Khảo sát sự ổn định chủng E.coli và Bacillus cereus trên nền mẫu và điều kiện bảo quản khác nhau

Chu Nguyên Thanh và CN... DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI U Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus.. Hình 5: Vi khu n Escherichia coli... tài th c hi n trên E.coli và Bacillus cereus... - Indole: Tro

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T

GVHD: Th.S Nguy n V n Hòa

Th.S Tr n Th Ánh Nguy t SVTH: Nguy n Kim Hoàng

MSSV: 1053012253 Khóa: 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

L I C M N

u tiên em xin g i l i c m n chân thành đ n th y Nguy n V n Hòa, th y

Nguy n V n Minh, cô D ng Nh t Linh, cô Ph m Vân An, ThS Tr n Th Ánh

Nguy t, ThS V Di u Thu, ThS Chu Nguyên Thanh và CN Nguy n Th Ng c Thùy

đã t n tình h ng d n, giúp đ em trong su t th i gian th c t p và khóa lu n t t

nghi p

Em xin c m n Ban giám đ c Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng

3 - QUATEST 3 và các nhân viên Phòng Vi sinh - GMO đã luôn t o đi u ki n t t

nh t, truy n đ t các ki n th c khoa h c và kinh nghi m qúy báu cho em đ em có

th t tin cho công vi c trong t ng lai

Cu i cùng, em xin c m n Ban giám hi u Tr ng i h c M Thành ph H Chí

Minh, các th y cô Khoa Công Ngh Sinh H c cùng gia đình và các b n sinh viên

l p Công Ngh Sinh H c khóa 010 đã h t lòng quan tâm h tr , t n tâm d y d và

đ ng viên em đ em hoàn thành t t khóa lu n t t nghi p này

Thành ph H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

Sinh viên Nguy n Kim Hoàng

M C L C

T V N 6

M c tiêu 6

PH N 1: T NG QUAN 7

1.1 T ng quan v Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng 3 - QUATEST 3 7

1.1.1 Gi i thi u chung v Trung tâm 7

1.1.2 Phòng vi sinh & GMO 11

1.2 i c ng v Bacillus cereus và Escherichia coli 11

1.2.1 i c ng v Bacillus cereus 11

1.2.2 i c ng v Escherichia coli 16

PH N 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 21

2.1 Th i gian vƠ đ a đi m th c hi n 21

2.2 V t li u 21

2.2.1 Thi t b và d ng c 21

2.2.2 Hóa ch t vƠ môi tr ng 21

2.2.3 V t li u thí nghi m 21

2.3 Ph ng pháp th c hi n 22

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 35

3.1 K t qu ki m tra đ nhi m khu n c a m u 35

3.2 K t qu t ng sinh ch ng vi sinh v t 35

3.3 Kh o sát s n đ nh c a Bacillus cereus trên n n m u g o 36

3.4 Kh o sát s n đ nh c a Escherichia coli trên n n m u rau s y 40

PH N 4: K T LU N VÀ NGH 43

4.1 K t lu n 43

4.2 ngh 43

TÀI LI U THAM KH O 44

PH L C 46

DANH SÁCH CÁC CH VI T T T

1) AOAC: Association of Official Analytical Chemists

2) B.cereus: Bacillus cereus

3) DSM: Difco Sporulation Medium

4) E.coli: Escherichia coli

5) EMB: Eosin Methylene Blue Lactose

6) GMO: Genetically Modified Organism

7) IEC: The International Electrotechnical Commission

8) ISO : International organization for standardization

15) TCVN: Tiêu chu n Vi t Nam

16) TSB : Trypticase (tryptic) soy broth

17) VSV: Vi sinh v t

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI U

Hình 1: Vi khu n Bacillus cereus

Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi đi n t

Hình 3: C u trúc bào t ch ng B cereus S69 không ho t đ ng quan sát d i kính

hi n vi đi n t

Hình 4 :Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi 100X

Hình 5: Vi khu n Escherichia coli

Hình 6: K t qu th nghi m IMViC c a Escherichia coli

Hình 7: M u g o sau khi s y khô

Hình 8: Khu n l c Escherichia coli trên mô tr ng TBX

Hình 9: Khu n l c c a Bacillus cereus trên MYP

Hình 10: Khu n l c Bacillus cereus có vòng phân gi i h ng c u trên th ch máu

Bi u đ 3.1: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr ng TSB các nhi t

đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau

Bi u đ 3.2: K t qu m t đ bào t Bacillus cereus trên môi tr ng DSM các

nhi t đ 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th i đi m khác nhau

DANH SÁCH CÁC B NG

B ng 3.3.1: M t đ ch ng Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g)

B ng 3.3.2: M t đ bƠo t Bacillus cereus sau khi b o qu n (CFU/g)

B ng 3.4: M t đ ch ng Escherichia Coli sau khi b o qu n (CFU/g)

T V N

Vi sinh v t lƠ các c th s ng vô cùng nh bé có các đ c tính sinh lí, sinh hóa

khó n đ nh qua th i gian dài Các vi sinh v t có th phát tri n m nh h n ho c b

ch t đi do tác đ ng c a các đi u ki n b o qu n, v n chuy n, y u t ngo i c nh khác

nhau Vì v y, vi c t o ra m t m u chu n (reference material) có ch a m t đ vi sinh

v t n đ nh trong th i gian dài là r t khó kh n chính xác c a các k t qu phân

tích và thao tác c a k thu t viên là h t s c quan tr ng trong các nghiên c u khoa

h c công ngh c ng nh trong ki m tra, đánh giá ch t l ng s n ph m Trên th c

t , có r t nhi u phòng thí nghi m vi sinh r t c n các m u chu n có ch a vi sinh v t

m c tiêu có m t đ n đ nh Các m u chu n này s giúp các phòng thí nghi m có

th t ki m tra tay ngh c a nhân viên, nâng cao hi u qu ki m soát ch t l ng,

ki m soát quy trình thí nghi m, ki m tra giá tr s d ng c a ph ng pháp th

nghi m và ch ng minh n ng l c k thu t c a phòng thí nghi m đ i v i các bên

quan tâm

Hi n nay, trên th tr ng, các r t nhi u nhà cung c p các m u chu n vi sinh (APLAC, CMS, LGC,ầ) nh ng v i giá c khá cao (kho ng 6,5 tri u/m u) V n đ nƠy gơy khó kh n cho các phòng thí nghi m đ th c hi n công tác đ m b o ch t

l ng VƠ đơy c ng lƠ đòi h i c a c quan qu n lỦ nhƠ n c trong vi c công nh n

phòng th nghi m, phòng xét nghi m và phòng thí nghi m theo ISO/IEC 17025 T nhu c u trên, tôi xin ti n hƠnh đ tƠi “Kh o sát s n đ nh c a c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u và đi u ki n b o qu n khác nhau.” tài nh m

xây d ng các m u th ch a vi sinh v t m c tiêu cho ch ng trình ki m tra đánh giá

tay ngh c a ki m nghi m viên ho c s d ng làm m u ki m soát ch t l ng ph c

v quá trình ki m soát quy trình phân tích t i phòng thí nghi m tài th c hi n trên E.coli và Bacillus cereus

 M c tiêu

Kh o sát s n đ nh c a c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m u vƠ đi u ki n

b o qu n khác nhau

PH N 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan v Trung tâm k thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng 3 - QUATEST 3 [17]:

1.1.1 Gi i thi u chung v Trung tâm

QUATEST 3 là t ch c khoa h c công ngh thu c T ng c c Tiêu chu n o

l ng Ch t l ng ậ B Khoa h c và Công ngh , đ c thành l p t tháng 5 n m

1976 trên c s Vi n nh chu n Qu c gia tr c đơy

QUATEST 3 áp d ng h th ng qu n lý ch t l ng theo tiêu chu n ISO 9001;

