Bài thuyết trình phân tích vi sinh thực phẩm quy trình định lượng clostridium perfringenes

- Trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, sinhbào tử.- Tạo các khuẩn lạc màu đen trong môi trườngphân lập quy định..  Cấy một lượng mẫu thử qui định sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặcm

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Clostridium perfringenes

GVHD: Phan Thị Kim Liên Tiết 3-4, Thứ 5

Nhóm 13

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

STT Họ và tên MSSV

2 Nguyễn Hoàng Huân 2006140118

3 Huỳnh Thị Huyền Trâm 2006140352

4 Mai Thị Hoài Thu 2005140563

5 Đoàn Thị Cẩm Tú 2006140378

Danh sách nhóm

NỘI DUNG

Tình hình ngộ độc:

C Perfringenes là một trong những nguyên

nhân gây ngộ độc thực phẩm trong giống

Clostridia, chúng chiếm một vị trí khá đặc biệt

bởi đồng thời là tác nhân gây bệnh do thực

phẩm và cũng là tác nhân gây ngộ độc thực

phẩm

Trong quá trình sinh trưởng vi khuẩn C.

Perfringenes sản sinh 17 loại độc tố khác nhau

(𝛼, 𝛽, 𝜀, 𝑖, …) người ta phân chia thành 5 typ

độc tố: A,B,C,D và E

1 Tổng quan về Clostridium perfringenes (C Perfingenes)

Thời gian ủ bệnh trung bình 10-12h,

có khi chỉ cần 6-8h, nhưng không quá24h bệnh sẽ xuất hiện

Triệu chứng: đau bụng, tiêu chảy,phân lỏng hoặc toàn nước, viêm ruột, dạdày, có trường hợp nôn, nhứt đầu, sốt,…

Nguồn nhiễm: đất, phân người, thịtnguyên liệu, gia cầm, thức ăn đểnguội,…

Để phòng trúng độc do C perfringenes nên bảo quản thực phẩm

trong tủ lạnh ở 4℃ trở xuống và nênđun thức ăn nguội lại trước khi ăn

- Trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, sinhbào tử.

- Tạo các khuẩn lạc màu đen trong môi trườngphân lập quy định

- Khử nitrat thành nitrit, lên men đường glucose

và lactose

- Hóa lỏng gelatin và đông tụ sữa

- Nhiệt độ sống tối ưu 37-45℃ , pH: 5-8

- Hình que lớn giúp phân biệt với các loại khác

thuộc chi Clostridium, có vỏ kết nang và không

di động

Đặc điểm vi khuẩn C perfringenes:

-C perfringenes có thể sống sót ở

điều kiện khắc nghiệt nhờ biến đổithích nghi của hệ thồng biến dưỡng

tế bào với khả năng chịu đựng cao

và sản sinh nội bào tử

-Các chủng C perfringenes gặp

phổ biến trong đường tiêu hóa củangười nên dùng làm VSV chỉ thị vềkhả năng nhiễm phân

 Cấy một lượng mẫu thử qui định ( sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặcmột lượng huyền phù ban đầu qui định nếu sản phẩm ở dạng khác) lên bề mặtmôi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri.

 Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãngthập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

 Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằngchính môi trường này

 Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 37℃ trong khoảng 24h

 Định lượng các khuẩn lạc điển hình

 Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.perfringenes trong 1ml hoặc 1g mẫu

2 Nguyên tắc định lượng

 Thiết bị và dụng cụ:

- Cân, dao lấy mẫu, pH kế

- Bể điều nhiệt, que cấy thẳng, que cấy vòng

- Nồi triệt trùng, phiến kính, lam kính

- Tủ ấm, ống nghiệm, pipet

- Tủ cấy, hộp petri.

3 Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

Lactose-gelatin

 Môi trường và hóa chất

4 Quy trình thực hiện

Sản phẩm dạng lỏng

Sản phẩm dạng khác 10g mẫu+90mL SPW

02 đĩa

petri

02 đĩa petri

02 đĩa petri

02 đĩa petri

Đọc kết quả Clotridium perfringenes

Dịch mẫu 10 −1 Dịch mẫu 10 −1 Dịch mẫu 10 −2

Bước 3:

Cấy và ủ mẫu

Bước 4:

Đếm và chọn các khuẩn lạc

để khẳng định

5 Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

Bước 2: Pha loãng mẫu

Dd huyền phù

1mL

9mL dịch pha loãng SPW

Trộn kỹ bằng máy vortex

trong 5-10s

Dịch pha loãng

10−2

pipet

Nếu cần lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng

10−3, 10−4, 10−5, …

- Dùng pipet vô trùng chuyển 1mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 1mLhuyền phù ban đầu đối với sản phẩm khác cho vào đĩa petri.

- Lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếptheo (nếu cần)

- Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri

- Rót vào mỗi đĩa 10-15mL môi trường TSC, trộn đều bằng cáchxoay nhẹ từng đĩa

- Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kính thêm một lớp dày10mL của cùng loại môi trường TSC

- Để cho đông đặc lại

- Lật úp đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37℃ trong 24h

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

 Đếm khuẩn lạc:

- Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới

150 sau 24h nuôi cấy.

- Khuẩn lạc C perfringenes điển

hình có màu đen trên môi trường

TSC.

- Đếm khuẩn lạc C perfringenes

trên những đĩa có số đếm phù hợp.

Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn một trong hai kỹ thuật sau:

• Kiểm tra các ống nghiệm chứa môi trường LS về sự sinhkhí và có xuất hiện kết tủa màu đen được gọi là dương tính

• Tính di động là bằng chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách

xa đường cấy đâm sâu.

• Kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách thêm 0,2-0,5mL thuốc thử phát triển nitrit vào từng ống môi trường nitrit để kiểm tra sự có mặt của nitrit.

• Tương tự cấy từng khuẩn lạc chọn lọc đã chọn ở trên sang môi trường lactose-gelatin, ủ ở 37℃ trong 24h trong điều kiện kỵ khí.

• Kiểm tra ống nghiệm về việc sinh khí và có sự xuất hiện màu vàng cho thấy sự lên men lactoza.

• Làm lạnh các ống 1h ở 5℃ để kiểm tra sự hóa lỏng gelatin, nếu môi trường đông đặc thì ủ lại thêm 24h và kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin.

 Đối với kỹ thuật 1: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trênmôi trường thạch TSC và được khẳng định dương tính với môi trường LS

được coi là C perfingenes.

 Đối với kỹ thuật 2: các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trongmôi trường TSC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh

acid và sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelatin được gọi là C perfringenes.

Kết quả:

X= 𝐶1∗𝑅1 + 𝐶2∗𝑅2 + 𝐶3∗𝑅3 +(𝐶4∗𝑅4)

Trong đó:

- C1,2,3,4: số khuẩn lạc C perfringenes đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai nồng

độ pha loãng liên tiếp.

- V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa (ml)

- 𝑛1: số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

- 𝑛2: số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại.

- d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.

- R1,2,3,4: tỷ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai nồng độ pha loãng liên tiếp.

Clostridium perfringenes trong 1g/1mL mẫu (X) được tính

theo công thức:

6 Ví dụ: