 70% tổng lượng polypenol trong lá chè) [1,4].Hiện nay trong chè người ta tìm được các loại polypenol – catechin sau: EC,EGC, GC, ECG, EGCG, GCG, C Trong đó EGCG chiếm đến 75% tổng lượngcatechin Các polypenol-catechin này có vai trò quyết định đối với chất lượngcảm quan và tính chất dược lý của chè [4]

Catechin có công thức cấu tạo chung như sau:

trong đó, khi R1 =R2 = H ta có epicatechin (EC); khi R1 =OH, R2 = H ta cóepigallocatechin (EGC) Khi R2 là gốc gallat:

Và, nếu R1 = H ta có epicatechingallat (ECG), còn khi R1 =OH ta cóepigallocatechin gallat (EGCG)

Chính các polypenol trên là thành phần chính trong phức tanin của chè

2.3.2 Đặc tính của Polyphenol

2.3.2.1 Hoạt kháng oxy hóa

Đặc điểm chính của chất kháng oxy hóa là nó có khả năng khử các gốc tự

do Những gốc tự do này có thể oxy hóa nucleic aicd, protein, lipid hoặc DNA

và gây bệnh thoái hóa Hợp chất kháng oxy hóa như là phenolic acid, polypenol

và flavonoid sẽ thu nhận các gốc tự do (peroxide, hydroperoxide hoặc lipidperoxyl ) và do đó dập tắt các quá trình tự oxy hoá này.[18,19]

Khi khảo sát khả năng quét gốc tự do tổng hợp như DPPH, ABTS…, cácpolypenol – catechin chè thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy

hóa đối chứng như vitamin C, Vitamin E, trolox từ 3 đến 6 lần Trong cáccatechin chè, EGCG và ECG có hoạt tính này trội hơn cả và được xếp theo trật

tự giảm dần như sau: ECG ≈ EGCG > EGC > GC > EC ≈ C [22] Sự khác biệtnày là dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức cấu tạo, chophép tiếp nhận electron dễ dàng hơn [19] Trong nước chiết chè, các catechinđóng góp khoảng 70 – 80% khả năng kháng oxy hóa [22] Khi tiến hành thử

nghiệm in vitro và in vivo về khả năng kháng oxy hóa trong môi trường lipid

như chống oxy hóa lipid màng tế bào (LDL), chống oxy hóa các acid béo, hayquét các gốc tự do superoxyl, hydroxyl… các hợp chất catechin đều thể hiện khảnăng phản ứng rất mạnh

2.3.2.2 Hoạt tính chống khuẩn

Liên quan đến hoạt tính chống khuẩn của polypenol chè, phần lớn cácnghiên cứu tập trung trên tác dụng của catechin đối với các vi khuẩn gây bệnhcho con người có trong thực phẩm Mendel (2007) đã chỉ ra rằng, ở nồng độ 10-9

mol/l, catechin chè có khả năng ngăn cản Bacillus cereus Chất chiết chè xanh

và chè đen đều có thể ngăn cản sự phát triển của Campylobacter jejuni và

Campylobacter coli ( Diker cộng sự, 1991); ngoài ra polypenol chè có thể ngăn

cản sự sinh bào tử và phát triển của Cl Perƒringens đối với bảo quản lạnh thịt

gà tây (Juneja et al., 2007); hay polypenol chè có khả năng chống lại in vitro đối với Staph Aureus và L monocytogenes nhưng không có tác dụng với E Coli

O157:H7 (Jim và cộng sự, 2004),…Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu vềảnh hưởng của polypenol chè đối với các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng.Fukai và cộng sự (1991) đã nghiên cứu ảnh hưởng của polypenol chè trên 8

chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách , súp lơ, cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh, thối ướt, đốm lá trên tỏi, súp lơ, xà

lách…, kết quả cho thấy: catechin chè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩnnày, nồng độ ức chế tối thiểu của các polypenol chè đều dưới 100ppm Trong 4cấu tử catechin thử nghiệm (EGC, EGCG, EC, ECG) thì EGCG và EGC hiệu

quả hơn cả Về ảnh hưởng của chất chiết chè đối với bảo quản nông sản, Ana vàcộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của polypenol đến các chỉ tiêu cảmquan, nâu hoá, hô hấp, pH, vitamin C, caroten… của xà lách chế biến tối thiểu.Các tác giả cũng chỉ ra rằng, sử dụng polypenol ở nồng độ 0.25g/100ml nước đểbảo quản xà lách chế biến tối thỉểu cho hiệu quả cao hơn khi so sánh với xử lýbằng Clo ở nồng độ 120ppm Đây là những thông tin khoa học quan trọng để sửdụng polypenol chè trong bảo quản nông sản, thực phẩm.

