BÁO cáo THỰC HÀNH môn THỰC HÀNH VI SINH y học

Các bước thực hiện - Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy mẫu vi khuẩn - Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần que còn nóng sẽ làm chết vi khuẩn rồi lấy mẫu vi khuẩn vừa đủ - Ria

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÔNG Á



MÔN: THỰC HÀNH VI SINH Y HỌC

Nhóm 2

Phân nhóm 8

Thành viên: 1) Cao Ngọc Tuấn

2) Trần Thị Khánh Tường 3) Huỳnh Thị Vi

Đà Nẵng , ngày 21 tháng 03 năm 2022

BÁO CÁO THỰC HÀNH

I Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria?

1 Mục đích thực hiện :

- Phân lập vi khuẩn

2 Hóa chất, dụng cụ :

- Hoá chất:

+ Môi trường BHI

+ Mẫu vi khuẩn

- Dụng cụ:

+ Đèn cồn

+ Que cấy vòng

+ Bật lửa

+ Đĩa thạch

3 Các bước thực hiện

- Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy mẫu vi khuẩn

- Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que còn nóng sẽ làm chết vi khuẩn) rồi lấy mẫu vi khuẩn vừa đủ

- Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch (ria sát nhau), sau đó đốt que cấy

- Xoay đĩa, ria lần 2 thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng lên 1 nửa đường ria cuối của đường thứ nhất

- Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối của đường thứ 2

- Đốt que cấy

4 K ết quả

- 3 đĩa 1, 2, 3 chỉ tách được vi khuẩn ở đường số 1, không tách được ở số 2 và 3

- Đĩa 3 có hiện tượng lạ, mặc dù không tách được vi khuẩn đường số 2, 3 nhưng lại xuất hiện 1 nhóm vi khuẩn lan rộng

Hình 1: kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria.

5 Phân tích kết quả

- Ở 3 đĩa trên, khi thực hiện thao tác ria mẫu vi khuẩn, ở đường thứ 2 đã không chạm đường cấy thứ 1 dẫn đến việc đường cấy thứ 2 và 3 không xuất hiện vi khuẩn nên không cấy tách được khuẩn lạc đơn

- Đặc biệt ở đĩa thứ 3, mặc dù đường thứ 2 và 3 đều không cấy được vi khuẩn nhưng trong quá trình làm, vì sai sót làm rơi khuẩn trên thạch nên dẫn đến hiện tượng như trong ảnh

 Kết luận: cả 3 đĩa không đạt yêu cầu

II Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy truyền ?

1 Mục đích thực hiện: Khảo sát sinh hóa các vi sinh vật ban đầu

sau quá trình truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, bảo quản, nhân giống

2 Hóa chất, dụng cụ

- Hoá chất:

+ Vi khuẩn E coli

+Đĩa petri chứa thạch có môi trường BHIA

- Dụng cụ:

+ Que cấy vòng

+ Đĩa petri vô khuẩn

+ Đèn cồn

+ Găng tay cao su

3 Các bước thực hiện

- Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy mẫu vi khuẩn

- Đợi 1-2 phút cho que cấy nguội dần (que còn nóng sẽ làm chết vi khuẩn) rồi lấy khuẩn lạc đã được tăng sinh trong môi trường BHI lượng vừa đủ

- Ria ngang que hết 1/3 đĩa thạch, sau đó đốt que cấy

- Xoay đĩa, ria lần 2 thẳng góc với đường ria thứ nhất, chồng lên 1 nửa đường ria cuối của đường thứ nhất

- Xoay đĩa lần cuối, ria ngang chồng lên ½ đường rìa cuối của đường thứ 2

- Đốt đỏ que cấy

4 Kết quả

Hình 2: Kết quả phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy truyền.