l nh v c thí nghi m đ c công nh n phù h p v i tiêu chu n ISO/IEC 17025, l nh

v c giám đ nh hàng hóa đ c công nh n phù h p v i ISO/IEC 17020, l nh v c

ch ng nh n s n ph m đ c công nh n phù h p v i ISO/IEC Guide 65 và l nh v c

t v n, đƠo t o đ c ch ng nh n phù h p v i ISO 9001

Qua 30 n m ho t đ ng, QUATEST 3 đư đ c bi t đ n nh m t đ n v hƠng đ u

t i Vi t Nam trong l nh v c cung c p d ch v k thu t v tiêu chu n, đo l ng và

ch t l ng QUATEST 3 có đ i ng chuyên viên, k thu t viên đ c đƠo t o

chuyên sâu và có nhi u kinh nghi m, h th ng phòng thí nghi m v i trang thi t b

hi n đ i theo chu n m c qu c t

V i n l c nơng cao n ng l c k thu t c a các phòng th nghi m đ đ c th a

nh n qu c t và khu v c, Phòng Th nghi m Vi sinh - GMO c a QUATEST 3 đ c các n c ASEAN ch n là phòng th nghi m đ i ch ng (ASEAN Reference

Laboratory ậ ARL) theo ch ng trình EC - ASEAN và Phòng Th nghi m i n

đ c các n c ASEAN th a nh n k t qu th nghi m đ i v i các s n ph m đi n

gia d ng theo th a thu n th a nh n l n nhau trong l nh v c th nghi m đi n vƠ đi n

t ( ASEAN EE MRA) Ngoài ra, QUATEST 3 đang tri n khai ch ng trình m

r ng s th a nh n c a khu v c và qu c t cho các l nh v c th nghi m khác

Các l nh v c ho t đ ng chính c a trung tâm:

 D ch v th nghi m

Các phòng th nghi m c a QUATEST 3 đ u đ c công nh n phù h p v i tiêu

chu n ISO/IEC 17025, phòng th nghi m th c ph m và phòng th nghi m vi

sinh-GMO c ng đ c công nh n b i t ch c công nh n c a Na Uy (Norway

- Dơy đi n b c nh a PVC, s n ph m đi n gia d ng

- Xim ng Pooc l ng các lo i, t m l p fibro-xim ng, d m bêtông c t thép ng

l c tr c PPB

- S n ph m b o h lao đ ng

 Ch ng nh n

Ho t đ ng ch ng nh n s n ph m c a QUATEST 3 đ c công nh n phù h p v i

chu n m c qu c t ISO/IEC Guide 65

QUATEST 3 là t ch c ch ng nh n (bên th ba) th c hi n vi c ch ng nh n s phù h p c a s n ph m v i tiêu chu n qu c gia, tiêu chu n qu c t ho c quy chu n

k thu t trong nhi u l nh v c: đi n - đi n t , c khí, hóa ch t, xây d ng, hàng tiêu

dùng, d u, khí, th c ph m, rau an toàn s n xu t theo quy trình VietGAP

V i đ i ng h n 40 chuyên gia t v n có nhi u n m kinh nghi m đ c đƠo t o

chuyên sâu trong n c vƠ n c ngoƠi trong l nh v c qu n lý ch t l ng, môi tr ng

vƠ an toƠn, QUATEST 3 đư cung c p d ch v t v n h th ng qu n lý cho g n 1000

t ch c, doanh nghi p và tr thành m t trong nh ng đ n v hƠng đ u trong n c v

cung c p d ch v t v n các h th ng quán lý H u h t các chuyên gia t v n c a QUATEST 3 đ u có ch ng ch chuyên gia đánh giá bên ngoƠi c a IATCA (Hi p

h i công nh n vƠ đƠo t o đánh giá viên qu c t ) ho c IRCA (t ch c ch ng nh n chuyên gia đánh giá viên qu c t ) H th ng qu n lý ch t l ng c a QUATEST 3

cho ho t đ ng t v n đ c ch ng nh n phù h p v i tiêu chu n ISO 9001

QUATEST 3 cung c p d ch v t v n cho các t ch c, doanh nghi p mu n xây

d ng và áp d ng các h th ng qu n lý: Ch t l ng - ISO 9001, Môi tr ng - ISO

14001, An toàn th c ph m - ISO 22000, An toàn thông tin - ISO/IEC 27001, Qu n

lý phòng thí nghi m - ISO/IEC 17025, An toàn s c kh e ngh nghi p - OHSAS

- Ơo t o nghi p v tiêu chu n đo l ng ch t l ng

- Ơo t o k thu t thí nghi m

- Ơo t o chuyên gia t v n

 Thông tin vƠ tiêu chu n

QUATEST 3 cung c p thông tin và các tài li u liên quan đ n tiêu chu n, đo

l ng, ch t l ng theo yêu c u cu t ch c, doanh nghi p và cá nhân:

- Các tiêu chu n Vi t Nam (TCVN)

- Các quy chu n k thu t trong n c (QCVN)

- Các tiêu chu n n c ngoƠi: JIS, GOST, BS, IS, AS, DIN, NF, ANSI, KSầ

- Các tiêu chu n qu c t : ISO, IEC, CODEX, OIMLầ

- Các tiêu chu n c a các hi p h i chuyên ngành: ASTM, AOAC, AOCS,

APHA, ASME, API, AWS,ầ

- Các t p chí ho c tài li u chuyên ngành khác

 Mư s - mư v ch

QUATEST 3 là Chi nhánh phía Nam c a T ch c GS1 Vi t Nam (mã s - mã

v ch) v i các nhi m v :

Ti p nh n các yêu c u đ ng kỦ s d ng mã s - mã v ch c a t ch c, doanh nghi p

Cung c p d ch v ki m tra ch t l ng mã s - mã v ch

T v n vƠ đƠo t o tri n khai ng d ng mã s - mã v ch, các gi i pháp nh n d ng

đi n t khác theo các tiêu chu n qu c t v qu n lỦ vƠ đi u hành s n xu t - kinh

doanh ậ d ch v , các công c h tr qu n lý chu i cung ng s n ph m và d ch v ,

truy xu t ngu n g c s n ph m

 D ch v trang b

S n xu t và cung c p chu n đo l ng, ph ng ti n đo ki m nh : chu n kh i

l ng, chu n dung tích, thi t b ki m đ nh đ ng h đo n c l nh, thi t b ki m đ nh công t đi n, cân bàn, cân ô tô

Cung c p các ch t chu n, thi t b , ph ng ti n đo ki m, thi t b và d ng c thí

Phân tích vi sinh trong th c ph m, nông s n, m ph m, n c, th c n ch n nuôi,

đ u ng, phân vi sinh, ch ph m sinh h c và các s n ph m tiêu dùng khác

Phơn tích đ nh tính vƠ đ nh l ng sinh v t bi n đ i gen (GMO) có trong các lo i

s n ph m có ngu n g c t th c v t, các lo i h t gi ng, các lo i th c n dƠnh cho gia súcầ

 Ph ng pháp th nghi m

TCVN, APHA, USFDA, BS, ISO, GS, AOAC,ầ

1.2 i c ng v Bacillus cereus và Escherichia coli

1.2.1 i c ng v Bacillus cereus

B.cereus là tr c khu n k khí, gram d ng, r ng kho ng 1 m, dài kho ng

3-4 m, có kh n ng sinh nha bƠo, bƠo t d ng hình ovan có th s ng sót khi x lý

nhi t và hóa ch t [2], chúng có kh n ng thích nghi v i m t lo t các đi u ki n môi

tr ng, nó đ c phân ph i r ng rãi trong t nhiên nh trong b i, đ t, các loài

 Là lo i vi khu n d m c trên các môi tr ng nuôi c y vi khu n thông th ng

 T ng tr ng đ c trong kho ng nhi t đ 5-500C, t i u 35-400C

 pH 4,5-9,3, thích h p pH 7-7,2

 Trên môi tr ng th ch MYP vƠ môi tr ng th ch Mossel (cereus selective

agar) vi khu n B cereus m c t o thành d ng khu n l c có màu h ng ph n chung quanh có vòng sáng

 B (order) Bacillales

 H (family) Bacillaceaem

 Chi (genius) Bacillus

 Loài (species) Cereus

 Bào t Bacillus cereus:

