báo cáo thực hành môn vi sinh

Giống Monococcus Đơn cầu Thường đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số chúng thuộc loại hoại sinh.. Bài 2 : PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT*NGUYÊN TẮC: Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN : VI SINH CĂN BẢN

MÃ MÔN HỌC : MIB 251

Giáo viên hướng dẫn :Lê Thị Mai Lớp môn học :MIB251F2

Nhóm trưởng : - Phan Văn Sĩ Thành viên : - Văn Bá Bình Nguyên

- Nguyễn Thị Thương Thương

- Nguyễn Thị Tình

- Nguyễn Thị Ngọc

Đà Nẵng,tháng 5, năm 2015

Bài 1 CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN.

Theo hình thái bề ngoài,vi khuẩn thường được chia thành 3 loại hình thể chính: cầu khuẩn,trực khuẩn và xoắn khuẩn

1 Cầu khuẩn :(Coccus - từ tiếng Hy Lạp Kokkos - hạt quả): là loại vi khuẩn có hình

cầu Nhưng có nhiều loại không hẳn hình cầu thí dụ như hình ngọn nến như phế cầu khuẩn - Diplococcus pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae).Kích thước của vi khuẩn thường thay đổi trong khoảng 0,5x1,2µm (1 = 10-3 mm) Tuỳ theo từng loài mà chúng có những dạng khác nhau

Đặc tính chung của cầu khuẩn:

- Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau

- Có nhiều loài có khả năng gây bệnh cho người và gia súc

- Không có cơ quan di động

- Không tạo thành bào tử

a Giống Monococcus (Đơn cầu)

Thường đứng riêng lẻ từng tế bào một, đa số chúng thuộc loại hoại sinh Thường thấy chúng sống trong đất, nước và trong không khí (Thí dụ như Micrococcus agilis, M roseus, M luteus)

b Giống Diplococcus (song cầu) :(Từ tiếng Hy Lạp - Diplos - thành đôi) phân cách

theo một mặt phẳng xác định và dính nhau thành từng đôi một Trong số này có một số có khả năng gây bệnh như giống Neisseria - Lậu cầu khuẩn N meningitidis gonorrhoeae - Não mô cầu khuẩn)

c Giống Tetracoccus (Tứ cầu):

Thường liên kết với nhau thành từng nhóm 4 tế bào một Chúng thường gây bệnh cho người và một số có thể gây bệnh cho động vật

d Giống Streptococcus(Liên cầu)

Từ tiếng Hy Lạp (Streptos - chuỗi) chúng phân cách theo một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành từng chuỗi một dài Thí dụ như Streptococcus lactic Strep-pyogenes

e Giống Sarcina

Từ tiếng Hy Lạp Saricio - gói hàng Phân cách theo 3 mặt phẳng trực giao với nhau, tạo thành những khối từ 8 - 16 tế bào (hoặc nhiều hơn nữa) Trong không khí chúng ta

thường gặp một số loài như Sarcinalutea, Sarcina auratiaca Chúng thường nhiễm vào các môi trường để trong phòng thí nghiệm và tạo thành màu vàng

f Giống Staphilococcus (Tụ cầu)

Từ tiếng Hy Lạp Staphile - chùm nho Thường chúng liên kết với nhau thành những đám trông như chùm nho Chúng phân cách theo một mặt phẳng bất kỳ và sau đó dính lại với nhau thành từng đám như hình chùm nho Bên cạnh các loài hoại sinh còn có một số loài gây bệnh ở người và động vật (Staph Curcreus, Staph Emidermidis )

2 Trực khuẩn : Là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que Kích thước của

chúng thường từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 m

Thường gặp các loài trực khuẩn sau đây:

a Bacillus (Viết tắt là Bac)

trực khuẩn gram dương, sinh bào tử Chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào Vì thế khi tạo thành bào tử tế bào không thay đổi hình dạng chúng thường thuộc loài hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc

b Bacterium (viết tắt là Bact)

Trực khuẩn gram âm không sinh bào tử Thường có tiên mao mọc xung quanh tế bào người ta gọi là chu mao Các giống Salmonella, Shigella, Erwina, Serratia đều có hình thái giống Bacterium

c Pseudomonas (viết tắt là Ps)

Trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có một tiên mao (hoặc một chùm tiên mao) ở một đầu Chúng thường sinh ra sắc tố Các giống Xanthomonas Photobacterium,

Azotomonas, Aeromonas, Zymononas, Protaminobacter, Alginomonas, Mycoplazma, Halobacterium, Methanomonas, Hydroginomonas, Carloxydomonas, Acetobater,