2.3.3 Tiềm năng ứng dụng của Polyphenol chè[24,31]

Nhìn chung, tác dụng kháng oxy hóa của polypenol trong chè có vai trò rấtlớn và đặc biệt quan trọng trong các lĩnh vực y học – sức khỏe và thực phẩm

Trong y học, hợp chất kháng oxy hóa đóng vai trò quan trọng như là nhân

tố bảo vệ sức khỏe Một số nghiên cứu lâm sàng cho thấy, các chất kháng oxyhóa có trong ngũ cốc, trái cây, rau quả, rượu vang đỏ và đặc biệt là chè có thànhphần là vitamin C, vitamin E, caroten, phenolic acid, phytate, phytoestrongen,hợp chất polyphenol là yếu tố chính làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh nan y như:bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột và ngoài ra còn có tác dụnglàm chậm quá trình lão hoá, tăng tuổi thọ EGCG chè xanh giúp ngăn ngừa vàđiều trị bệnh viêm răng lợi, ngăn ngừa chứng huyết khối, nó giúp ích trong việcphòng và điều trị các chứng tắc mạch và thiếu máu cục bộ cũng như giảm thiểunguy cơ đột qụy do nhồi máu cơ tim, giúp xương vững chắc, giảm cân, giúpngăn ngừa và điều trị chứng loét dạ dày Một tác dụng tích cực khác từ chè làgiúp giảm nguy cơ ung thư Hoạt chất EGCG có khả năng ức chế sự phát triểncủa các tế bào ung thư, do đó nó giúp giảm nguy cơ ung thư cũng như sự lan tỏacủa các tế bào khối u

Trong thực phẩm, đặc tính kháng oxi hoá của catechin chè có thể được sửdụng như những chất kháng oxi hoá tự nhiên, hoặc được sử dụng để tạo ra cácthực phẩm chức năng (Yang và cộng sự, 1995; Jiang và cộng sự, 1995) Khinghiên cứu ảnh hưởng của polypenol chè đến sự oxi hoá lipid đối với “thịt đỏ”,

thịt gia cầm, cá, Shuze và cộng sự (2001) nhận thấy: polypenol chè ở nồng độ300mg/kg thịt có thể ngăn cản được quá trình tiền oxy hoá lipid Cũng ở bảoquản cá, Chih-Cheng và Chung-Saint (2005) đã nhận thấy rằng, chất chiết chèxanh và chè Pouchung ở nồng độ 5% (5g chè/100ml nước) có thể ngăn cản sựoxy hoá lipid và protein đồng thời lưu giữ được chất lượng cá ngừ filet bảo quảnbằng phương pháp lạnh đông.

Trong mỹ phẩm, do tác dụng ngăn cản quá trình oxy hóa nên polypenolchè đặc biệt được chú ý đến trong các ngành mỹ phẩm Với da, chè còn có tácdụng đặc biệt do thành phần của vitamin B2 Vitamin B2 có tác dụng giữ tínhđàn hồi cho da, không bị khô ráp và mềm mại Vitamin P và K tạo nên vẻ đẹpbên ngoài cho da, giúp tuần hoàn máu làm cho da luôn hồng hào, tươi tắn Hơnnữa trong chè còn có một lượng chất sắt nhất định, giúp củng cố lượng hồng cầutrong máu [24] Đặc biệt, polypenol chè có khả năng chống lại được các tia cựctím khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và là tác nhân chống oxy hóa mạnh bảo vệcho da chống lão hóa [31] Do vậy, ngành công nghiệp mỹ phẩm đã tạo ra cácloại kem chống nắng được bổ sung chất chiết xuất từ chè xanh

Với xu hướng sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chiết xuất từ thiênnhiên, chè xanh sẽ ngày càng được chú ý, ưa chuộng và trong tương lai sẽ ngàycàng có nhiều các sản phẩm từ chè phục vụ trong mọi lĩnh vực của đời sống conngười

2.4 GIỚI THIỆU VỀ 3 CHỦNG VI KHUẨN

2.4.1 Bacillus subtilis[6]

B subtilis là vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí sống ký sinh, có

khả năng sinh bào tử, được tìm thấy phổ biến trong đất, trong nước biển, nướcngọt Đặc biệt, người ta cũng phân lập được vi khuẩn này trong cơ thể người(khi bị viêm tim, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng mắt ) và trong cácnông sản thực phẩm Nhiệt độ tối ưu từ 25 – 350C

Tính chống chịu của bào tử B subtilis là vấn đề nghiêm trọng trong các

ngành công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và ngành sản xuất vật liệu tiệt

trùng Khả năng này là do bề mặt của bào tử Bacillus rất kỵ nước Điều này cho

phép chúng bám chặt vào bề mặt thiết bị, ngay cả với vật liệu Inox và làm giảmmạnh hiệu quả của quá trình vệ sinh, tẩy rửa

Trong một số trường hợp, B subtillis cũng gây ra vấn đề ngộ độc thực

phẩm (thịt lạnh, pizza, bánh ) với các triệu chứng: nôn mửa, ỉa chảy, thườngxuất hiện sau ăn thực phẩm bị nhiễm từ 2 đến 5 giờ Ngoài ra nó cũng là mộttrong những nguyên nhân gây bệnh viêm vú ở bò, có thể tái nhiễm ngay cả khi

được xử lý kháng sinh (Euzéby J.B (2007) Dictionnaire de bactériologie

vétérinaire http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/bacillus.html)

2.4.2 Bacillus cereus[6]

B cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kích thước bào tử không

vượt quá kích thước tế bào nên khi sinh bào tử tế bào không bị biến dạng

Điều kiện phát triển:

- Nhiệt độ tối thích: 30 – 370C

- pH: (4,3 - 9,3), bị ức chế khi có 0,1% acetic acid (pH 5,1)

- Phát triển tốt khi có oxy

Thực phẩm bị nhiễm B cereus gây bệnh cho người là thịt, hải sản, sản

phẩm ngũ cốc, sản phẩm rau, nhiều loại thảo mộc, gia vị sấy khô, nước sốt, xôi,cơm đĩa Ở Mĩ, cơm chiên được xem là một trong những nguyên nhân hàng đầu

của nhiễm vi khuẩn B cereus Chính vì thế mà có người còn gọi hội chứng cơm chiên Bào tử B cereus thường có mặt ở trên ngũ cốc và có thể sống sót khi đun

nấu không kỹ Trực khuẩn còn sống sót phát triển sẽ sinh độc tố

B.cereus phân bố rộng, trong đất, bụi, không khí, nước Nó có thể sinh

bào tử và sống sót trong tất cả các giai đoạn của quá trình chế biến Thực phẩmchứa > 104 CPU B.cereus/g có thể coi là không an toàn cho sử dụng Vi khuẩn

này có khả năng gây viêm ruột Người bị phơi nhiễm vi khuẩn có thể bị viêm

ruột trong vòng 1 đến 6 giờ, và dẫn đến tiêu chảy, ói mửa, đau bụng trong vòng

6 đến 24 giờ

2.4.3 Proteus[6]

Đặc điểm : Proteus là vi khuẩn sống ký sinh ở ruột và các hốc tự nhiên

của người Chúng là loại vi khuẩn “gây bệnh cơ hội”

Proteus là trực khuẩn gram âm, di động mạnh Vi khuẩn có nhiều hình thể

thay đổi trên các môi trường khác nhau, từ dạng trực khuẩn đến dạng hình sợidài Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên môitrường thạch dinh dưỡng, khuẩn lạc có một trung tâm lan dần ra, từng đợt, từngđợt , mỗi đợt là một gợn sóng và có mùi thối đặc biệt Trên môi trường có natri

deoxycholate, Proteus mọc thành khuẩn lạc tròn, riêng biệt không gợn sóng, có

một điểm đen ở trung tâm, xung quanh màu trắng nhạt

Nguồn lây nhiễm: Proteus có rộng rãi trong tự nhiên, có trong ruột người

và chỉ gây ngộ độc khi có điều kiện, ngộ độc thức ăn do Proteus chiếm tỷ lệtương đối cao, nhiều nhất là khi xâm nhập vào thịt sống