Bào t vi khu n là các t bƠo đ c bi t, đ c hình thƠnh đ vi khu n có th t n t i

trong đi u ki n b t l i Chúng đ c hình thành bên trong các t bào vi khu n và do

đó đ c g i là n i bào t Có nhi u lo i t bào chuyên bi t đ c hình thành t các

vi khu n đ t n t i trong các đi u ki n nghèo dinh d ng và kh c nghi t khác nhau,

nh ng n i bào t c a vi khu n là nh ng t bào có kh n ng t n t i b n v ng và dài

nh t

C u trúc c a bào t r t khác so v i c u trúc c a t bào vi khu n sinh d ng bình

th ng Bào t không ho t đ ng trao đ i ch t và có kh n ng ch ng l i đi u ki n

b t l i nh môi tr ng s ng nghèo dinh d ng, nhi t đ cao, b c x ion hóa, dung

môi hóa ch t, ch t t y r a, các enzym th y phơn, đ m th p, thay đ i pH và kháng

sinh

Hình 2: Bào t Bacillus cereus ch p d i kính hi n vi đi n t Bào t Bacillus

cereus có l p exosporium nhìn nh m t l p màng l ng l o bao xung quanh [13]

C u trúc c a bào t Bacillus cereus g m [13,14]:

 Màng exosporium: nhi u loài vi khu n, áo bào t đ c bao quanh b i m t

c u trúc màng l ng l o g i là exosporium (Hình 2) Màng exosporium r t quan

tr ng đ i v i tính k n c và tính k t dính c a bào t T lâu, đư phát hi n th y

bào t B cereus và B.anthracis có l p màng exosporium ch a các kháng nguyên quan tr ng có th phát hi n và nh n d ng; ngoài ra còn có ch a m t s enzyme,

m t s trong đó có th liên quan đ n vi c n y m m

 Áo bào t : là m t c u trúc protein ph c t p g m ba l p riêng bi t Áo bào t

b o v l p v peptidoglycan c a bào t kh i các enzyme t n công H n n a, áo bào t có liên quan đ n kh n ng ch ng b c x tia UV t môi tr ng và nhi u

lo i hóa ch t bao g m các ch t oxy hóa Tuy nhiên, áo bào t không có kh n ng

ch ng l i h p t Áo bào t có ch a các enzyme nh t đ nh, ch ng h n nh

laccases, m t enzyme có th ho t đ ng ngay c khi lõi bào t không có các ho t

đ ng trao đ i ch t Các l p bên trong c a l p áo bào t ch a m t enzyme phân

h y, giúp làm tan v bào t trong quá trình n y m m

 V bào t : là l p vách t bào khá dày g m l p peptidoglycan, r t quan tr ng

cho vi c duy trì tr ng thái m t n c và tr ng thái ti m sinh c a lõi bào t Nó

nh m t c u trúc t nh giúp duy trì tình tr ng m t n c C u trúc c th c a v

bào t đ c b o t n gi a các loài và có th đóng vai trò quan tr ng trong kh

n ng ch u nhi t c a bào t , m c dù m i t ng quan rõ ràng gi a c u trúc v bào

t và kh n ng ch u nhi t ch a đ c tìm th y Trong quá trình n y m m, các l p

v peptidoglycan nhanh chóng b phân h y b i các enzyme l p áo bào t

 Lõi bào t :ch a t bào ch t v i các thành ph n gi ng t bƠo sinh d ng, nh

protein, ribosome và DNA Tuy nhiên, tr ng thái c a t bào ch t trong lõi bào t khác xa so v i t bào ch t c a t bƠo bình sinh d ng, hàm l ng n c ch 30-

50%, còn t bƠo sinh d ng là 70-88% Tr ng thái m t n c nƠy đóng m t vai

trò quan tr ng trong tu i th , kh n ng ti m sinh và s c đ kháng c a bào t pH

trong lõi bào t là 6,3-6,5, th p h n nhi u so v i đ pH c a t bào ch t c a các t

bào sinh d ng T bào ch t c a bào t thi u h u h t các h p ch t n ng l ng

cao th ng đ c tìm th y trong t bào ch t c a các t bào sinh d ng và ch

ch a s l ng l n m t lo i protein, g i là SASP (small acid soluble proteins)