Nitrosomonas, Nitrobacter đều có hình thái giống Pseudomonas

d Corynebacterium

Không sinh bào tử, hình dạng và kích thước thay đổi khá nhiều Khi nhuộm màu tế bào thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau Trực khuẩn bạch cầu

(Corynebacterium diphtheriae) có bắt màu ở hai đầu làm tế bào có hình dạng giống quả

tạ Một số khác có hình thái giống Corynebacterium gồm có Listeria, Erysipelothric, Microbacterium, Cellulomonas, Arthrobacter

e Clostridium (Viết tắt là Cl, tiếng Hy Lạp Kloster - con thoi)

Thường là trực khuẩn gram dương Kích thước thường vào khoảng 0,4 - 1 x3- 8

Sinh bào tử, chiều ngang của bào tử thường lớn hơn chiều ngang của tế bào, do đó làm tế bào có hình thoi hay hình dùi trống

Chúng thường thuộc loại kỵ khí bắt buộc, có nhiều loài có ích Thí dụ như các loài cố định nitơ Một số loài khác gây bệnh Thí dụ vi khuẩn uốn ván Cl Botulium

3 Vi khuẩn hình xoắn: gồm 3 dạng sau :

a Phẩy khuẩn: Là tên chung chỉ các vi khuẩn hình que uốn cong giống như dấu

phẩy Giống điển hình là giống Vibro (Từ chữ La tinh Vibrare - dao động nhanh) Một số giống phẩy khuẩn có khả năng phân giải xenluloza (Cellvibrio,

Cellfalcicula) hoặc có khả năng khử sunfat (Desulfovibrio)

b Xoắn khuẩn:Gồm các vi khuẩn dài,mảnh,có nhiều vòng xoắn.Một số có khả năng

gây bệnh cho người như xoắn khuẩn giang mai(Treponema pallidum),xoắn khuẩn Leptospira,xoắn khuẩn hồi quy(Borrelia)

c Spirillum - Từ chữ Spira - Hình cong, xoắn gồm tất cả các vi khuẩn có hai vòng

xoắn trở lên Là loại gram dương, di động được nhờ có một hay nhiều tiên mao mọc ở đỉnh

Đa số chúng thuộc loại hoại sinh, một số rất ít có khả năng gây bệnh (SP Minus) có kích thước thay đổi 0,5 - 3,0 - 5 - 40

Hình ảnh quan sát thực nghiệm :Mẫu lấy từ các mảng bám trên răng

Bài 2 : PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT

*NGUYÊN TẮC:

Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm

*MỤC ĐÍCH

 Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi sinh vật được dễ dàng

 Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc bắt màu khác nhau đối với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật

*PHÂN LOẠI

Ở bài này sẽ tìm hiểu phương pháp nhuộm đơn và nhuộm Gram thuộc phương pháp nhuộm cố định.

A DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

Các dung dịch nhuộm gồm:

 Dung dịch xanh methylene

 Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet )

 Dung dịch lugol

 Dung dịch tẩy màu

 Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin )

B CÁCH LÀM TIÊU BẢN

1 Cách lấy vi sinh vật để làm tiêu bản:

Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng phải thực hiện các thao tác lấy mẫu vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản Các thao tác đó như sau:

- Đốt đèn cồn

- Đặt ống nghiệm mẫu hay đĩa Petri có vi sinh vật vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra Ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không

Nhuộm màu vi sinh

vật Nhuộm không cố định Nhuộm cố định

Nhuộm đơn Nhuộm kép

Nhuộm tiên mao Nhuộm bào tử

Nhuộm Ziehl -Neelsen Nhuộm Gram

được để canh trường vi sinh vật chạm vào nút bông đối với ống nghiệm

- Tay phải dùng que cấy và vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn Để que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ

từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa

- Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút bông 1

vòng và kéo nút ra Giữ nguyên nút bông như vậy cho đến khi đậy nút vào

- Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn

- Khéo léo đưa que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy mẫu và nhẹ nhàng

đưa que cấy ra

+ Nếu ống mẫu là môi trường lỏng chỉ cần nhúng đầu que cấy vào

canh trường rồi rút ra

+ Nếu ống giống là môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh

khối vi sinh vật trên mặt thạch(nếu quan sát một loại vi khuẩn thì nên lấy trong một khuẩn lạc) và hoà đều vào giọt nước cất vô trùng trên phiến kính Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy mẫu mà không cầy mặt thạch lên

- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm nghiệm lại và để

ống vào giá

- Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt vào

giữa phiến kính để làm vết bôi

- Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn rồi cất vào giá

2 Làm vết bôi:

Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử

trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra Trường hợp nuôi cấy trên môi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu Hơ khô phiến kính đã có vi sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi

Chú ý:

- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải

- Vết bôi tròn, gọn, thật mỏng

- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát

Cố định vết bôi:

- Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:

+ Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi sinh vật gây bệnh)

+ Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm không bị rửa trôi

- Các cách cố định:

+ Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của

phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh

không để tiêu bản quá nóng

+ Cố định bằng hoá chất:

* Nhúng vết bôi vào cồn 95o khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô

* Ngâm trong axeton 5 phút

* Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây

C PHƯƠNG PHÁP NHUỘM:

1 Phương pháp nhuộm đơn:

Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là:

- Fuchsin kiềm

- Xanh metylen

- Tím gentian

- Đỏ trung tính

Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc nhuộm phủ kín vết bôi Sau 1 – 2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa là được Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm Khi tiêu bản khô hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi

2 Phương pháp nhuộm Gram:

Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch Christian Gram

và những người cộng tác đưa ra năm 1884 Với cách nhuộm này ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G+) và Gram âm (G-)

Vi sinh vật bắt màu xanh tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn) Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô cầu khuẩn,các vi khuẩn đường ruột…)

a Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào

với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:

- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không

bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương

- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm

b Cách tiến hành:

D Kết quả thí nghiệm quan sát vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram đối với 3 chủng vi khuẩn mẫu:

Ecoli,Bacillus,Pseudomonas.

a Chủng E.coli bắt màu Gram âm

Vết bôi

Phủ tím kết tinh ( Crystal violet )

15

Mẫu đã nhuộm Rửa nước

Rửa nước Tẩy cồn Rửa nước Phủ lugol

Rửa nước

1phút

1phút

15

15

15 Phủ safranin hoặc

Fuchsin

1phút

15

b Chủng Bacillus bắt màu Gram dương (không rõ lắm do vi khuẩn còn non)

c Chủng Pseudomonas bắt màu Gram âm:

Bài 3 : PHẢN ỨNG SINH HÓA

MỤC TIÊU:

Nắm được mục đích khảo sát những tính chất sinh hóa của vi khuẩn

Trình bày được nguyên tắc của những phản ứng sinh hóa thông thường.

Quan sát các phản ứng sinh hóa và nhận xét kết quả

THỰC HÀNH:

Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có chứa Nitơ

Phản ứng Indol:

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indole, Skatole (methyl indole) và indole-acetate.Một số vi khuẩn như Ecoli có enzyme

Tryptophanase chuyển Tryptophan thành Indol

Môi trường: Tryptophan hoặc peptone broth.Ta nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường nước pepton không chứa đường trong 24-48h trong tủ ủ 37oC

Thuốc thử: Kovacs’s

Kết quả :

– Dương tính: xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường sau 5 phút

– Âm tính: màu vàng (màu của thuốc thử Kovacs’s)

Khả năng tạo thành H2S :

Nguyên tắc : Nhiều vi khuẩn sử dụng những hợp chất chứa Sodium thiosunfuate thì có thể tạo thành H2S

Môi trường : Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri

Kết quả :Dương tính khi làm cho môi trường thạch thành màu đen

Phản ứng phân giải Urê :

Nguyên tắc:

Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt urea thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vật và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra

Môi trường: Urea broth (hoặc Urea agar)

Kết quả :

– Dương tính: môi trường có màu hồng

– Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)

Môi trường MR-VP Chủng vi sinh vật

Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màu vàng: (âm tính)

Những phản ứng liên quan tới nguồn thức ăn có Carbon :

Khả năng lên men đường:

Phản ứng MR (methyl red)

Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose

Methyl Red

24h,

37 o C

Chủng

Vi Sinh Vật

Môi Trường

2-4 ngày

Dương tính Âm tính

Cơ chế:

Cơ sở sinh hóa:

Chất chỉ thị pH: methyl red

MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid

MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính

 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose qua quá trình đường phân tạo thành acid pyruvic, rồi từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme A, đi qua chu trình Kreps tạo ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid malic, a cid

oxalic… hoặc từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acid fomic,…

Trong môi trường MR-VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn định PH, khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn công và phá vỡ thế PH ổn định làm cho PH giảm mạnh, PH<4.3, Với sự có mặt của thuốc thử MR (Methyl Red) sẽ làm môi trường chuyển sang màu đỏ (Phản ứng dương tính)

Ý nghĩa: Định danh một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose (thường là gram -)