Biểu hiện bệnh: Proteus là một loại vi khuẩn "gây bệnh cơ hội" Chúng

có thể gây ra : viêm tai giữa có mủ, viêm màng não thứ phát sau viêm tai giữa ởtrẻ còn bú, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết

Đặc điểm của các tổn thương và mủ do Proteus gây ra có mùi thối như

trong hoại thư do vi khuẩn kị khí gây nên

Phần III

VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP

3.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- 3 chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus sp được

mua tại viện bảo tàng giống vi sinh vật – Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Nước cất, acetone, ethyl acetate, methanol 70%, cồn 700, (Na2CO3)7,5%, NaOH 25%, acid gallic monohydrate Chloroform, gelatin (Trung Quốc).Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Đức)

- Môi trường Mueller Hinton (Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire,England)

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị sử dụng

- Cân phân tích với độ chính xác 0.001g Máy lắc ngang (GYROMAXTM,Model 727, USA) Máy quang phổ (UV-VIS 1800 – Shimadzu) Máy sấy chânkhông Bếp điện, bếp cách thủy, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh

- Bình tam giác các loại, bình định mức, cốc đong, ống nghiệm,micropipet các loại , đĩa petri loại 100mm, que cấy vòng, đèn cồn, cốc thủy tinh

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của giống và chất lượng nguyên liệu đếnhàm lượng polyphenol

3.2.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng loại nguyên liệu giống

Trung du, Shan và PH1 đối với Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus sp

3.2.3 Đánh giá tương quan giữa hàm lượng polyphenol trong nguyên liệuvới hoạt tính kháng khuẩn

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu

Mẫu chè tươi được hái trên đồi chè theo 4 hướng Đông, Tây, Nam, Bắc vàmột điểm ở giữa Hái ở các điểm rồi trộn đều và lấy mẫu trung bình theo phươngpháp đường chéo Mẫu sau khi thu hái được vô hoạt enzyme bằng cách hấp ngay

ở 950C trong 3 phút, sau đó được sấy khô đến độ ẩm 5% trong máy sấy đôngkhô (-450C) Mẫu sau sấy được nghiền nhỏ ở kích thước 0,5 -1mm và được bảoquản trong túi PE đựng trong lọ thủy tinh ở 40C

3.3.2 Phương pháp xác định polyphenol tổng số trong chè

Xác định polyphenol tổng số trong chè theo phương pháp ISO

14502-1 :2005

3.3.2.1 Chiết xuất polyphenol

- Cân chính xác 0,2 ± 0,001 g chè khô (độ ẩm khoảng 5%, kích thước 1mm, phải trộn đều lấy đại diện) cho vào ống nghiệm hoặc ống chiết (10 ml)

0,5 Cho bình tam giác có chứa dung môi methanol 70% vào bể ổn nhiệt ở

700C trong 30 phút

- Đặt ống nghiệm chứa mẫu vào bể ổn nhiệt ở 700C, để khoảng 1 phút rồicho 05 ml methanol 70% ở 700C vào ống chiết Sau đó, lấy ra và khuấy trộn trênVortex

- Tiếp tục nâng nhiệt ống chiết trong bề ổn nhiệt (700C) và khuấy trộn lạitrên Vortex ở các thời điểm 5 và 10 phút trích ly

- Sau khi chiết (10 phút), dịch chiết được hạ xuống nhiệt độ phòng bằng

phương pháp tự nhiên và được ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 10 phút

- Gạn cẩn thận phần dịch trong phía trên của ống chiết vào một ốngnghiệm khắc độ 10 ml (hoặc bình định mức 10 ml) Phần bã tiếp tục được chiếtlại một lần nữa với thủ tục như trên Sau đó dịch chiết sau ly tâm của lần chiết 2được dồn với lần chiết 1 (trong bình địch mức 10 ml) và dùng methanol 70% ởnhiệt độ thường lên thể tích tới vạch

3.3.2.2 Pha loãng

Lấy 1 ml dịch chiết ở trên + 99 ml nước cất 2 lần, lắc đều (chuẩn bị trongbình định mức 100 ml) Dịch pha loãng này được sử dụng để xác định hàmlượng polyphenol tổng số

3.3.2.3 Xây dựng đường chuẩn acid gallic

Đường chuẩn acid gallic được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 10 đến

50 μg/ml (dung dịch chỉ sử dụng trong ngày).

3.3.2.4 Xác định hàm lượng polyphenol

- Dùng Pipette chuyển 1 ml nước cất vào ống nghiệm 10 ml (nhắc lại 2lần) - mẫu trắng

- Dùng pipette chuyển 1 ml dịch chiết mẫu pha loãng vào các ống nghiệm

10 ml (nhắc lại 2 lần) - Mẫu phân tích

- Dùng pipette cho 5 ml dung dịch Folin-ciocalteu 10% vào mỗi ốngnghiệm và lắc đều

- Sau khi cho folin-ciocalteu 5 phút, tiếp tục cho 4 ml NaCO3 7,5% vàomỗi ống nghiệm, nút miệng ống, lắc đều

- Để các ống phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 60 phút sau đó đo mật độquang ở 765 nm (cuvet 10 mm, cửa đối chứng là nước cất)

3.3.2.5 Tính kết quả

Hàm lượng polypenol tổng số (WT, % CK) được tính theo công thức:

(Dsample - Dintercept) x Vsample x d x 100

WT =

Sstd x msample x 10.000 x WDM,sample

Trong đó:

Dsample: mật độ quang thu được của dung dịch mẫu

Dintercept: mật độ quang khi x bằng 0

Sstd: giá trị hệ số góc (a)

msample: khối lượng mẫu phân tích (g)

Vsample: thể tích dịch chiết (ml) (10 ml)

d: hệ số pha loãng (100)

WDM,sample: hàm lượng chất khô của mẫu phân tích (%)

3.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol

Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol được xác định theo phương phápxác định đường kính vòng vô khuẩn

Phương pháp hoạt hóa, chuẩn bị dịch vi khuẩn

Vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh Từ ốngtồn trữ, cấy 1 vòng que cấy vào bình tam giác chứa 50ml môi trường MuellerHinton (không có agar) đã khử trùng, nuôi cấy lắc ở 370C, 220vòng/phút trong48h

Xác định số lượng tế bào vi khuẩn (theo phương pháp đếm trực tiếp bằngbuồng đếm hồng cầu), pha loãng bằng nước cất vô trùng để số lượng tế bào vi

khuẩn khoảng 10 CFU/ml (Dung dịch đã pha loãng này dùng để tiến hành cấy

lên môi trường).

Chuẩn bị môi trường

Cân 38g môi trường chuẩn Mueller-Hinton pha với 1000ml nước cất , đun

sôi cho tan hết thạch, chia ra các bình tam giác 250ml, hấp khử trùng ở 1210C/15phút Để thạch nguội xuống khoảng 40-450C, đổ 25ml môi trường vào mỗi đĩapettri Để thạch đông, nhỏ 10μl dịch vi khuẩn 106CFU/ml cho mỗi đĩa, changđều Khi bề mặt khô thì tiến hành đục lỗ thạch bằng nút khoan, đường kính lỗkhoảng 6mm

Chuẩn bị dịch chiết chè

Các giống chè được trích ly theo phương pháp ISO 14502-1:2005 Sửdụng ngay dịch chiết sau khi lên định mức 10ml với methanol 70%, không phaloãng

Mỗi đĩa pettri chang một chủng vi khuẩn Trên đĩa pettri, tiến hành đục 4

lỗ, đường kính lỗ 6mm, mỗi lỗ cách nhau ít nhất 20mm 03 lỗ được truyền dịchchiết của 3 loại nguyên liệu khác nhau (1 tôm 2 lá, loại B và lá già của cùng mộtgiống), lỗ thứ 4 làm đối chứng Thí nghiệm lặp lại 3 lần

3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm IRRISTAT 4.0

Phần IV