5 Phân tích kết quả

- Cả 2 đĩa đều không đạt yêu cầu

- Ở đĩa của Vi cấy: lượng vi khuẩn dày đặc do lấy lượng vi

khuẩn mẫu ra quá nhiều Đường cấy số 1 hết nửa đĩa, vi

khuẩn không tách được

- Đĩa Tường cấy: Đường cấy số 1 tương đối đạt yêu cầu, tuy

nhiên đường cấy thứ 2, thứ 3 không thấy rõ

III Kết quả thử nghiệm môi trường MR-VP, SIM, simmon citrat:

1 Mục đích thực hiện

- Thử nghiệm MR-VP khảo sát khả năng lên men sinh acetoin của vi khuẩn

- Thử nghiệm khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn

- Thử ngiệm SIM: khảo sát tính di động của vi khuẩn

2 Hóa chất, dụng cụ

- Hóa chất: Môi trường: MR-VP, simmon citrate agar ,SIM; vi khuẩn E.coli đã được

phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria

- Dụng cụ: đèn cồn, găng tay y tế, que cấy thẳng, que cấy vòng.

3 Các bước thực hiện

- Thử nghiệm MR-VP:

 Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn là kết quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn

 Bỏ vi khuẩn vào môi trường MR-VP sau đó lắc đều cho vi khuẩn tan ra

 Đốt đỏ que cấy

 Đợi 20 phút sau đó nhận xét

- Thử nghiệm Simmon citrate agar:

 Đốt que cấy vòng, làm nguội, dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn là kết quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn

 Cấy vi khuẩn vào môi trường simmon citratte agar lên mặt của môi trường theo đường zig-zag

 Đốt đỏ que cấy

 Đem ủ ở nhiệt độ 37 tròng vòng 24h.℃ tròng vòng 24h

- Thử nghiệm SIM:

 Đốt que cấy thẳng, làm nguội, dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn là kết quả thu được từ phương pháp phân lập vi khuẩn

 Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào khối giữa thạch tròn và rút que cấy ra theo đường cấy thẳng để tránh làm rách thạch

 Đốt đỏ que cấy

 Đem ủ ở nhiệt độ 37 tròng vòng 24h.℃ tròng vòng 24h

4 Kết quả

Hình 3: Kết quả thử ngiệm môi trường Simmon citrat, SIM và MR-VP

5 Phân tích kết quả

A Môi trường MR - VP:

- Nếu vi khuẩn phản ứng dương tính (+) thì bề mặt môi trường sẽ chuyển sang màu nâu đỏ, phản ứng âm tính (-) thì bề mặt môi trường sẽ không thay đổi màu

- Từ hình ảnh của nhóm, có thể thấy môi trường VP không bị thay đổi màu

Kết luận: Phản ứng âm tính (-) Cho thấy vi khuẩn E.coli không sinh acetoin trong quá trình lên men đường glucose

B Môi trường Simmon citrat agar:

- Theo lí thuyết nếu vi khuẩn phản ứng dương tính thì môi trường sẽ chuyển sang màu xanh lam( xanh dương), phản ứng âm tính thì môi trường sẽ không thay đổi màu( giữ nguyên màu xanh rêu cũ)

- Từ ảnh của nhóm thì ở môi trường này không bị thay đổi màu chứng tỏ vi khuẩn E.coli không phản ứng với môi trường Simmon citrat agar

Kết luận: phản ứng âm tính, vi khuẩn E.coli không sử dụng citrat như nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn

C Môi trường SIM

- Trên môi trường sim ta có thể khảo sát khả năng di động của vi khuẩn

- Theo lý thuyết nếu vi khuẩn phản ứng dương tính thì các vi khuẩn sẽ di chuyển về 2 phía, phản ứng âm tính thì vi khuẩn sẽ ở im tại chỗ

- Từ hình ảnh, ta có thể thấy vi khuẩn E.coli di chuyển về 2 phía (dương tính) Đúng với lí thuyết đưa ra

Kết luận: phản ứng dương tính, nhóm thực hiện đúng thao tác và kết quả theo lý thuyết

IV Kết quả thử nghiệm môi trường KIA

1 Mục đích thực hiện

Môi trường KIA cùng lúc phát hiện khả năng sử dụng đường (glucose,

lactose) và khả năng sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh và sinh gas

2 Hoá chất và dụng cụ:

- Đèn cồn, bật lửa, que cấy nhọn, khuẩn lạc

3 Các bước thực hiện.

- Vi khuẩn khảo sát được cấy 2 lần

+ Lần 1: Dùng que cấy vòng cấy trên mặt lớp thạch nghiêng theo

đường zigzac

+ Lần 2: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào giữa khối thạch tròn

đường cấy thẳng và rút que cấy ra theo đường cấy thẳng để tránh làm

rách thạch

4 Kết quả:

- Theo lý thuyết kết quả gồm 3 phần:

+ Phần thạch trong: đọc phản ứng sử dụng glucose: + màu vàng,

-màu đỏ, sự sinh ga nếu có sự nứt thạch

+ Phần thạch nghiêng: Đọc phản ứng sử dụn lactose: + màu vàng,

-màu đỏ

+ Vùng tiếp giáp giữa hai phần: Đọc phản ứng sinh H2S, nếu

dương tính có màu đen

- Lọ 1,2,4,5 có sự sinh ga và lọ 1,2,3,4,5 có sử dường glucose và

lactose

Hình 4: Kết quả thử nghiệm môi trường KIA

5 Phân tích kết quả

- Phần thạch nghiêng: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng lactose

- Vùng thạch tròn: bắt màu vàng (+) → phản ứng có sử dụng glucose

- Vùng tiếp giáp giữa 2 phần: không có màu đen (-) → không sinh ra H2S

- Cả 5 ống ta đều có có hiện tượng nứt thạch, chứng tỏ có sự sinh gas xảy ra

- Ở vùng thạch nghiêng, vi khuẩn đang mọc lên theo đường cấy và thấy được sự di động của vi khuẩn Tuy nhiên đường cấy ziczac hơi sát nhau dẫn đến vi khuẩn

- Vùng thạch tròn ta không thấy được khi khuẩn mọc lan ra, nguyên nhân có thể là thao tác cấy chưa đúng hoặc là thời gian ta đem đi ủ chưa đủ để vi khuẩn có thể di động mọc lan ra

V Kết quả phân tích định lượng

1. Mục đích thực hiện : Xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu là pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó

2 Hóa chất, dụng cụ :

- Mẫu vi khuẩn

- Ống nghiệm

- Micropipette

- Dung dịch NaCl 0,9%

- Đèn cồn

- Đầu tuýp gắn với micropipette

- Đĩa petri thạch trong môi trường BHA

- Que bông vô khuẩn.

- Que cấy vi sinh

3 Các bước thực hiện

- Dùng micropipet hút 9 ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% lần lượt vào 7 ống nghiệm (1)

- Tiến hành pha loãng mẫu: dùng micropipet cho vào hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch muối sinh lý ở trên rồi lắc đều, ta có được dung dịch có nồng

độ 10-1

- Sau đó lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống 9ml nước muối sinh lý ở ống nghiệm

đã chuẩn bị ở (1) sẽ thu được ống nghiệm thứ 2 có nồng độ 10-2 Tiếp tục lấy 1ml dung dịch 10-2 cho vào dung dịch nước muối sinh lý 0,9% ở ống nghiệm thứ 3 ta thu được dung dịch có nồng độ 10-3, làm tương tự cho đến ống nghiệm thứ 7 thì ta thu được dung dịch có nồng độ 10-7

- Sau khi pha xong, dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch có nồng độ 10-1 cho vào đĩa petri đựng thạch trong môi trường BHA rồi dùng que bông vô khuẩn trải đều khắp mặt thạch và quét 1 vòng quanh đĩa thạch Cứ như thế cho đến khi xong hết 7 đĩa với đĩa cuối cùng là dung dịch có nồng độ 10-7 Cuối cùng đem ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 24h

4 Kết quả

- Đếm được 34 khuẩn lạc trên đĩa petri ở đĩa số 7

 Số lượng tế bào trong dung dịch: Áp dụng công thức:

n 1 Vf 1+…+niVf 1

1 ×0,1 ×10−7 = 34×108 Với: A: tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu

N: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

Fi: độ pha loãng tương ứng

5 Phân tích kết quả

Hình5: Kết quả phân tích định lượng.

VI Kết quả kháng sinh đồ, MIC

1 Mục đích thực hiện

- Dùng để xác định mức độ nhạy cảm của kháng sinh thử nghiệm đối với vi khuẩn

gây bệnh, cũng có nghĩa là phát hiện sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thử nghiệm Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu

2 Hóa chất, dụng cụ

- Hóa chất: Đĩa thạch đã có môi trường MHA, vi khuẩn E.coli đã được phân lập vi

khuẩn bằng phương pháp cấy ria, nước muối sinh lý, 12 giấy kháng sinh khác nhau

- Dụng cụ: Đèn cồn, găng tay y tế, ống ngiệm có nút bông, que cấy vô khuẩn, pipet

nhựa

3 Các bước thực hiện

B

ư ớc 1 : Pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý đến độ đục chuẩn 0.5 McFarland

(1-3.108 vi khuẩn/ml) B

ư ớc 2 : Trải vi khuẩn: dùng que bông vô trùng thấm dung dịch chuẩn đã được pha

loãng 0,5 McFarland, xoay que trên thành ông ngiệm để ép cho ráo nước, rồi trải lên mặt đĩa thạch thật đều và kín Khi trải được ½ hộp, xoay 60° và trải lần 2, xoay hộp 60° và trải lần 3 Cuối cùng dùng que bông quét 1 vòng xung quanh, sát hộp thạch

B

ư ớc 3 : Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở nhiệt độ 37 trong quá trình 15℃ tròng vòng 24h

phút

B

ư ớc 4 : Đặt kháng sinh: dùng kẹp được tiệt khuẩn (đốt trên ngọn lửa đèn cồn, làm

nguội), kẹp khoanh giấy rồi đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, 1 đĩa thạch được đặt 3 loại kháng sinh khác nhau sao cho khoảng cách giữa 3 kháng sinh đều nhất trên đĩa thạch Các kháng sinh cách nhau tối thiểu 2,5

cm và cách thành hộp tối thiểu 2cm, không được xê dịch các kháng sinh sau khi đặt Chỉ được phép đặt khi bề mặt đĩa thạch đã khô

B

ư ớc 5 : Ủ ở nhiệt độ 37 trong 24h℃ tròng vòng 24h

4 Kết quả

Hình 6: Kháng sinh đồ, MIC

5 Phân tích kết quả

Kết quả thưc hiện kỹ thuật kháng sinh đồ: Trong quá trình thao tác trải đĩa vi khuẩn E coli chưa được trải đều ra nên sản phẩm trên đĩa có những đường vệt dài, nhưng vẫn có thể đo đường kính vòng vô khuẩn được Các giấy kháng sinh được trải đều và cách nhau, dễ nhìn và có thể dễ dàng đo được đường kính vòng vô khuẩn

- Do có sự nhầm lẫn dẫn đến thất lạc 1 đĩa MHI, nên nhóm 8 thí nghiệm thiếu 3

kháng sinh là Cefoxitin, Colistin, Tobramycin với yêu cầu bài và các nhóm thực hành khác

Số đĩa thí

nghiệm

Kí hiệu Tên kháng sinh Đường kính

đo được (mm)

Phổ chuẩn (mm)

Mức độ

Đĩa 1

Đĩa 2

Đĩa 3