Nh ng protein này t o m t ph c h p v i các DNA c a bào t , bu c các DNA

t n t i tr ng thái nén đ c bi t, giúp b o v DNA ch ng l i nhi u lo i tác đ ng

c a môi tr ng Protein trong t bào ch t c a bào t b t đ ng và t bào ch t c a

bào t ch a m t l ng r t l n c a các ion d ng hóa tr hai, ch y u là canxi, có

th t o ph c v i Pyridine-2,6-dicarboxylic acid (dipicolinic axit ho c DPA) DPA k t h p v i lõi m t n c, đóng m t vai trò trong kh n ng ch u h p t và

kháng UV S l ng DPA trong lõi là r t cao, kho ng 5-15% c a t ng tr ng

l ng bào t

Hình 3: C u trúc bào t ch ng B cereus S69 không ho t đ ng quan sát d i kính

hi n vi đi n t [14]

Bào t c a B.cereus có kh n ng bám vƠo các t bào Caco-2 (t bào bi u mô c a

ng i) Sau khi bám vào, các bào t này n y m m m t cách nhanh chóng (trong

vòng 1h), hình thành t bào B.cereus sinh d ng trên đ nh c a các t bào bi u mô,

ti p đó lƠ s n sinh ra đ c t , n u đ c t này xu t hi n trong đ ng ru t, đ c t

đ ng ru t s t p trung khoanh vùng vùng ngo i biên c a ng ru t s t ng cao

h n vƠ vì v y gây nên m i nguy l n h n vƠ gơy b nh m t cách tr m tr ng, th i gian

b nh s lâu h n [9]

Hình 4 : BƠo t c a B.cereus ch p d i kính hi n vi 100X

Ngoài gây ng đ c th c ph m B.cereus còn gây b nh m t trong tr ng h p

viêm n i nhãn sau ch n th ng có th d n đ n m t kh n ng nhìn n u không đ c

đi u tr k p th i Vi c nhi m B.cereus c ng xu t hi n dù không đ c hi u nh ng

ng i b ung th , suy gi m mi n d ch và m t s b nh khác B.cereus c ng lƠ m t

trong nh ng nguyên nhân gây viêm vú và s y thai gia súc, và m t s b nh khác

1.2.2 i c ng v Escherichia coli [1,2]

E.coli là vi sinh v t hi u khí tùy nghi, hi n di n trong đ ng ru t c a ng i và các loƠi đ ng v t máu nóng H u h t các dòng E.coli không gây h i vƠ đóng vai trò

quan tr ng trong vi c n đ nh sinh lí đ ng ru t

Các loài E.coli hi n di n r ng rưi trong môi tr ng b ô nhi m phân hay ch t th i

h u c , phát tri n và t n t i r t lơu trong môi tr ng G n đơy ng i ta còn ch ng minh đ c r ng E.coli c ng hi n di n nh ng vùng n c m, không b ô nhi m

ch t h u c Do s phân b r ng rãi trong t nhiên nên E.coli d dàng nhi m vào

th c ph m t nguyên li u hay thông qua ngu n n c trong quá trình s n xu t hay

ch bi n Các dòng E.coli gây b nh gây ra các tri u ch ng r i lo n đ ng tiêu hóa

Bi u hi n lơm sang thay đ i t nh đ n r t n ng, có th gây ch t ng i ph thu c

vào m c đ nhi m, dòng gây nhi m và kh n ng đáp ng c a t ng ng i

Hình 5: Vi khu n Escherichia coli [15]

E.coli thu c gi ng Escherichia, h Enterobacteriaceae, là tr c khu n Gram âm,

có kích th c dài hay ng n tùy thu c môi tr ng nuôi c y Hai đ u tròn, m t s l i

b t đ ng, m t s di đ ng nh tiêm mao, không sinh bào t , t o giáp mô m ng, trong

b nh ph m có khi b t mƠu l ng c c

Nhi t đ nuôi c y thích h p là 370C, tuy nhiên có th t ng tr ng t 10 ậ 460C

M c d dàng trên Mac Conkey, EMB,ầ Trên môi tr ng EMB khu n l c có màu

tím ánh kim M t s hóa ch t c ch s phát tri n c a E.coli nh chlorine và d n

xu t, mu i m t, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,

selenite,ầ

 Tính ch t sinh hóa:

E.coli lên men nhi u lo i đ ng nh : glucose, lactose, mantose, mannitol,

xylose, glycerol, sorbitol, arabinoseầ ; không lên men dextrin và inositol, kh nitrat thƠnh nitrit phân bi t E.coli v i các vi khu n khác, ng i ta th ng dùng

th nghi m IMViC (Indole, Methyl red, Voges ậ Proskauer, Citrate)

- Indole: Trong môi tr ng có trytophane, E.coli nh có tryptophanase s ly

gi i tryptophan thƠnh Indole nh n di n Indol, nh vào vài gi t thu c th

Kovacs, h p ch t indole s t o v i thu c th h p ch t mƠu đ : Indole (+)

- Methyl red (MR): Trong môi tr ng có glucose, E.coli phân gi i glucose t o acid làm pH gi m Cho thu c th methyl red vƠo thì môi tr ng chuy n sang mƠu đ : MR (+)

- Voges ậ Proskauer(VP): tùy lo i enzyme vi khu n có đ c mà quá trình lên men glucose s cho ra s n ph m cu i dùng khác nhau M t trong s đó lƠ

acetoin, se t o ph c h p mƠu đ v i thu c th - naphthol và KOH E.coli

có ph n ng VP (-) (không có mƠu đ )

- Citrate: Trong môi tr ng Simmons Citrate, ngu n C duy nh t là citrate Vi khu n s d ng citrate s làm ki m hóa môi tr ng lƠm đ i mƠu môi tr ng

t màu xanh l c sang mƠu l E.coli có ph n ng Citrate (-) (không đ i màu)

Hình 6: K t qu th nghi m IMViC c a Escherichia coli

 V kháng nguyên, E.coli có c u trúc kháng nguyên khá ph c t p D a vào

tính ch t kháng nguyên, ng i ta phân chia các vi khu n cùng lo i thành các típ

huy t thanh khác nhau

Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên c a vách t bào, c u t o

b i lipopolysaccharide, có trên 150 lo i c tính c a kháng nguyên O là:

- Ch u nhi t, không b phân h y khi đun nóng 1000C trong 2 gi

- Kháng c n, không phân h y khi ti p xúc v i c n 50%

- B phân h y b i fomol 5%

- R t đ c, ch c n 0,05mg đ đ gi t chu t nh t trong vòng 24 gi

Kháng nguyên O g p kháng huy t thanh t ng ng s x y ra ph n ng ng ng k t

O Kháng nguyên O gi vai trò nh t đ nh đ i v i kh n ng gây b nh c a dòng vi

khu n và có tính ch t chuyên bi t cho t ng lo i v t ch

Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 lo i khác nhau, c u t o b i protein và có tính ch t không ch u nhi t, b phân h y c n 50% và các proteinase, không b phân h y b i formaol 5% Khi kháng nguyên H g p kháng th t ng ng

s x y ra hi n t ng ng ng k t H

Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có h n 100 lo i khác nhau và n m

ngoài kháng nguyên O Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein N u kháng nguyên K che ph hoàn toàn thân vi khu n thì s ng n c n ph n ng ng ng

k t O Kháng nguyên giáp mô K giúp E.coli bám vào bi u mô tr c khi xâm l n

đ ng tiêu hóa hay đ ng ti t ni u

Kháng nguyên tiên mao F (fimbrial antigen) có d ng hình s i, dài kho ng 4 mycrom, th ng hay xo n, đ ng kính 2,1 ậ 7 nm, giúp vi khu n bám vào t bào

niêm m c ru t nên r t quan tr ng trong kh n ng gơy b nh c a vi khu n

Hi n nay có h n 700 tuỦp huy t thanh c a E.coli t s t h p các nhóm kháng

nguyên O, H, K, F D a vƠo đó, ng i ta có th đ nh danh vi khu n

 c t đ ng ru t:

c t c a E.coli: lo i có giáp mô gơy đ c m nh h n lo i không có giáp mô

c t g m có hai lo i: n i đ c t và ngo i đ c t N i đ c t gây tiêu ch y,

ngo i đ c t tan huy t, phù th ngầ

Ngo i đ c t g m hai lo i: lo i ch u nhi t ST và lo i không ch u nhi t LT

D a vào h i ch ng b nh vào h i ch ng b nh và tính ch t gây b nh c a E.coli,

ng i ta chia chúng thành 5 nhóm:

- EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli k t t p ru t

- EHEC (Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây xu t huy t ru t

- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây b nh đ ng ru t

- ETEC (Enterotoxigenic E.coli) E.coli sinh đ c t ru t

- EIEC (Enteroinvasive E.coli) E.coli xâm l n niêm m c ru t

 Kh n ng gơy b nh c a E.coli:

- Nhi m khu n huy t: Khi s c đ kháng c a c th gi m, vi khu n vào máu gây nhi m khu n máu G p tr s sinh vƠ sau khi nhi m khu n đ ng ti u

- Nhi m khu n đ ng ti u: 90% tr ng h p nhi m khu n đ ng ti u l n đ u

ph n là do E.coli, v i các tri u ch ng: ti u l t nh t, ti u đau, ti u ra máu,

ti u ra m

- Viêm màng não: E.coli chi m kho ng 40% tr ng h p viêm màng não tr

s sinh, 75 % trong s đó có kháng nguyên K1

- Tiêu ch y: nh ng ch ng E.coli th ng liên uan đ n tiêu ch y thu c các nhóm

sau: EPEC, ETEC, EIEC, VTEC(Verocytotoxin ậ producing E.coli)

PH N 2: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 Th i gian vƠ đ a đi m th c hi n

Th i gian th c hi n đ tài t 05/11/2013 đ n 17/05/2014

N i l y m u và th c hi n thí nghi m: Phòng Vi sinh - GMO ậ Trung tâm k

thu t tiêu chu n đo l ng ch t l ng 3 - QUATEST 3

Cân phân tích, máy d p m u, máy đông khô, máy l c, n i h p, t c y an toàn

sinh h c, t s y, t m, b đi u nhi t, t đông sơu -400C

2.2.2 Hóa ch t vƠ môi tr ng

- Môi tr ng Plate count agar

- Môi tr ng Mannitol-egg-yolk-polymyxin (MYP agar)

- Môi tr ng th ch máu c u

- Môi tr ng Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX medium)

- Môi tr ng Trypticase (tryptic) soy broth (TSB)

2.2.3 V t li u thí nghi m

i v i ch ng Bacillus cereus: th c hi n b o qu n trên m u g o

i v i ch ng Escherichia coli: th c hi n b o qu n trên m u rau c i ng t s y

s n

2 3 Ph ng pháp th c hi n

Quy trình chung:

B c 1: L y m u và kh trùng m u

 M u g o đ c l y ng u nhiên và đ c cho vƠo các bình tam giác đ h p vô

trùng 1210C trong 15 phút Sau đó s y 600C cho đ n khi m u g o khô

Hình 6 : M u g o sau khi s y khô

 M u rau s y đ c l y ng u nhiên và do m u đư đ c s y s n nhi t đ cao

nên không c n th c hi n thêm các b c vô trùng m u

Cân vô trùng 10 g m u vào túi vô trùng, thêm 90 mL dung d ch đ m phosphate,

đ ng nh t m u b ng máy d p m u trong 20 giây Dung d ch m u thu đ c có đ

pha loãng là 10-1

Dung d ch m u đ ng nh t đ c ti p t c pha loãng thành các m t đ 10-2, 10-3

b ng cách dùng pipet vô trùng chuy n 1mL m u vào ng nghi m ch a 9 mL dung

dch đ m phosphate Tr n m u trong ng nghi m cho đ ng nh t b ng máy vortex

ho c dùng pipet hút đ o d ch m u lên xu ng 5 ậ 10 l n

 C y m u:

Chuy n 1 mL các dung d ch pha loãng vào m i đ a M i m t đ pha loãng c y hai đ a

Sau khi chuy n, đ vào m i đ a 10 ậ 15 mL môi tr ng PCA Tr n đ u d ch m u

v i môi tr ng b ng cách xoay tròn đ a petri xuôi vƠ ng c chi u kim đ ng h t

đ a trong t c y đ n khi th ch môi tr ng đông đ c L t ng c và các đ a trong t

m 350C trong 48 ± 2 gi

 c k t qu :

m t t c s khu n l c xu t hi n trên các đ a sau khi Ch n các đ a có s

khu n l c t 25 đ n 250 K t qu đ c tính theo công th c: