Đồ án phân tích thực phẩm sản phầm mì ăn liền

TỔNG QUAN VỀ MÌ ĂN LIỀN

Lịch sử ra đời

Mì sợi lần đầu tiên xuất hiện ở Trung Quốc vào triều đại nhà Hán vào năm 206 trước công nguyên, và từ đó, sản xuất mì sợi đã lan rộng ra khắp các nước Châu Á Vào thế kỷ 13, Marco Polo du hành đến Trung Quốc và mang theo kỹ thuật sản xuất mì về Châu Âu, nơi món mì sợi được biến đổi thành mì ống.

Từ cuối thế kỉ 18, mì sợi đã được sản xuất và trở nên phổ biến ở Châu Âu, đặc biệt là tại Ý và Pháp, trước khi du nhập vào Châu Á Để tiết kiệm thời gian chế biến, Nhật Bản đã phát triển công nghệ sản xuất mì ăn liền, một sản phẩm không ngừng cải tiến về chất lượng và sản lượng Ông Momofuku Ando, người Nhật, là nhà phát minh ra mì ăn liền và đã thành lập công ty Nissin, giới thiệu sản phẩm đầu tiên mang tên “Chicken Ramen” vào năm 1958 Ý tưởng của ông xuất phát từ việc chứng kiến cảnh người dân xếp hàng trong đêm lạnh để mua mì tươi sau Thế chiến thứ II.

Vào năm 1971, Công ty Nissin đã giới thiệu mì ăn liền tô ra thị trường và bắt đầu sản xuất thương mại Sản phẩm này được chế biến chín trước, chỉ cần trụng trong nước sôi từ 3 – 5 phút để sử dụng Nhờ vào sự tiện lợi và nhu cầu bận rộn, mì ăn liền nhanh chóng trở thành món ăn ưa chuộng tại Nhật Bản và lan rộng ra nhiều quốc gia khác trên thế giới.

Tình hình phát triển

Kể từ đó, mì ăn liền đã liên tục được cải tiến về cả sản lượng lẫn chất lượng Công nghệ sản xuất mì ăn liền cũng luôn được nâng cao để đáp ứng nhu cầu thị trường.

Mì ăn liền hiện nay được tiêu thụ rộng rãi trên toàn cầu, với tổng lượng tiêu thụ đạt 70 tỷ gói vào năm 2004 Châu Á là thị trường tiêu thụ lớn nhất, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 44,3 tỷ gói mì, tiếp theo là Indonesia với 12,4 tỷ gói và Nhật Bản với 5,4 tỷ gói vào năm 2005.

Hiện nay, mì ăn liền đã trở thành sản phẩm phổ biến tại Việt Nam nhờ tính tiện dụng và giá trị dinh dưỡng cao Ngành công nghệ mì ăn liền đang phát triển mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu lớn của thị trường, đặc biệt trong bối cảnh nền kinh tế chuyển sang cơ chế thị trường Các công ty quốc doanh và liên doanh như MILIKET, COLUSA, VIFON, A-ONE và VINA ACECOOK không ngừng nâng cao sản lượng, chất lượng và đa dạng hóa sản phẩm để phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng.

Theo số liệu thống kê không chính thức năm 2008, Việt Nam có hơn 50 doanh nghiệp sản xuất mì ăn liền với sản lượng đạt khoảng 5 tỷ gói mỗi năm và tốc độ tăng trưởng bình quân từ 15% đến 20% Đến năm 2012, mức tiêu thụ mì ăn liền trên thị trường đạt 5,1 tỷ gói Hiện nay, mì ăn liền đã trở thành một sản phẩm phổ biến trong đời sống của người dân Việt Nam, từ khu vực thành thị đến nông thôn.

Mì ăn liền thế giới, Việt Nam là quốc gia đứng thứ tư thế gới về tiêu thụ mì gói.

Giá trị dinh dưỡng và tính tiện dụng của mì ăn liền

Sản phẩm mì ăn liền được sự ưa chuộng của người tiêu dùng vì nó có các ưu điểm nổi bật sau:

Mì ăn liền là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, được chế biến từ bột mì, nguồn tinh bột tốt, cùng với các phụ gia giàu protein, lipid, vitamin và khoáng chất Sản phẩm này cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cơ bản, với trung bình 100 gam mì cung cấp 359 calo.

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của mì sợi

Nước Protein Lipid Glucid Cenllulose Tro

Bảng1.2 Hàm lượng vitamin và khoáng trong mì ăn liền (mg/100g)

 Tính tiện dụng của mì ăn liền:

 Quá trình vận chuyển nhanh, gọn.

 Quá trình bảo quản tương đối đơn giản.

 Dễ sử dụng, dễ chế biến: chỉ cần cắt bao gói, cho nước sôi vào chờ khoảng 3 -5 phút là có thể ăn được.

 Mì sợi có độ tiêu hóa cao.

Tổn thất chất khô trong quá trình nấu chín mì thường chỉ khoảng 4 – 7% Sản phẩm mì có thể được điều chỉnh theo khẩu vị riêng của từng loại nhờ vào các phụ gia được thêm vào.

Mì ăn liền tại Việt Nam có giá thành rất phải chăng, dao động từ 1.000 đến 3.000 đồng mỗi gói, tùy thuộc vào loại sản phẩm Ngay cả những sản phẩm cao cấp cũng chỉ có giá từ 7.000 đến 10.000 đồng mỗi gói, giúp chúng phù hợp với mọi đối tượng, đặc biệt là người lao động và sinh viên.

Phân loại và đặc điểm chung

Dựa trên phương pháp chế biến, mì ăn liền được được chia làm hai loại:

 Mì ăn liền có chiên

Mì ăn liền không chiên là loại mì được sản xuất bằng phương pháp sấy khô với luồng không khí nóng ở nhiệt độ 70-80 độ C Ưu điểm của mì sấy là chứa hàm lượng béo thấp, giúp tăng thời gian bảo quản và được ưa chuộng hơn Tuy nhiên, quy trình sản xuất mì không chiên có năng suất thấp, cùng với mùi vị và cấu trúc không phù hợp, khiến sản phẩm này ít phổ biến tại Châu Á so với mì chiên.

 Là loại mì có dạng sợi.

 Được tạo dạng vắt tròn hay chữ nhật.

 Sử dụng nhanh bằng cách ngâm mì trong nước sôi.

 Thường sử dụng luôn cả nước ngâm mì.

 Cung cấp đủ nhu cầu dinh dưỡng cho 1 bữa ăn nhanh.

 Mì có thể qua quá trình chiên hay không chiên.

Nguyên liệu và các chỉ tiêu của nguyên liệu

Mì ăn liền được sản xuất chủ yếu từ bột mì, kết hợp với nước và dầu chiên (shortening) làm nguyên liệu phụ Ngoài ra, các phụ gia như CMC (carboxyl metyl cellulose), Natri polyphosphat, muối ăn, bột màu thực phẩm cùng với gia vị như muối, đường, bột ngọt, hành, tiêu, ớt, trứng và tôm cũng được sử dụng để tăng hương vị cho sản phẩm.

Nguyên liệu chính để sản xuất mì ăn liền là bột mì, được chế biến từ hạt lúa mì Thành phần bột mì rất đa dạng, phụ thuộc vào loại bột và thành phần hóa học của hạt mì Hạt mì chứa cả chất hữu cơ và vô cơ, trong đó chất hữu cơ chiếm 83-85%, chủ yếu là glucid, lipid, vitamin, sắc tố và enzyme Chất vô cơ chiếm khoảng 15-17%, bao gồm nước và các chất khoáng.

Bảng 1.3 Thành phần một số loại bột (% theo chất khô)

Loại bột Tỷ lệ Độ tro Cellulose Tinh bột Protein Lipid Pentose Thượng hạng 10,5 0,47 0,13 80,16 10,28 0,25 1,59

(Ghi chú: tỷ lệ phần trăm loại bột thu được từ bột mì ban đầu.)

 Vai trò của bột mì trong sản xuất mì ăn liền:

 Là nguồn gluten và tinh bột chính của mì ăn liền.

 Là chất tạo hình, tạo bộ khung, hình dáng, góp phần xác định trạng thái: độ cứng, độ đặc, độ dai và độ đàn hồi cho sợi mì.

 Các thành phần quan trọng trong bột mì:

Chiếm khoảng 70 – 90% chất khô, gồm đường (0,6 – 1,8%), dextrin (1 – 1,5%),hemicellulose (2 – 8%), tinh bột (80%), pentose (1,2 – 3,5%), cellulose (0,01 –0,05%), maltose (0,005 – 0,05%), saccharose (0,1 – 0,55%), rafinose và fructose (0,5 –1,1%).

Protid trong bột mì là protid không hoàn hảo, gồm có hai dạng: đơn giản và phức tạp.

 Dạng đơn giản gọi là protein, bao gồm bốn loại: albumin, globulin, prolamin và glutelin.

Dạng phức tạp của protein, gọi là protid, bao gồm glucoproteit, nucleoproteit và cromoproteit Trong bột mì, prolamin và glutelin chiếm tỉ lệ cao, và khi nhào bột, hai thành phần này hút nước để tạo ra một mạng lưới phân bố đều trong khối bột Mạng lưới này có tính dai và đàn hồi, được gọi là gluten, giúp bột mì trở nên nhão, dễ cán và cắt định hình, do đó rất phù hợp cho sản xuất mì ăn liền.

Chất lượng gluten ướt được xác định qua các chỉ tiêu cảm quan và vật lý, bao gồm màu sắc, độ dai, độ căng đứt và độ đàn hồi.

Bột mỡ chứa khoảng 2-3% chất béo, chủ yếu là chất béo trung tính, cùng với phosphatit, stearin, sắc tố và vitamin tan trong chất béo Trong quá trình bảo quản, chất béo có thể bị phân hủy, dẫn đến việc giải phóng acid béo tự do, điều này không chỉ ảnh hưởng đến độ acid và hương vị của bột mà còn tác động đến tính chất gluten.

Bảng 1.4 Hàm lượng khoáng và vitamin của bột mì

Loại bột Vitamin (mg/kg) Chất khoáng (mg/100gr)

 Đánh giá chất lượng bột mì:

Bột mì đưa vào sản xuất phải thỏa mãn các tiêu chuẩn chất lượng sau:

Bảng 1.5: Các chỉ tiêu chất lượng của bột mì

Màu sắc Trắng hoặc trắng ngà đặc trưng

Mùi Mùi của bột tự nhiên không hôi

Vị Không mốc, chua, đắng, có mùi lạ, vị lạ

Tạp chất vô cơ Không có sạn

Sâu mọt Không có Độ ẩm Không được vượt quá 15,5% Độ mịn Không đóng cục, lọt qua rây 212m từ 98% trở lên

Hàm lượng gluten ướt Không nhỏ hơn 28%

Hàm lượng tro Không lớn hơn 0,75% Độ acid Không quá 50mg KOH cần để trung hòa acid béo tự do trong 100g bột tính theo chất khô

Tạp chất Fe Không lớn hơn 3mg/kg

Dầu chiên sử dụng trong công ngệ sản xuất mì ăn liền là shortening đã được tinh luyện và hydro hóa để cải thiện tính năng sử dụng.

 Là tác nhân gia nhiệt và là thành phần sản phẩm.

 Tăng giá trị cảm quan cho mì.

 Tăng giá trị dinh dưỡng cho mì.

 Nhiệt độ nóng chảy cao (40 – 42 0 C).

 Có độ bền nhiệt, nhiệt độ trùng hợp sản phẩm cao.

 Có độ rắn cần thiết nhưng dẻo thích hợp.

 Ít bị hôi, trở mùi, có khả năng nhũ hóa cao.

 Ít bị oxy hóa hơn.

Sử dụng shortening để chiên mì mang lại hình thức và chất lượng tốt hơn so với các loại dầu khác Mì sẽ khô ráo hơn, không bị thấm dầu ra ngoài bao bì, có thời gian bảo quản lâu hơn và ít mùi hôi hơn.

 Đánh giá chất lượng của dầu chiên:

Bảng 1.6: Các chỉ tiêu chất lượng của dầu chiên

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

% ẩm và chất lượng bay hơi 0,1

Màu sắc, bề mặt Màu sắc đục, trong

Mùi vị Thơm, đặc trưng, không ôi chua

Chỉ tiêu vi sinh Theo tinh chất của Bộ Y tế

Tạp chất Cát bụi: không có

Hàm lượng các kim loại < 3 mg/Kg

Dùng để nhào bột, chiếm khoảng 30% tổng lượng bột.

 Làm trương nở gluten và tinh bột, tạo độ dai cần thiết của khối bột nhào.

 Hòa tan các phụ gia để dễ phối trộn.

Nước dùng trong sản xuất mì cần tuân thủ tiêu chuẩn của Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về chất lượng nước ăn uống (QCVN 01:2009/BYT), đảm bảo đạt các yêu cầu cụ thể để đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.

 Trong suốt, không có mùi vị lạ, không có vi sinh vật gây bệnh.

 Độ cứng (tính theo CaCO3): giới hạn tối đa cho phép là 300mg/l.

Bảng 1.7 Các chỉ tiêu hóa học của nước

Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa cho phép

Tổng chất rắn hòa tan (TDS) 1000mg/l

Amoniac (NH3) 3 mg/l Đồng (Cu) 1 mg/l

Sắt tổng (Fe 2+ và Fe 3+ ) 0,3 mg/l

Bảng 1.8 Các chỉ tiêu vi sinh của nước cho sản xuất thực phẩm

(Dạng thực phẩm có qua gia nhiệt)

Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa cho phép

Vi sinh vật hiếu khí trong 1ml nước 100

Vi sinh vật kỵ khí trong 1ml nước 0

Vi khuẩn E.Coli trong 1 ml nước 0

Các gia vị như bột ngọt, đường, muối, hành, tiêu, tỏi, ớt và dầu ăn đóng vai trò quan trọng trong nước trộn bột và gói bột nêm Tùy theo từng loại sản phẩm, các gia vị này được pha chế khác nhau, tạo nên hương vị đặc trưng và nâng cao giá trị cảm quan cho từng loại mì.

Lượng muối trong gói bột nêm và trong gói mì chiếm khoảng 4% trọng lượng gói mì.

 Tạo vị mặn cho sản phẩm.

 Giảm hoạt động của enzyme và các vi sinh vật trong khối bột nhào.

Để tăng độ dai cho sợi mì, việc thêm muối vào khối bột nhào với tỉ lệ 1-1,2% là rất quan trọng, vì ion Na+ giúp gluten liên kết chặt chẽ hơn Tuy nhiên, nếu lượng muối quá nhiều, nó sẽ cạnh tranh với nước trong gluten, dẫn đến việc giảm chất lượng sản phẩm.

 Các yêu cầu kỹ thuật của muối theo (TCVN 3974 – 2007)

Bảng 1.9 Chỉ tiêu cảm quan của muối

Tên chỉ tiêu Thượng hạng Hạng 1 Hạng 2

Màu sắc Trắng trong, trắng Trắng, ánh xám, ánh vàng, ánh hồng

Dung dịch muối 5% có vị mặn thuần khiết, không có vị lạ Dạng bên ngoài và cỡ hạt

 Là chất rắn không màu, không mùi, không vị.

 Vai trò: được pha vào trong dung dịch trộn với bột mì (thường pha với tỉ lệ 0,5 – 1% so với tổng lượng bột) nhằm:

 Tăng độ dai cho sợi mì do làm tăng liên kết hydro.

 Có tính chất keo dính, tác dụng ổn định khi định hình.

Ngoài ra còn dùng một số phụ gia khác có chức năng tương tự như: Xanthan gum, Guar gum, Locust bean gum.

Hỗn hợp này chủ yếu bao gồm các muối như Na2CO3, K2CO3, Na2HPO4 cùng với một số kim loại như K2O, Na2O, MgO, Fe2O3 và P2O5, được pha chế với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào từng loại mì và nơi sản xuất.

 Tăng khả năng hồ hóa, giảm sự thoái hóa của cấu trúc bột.

 Bổ sung các nguyên tố kim loại, tăng độ lớn lực ion làm chặt khung gluten và tăng độ dai của sợi mì.

 Trung hòa độ chua của bột (trung hòa các acid hữu cơ có sẵn trong bột), giúp bột nhanh chín trong giai đoạn hấp.

 Giữ nước giúp sản phẩm trở nên mềm mại.

 Giúp bột dễ vào trục cán.

 Tạo độ trơn láng cho sợi mì.

Màu vàng caroten hoặc tartazine thường được sử dụng với tỉ lệ nhỏ để tạo màu sắc hấp dẫn cho sợi mì, nhằm nâng cao giá trị cảm quan của sản phẩm Việc sử dụng chất màu cần tuân thủ liều lượng nhất định và các yêu cầu quy định.

 Không gây độc hại cho người sử dụng.

 Sản phẩm chuyển hóa của chúng cũng không độc.

 Không làm thực phẩm có mùi lạ.

 Không làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

 Không làm hao mòn hay phá hủy bao bì, thiết bị, dụng cụ chế biến.

CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA MÌ ĂN LIỀN

Chỉ tiêu cảm quan

Vắt mì trước khi nấu cần đảm bảo hình dạng khối hoặc xác định đồng đều, phù hợp với từng loại bao bì Sợi mì phải không vụn nát, bóng đều và không có khuyết tật đáng kể.

Mì sau khi nấu đạt được độ dai đặc trưng sau 4 phút ngâm trong nước sôi, không bị đứt hay nát, và không dính lại với nhau Sau 8 phút, sợi mì chỉ trương nở một cách nhẹ nhàng, giữ được hình dáng và chất lượng tốt.

 Màu sắc: màu vàng sáng đặc trưng cả hai mặt, không bị cháy, hai mặt ít có sự khác biệt.

 Mùi vị: mỗi loại có mùi vị đặc trưng tùy gói gia vị.

 Vắt mì khô: mùi thơm đặc trưng, không có mùi hôi, ôi khét hoặc mùi lạ.

 Nước mì: mùi thơm béo đặc trưng của mì và gia vị, có vị ngọt, không có mùi vị lạ.

 Gói gia vị: kín không bị ẩm, khô sạch, có khối lượng đúng yêu cầu.

Giấy gói mì cần phải đảm bảo đúng chủng loại, không bị rách mép và có chữ in rõ ràng Ngoài ra, thông tin về hạn sử dụng cũng phải được in một cách rõ ràng và tuân thủ đúng quy định về thời gian bảo hành sản phẩm.

Tạp chất lạ

Sản phẩm không được chứa tạp chất lạ.

Chỉ tiêu hóa lý

Loại gói Sai lệch cho phép

85 g 1000g ±2 ±3 ±10 Đối với loại gói được đóng trên 1000 g trở lên, sai lệch khối lượng cho phép là ± 1%.

 Tối đa 10% đối với sản phẩm chiên.

 Tối đa 14% đối với sản phẩm không chiên.

 Hàm lượng chất béo: 15 – 20% chất khô.

 Hàm lượng protit: ≥ 10% chất khô.

 Hàm lượng nitơ tổng số của gói gia vị: ≥ 2,0% chất khô.

 Hàm lượng NaCl trong vắt mì: ≤ 4,0% chất khô.

 Hàm lượng tro không tan trong acid HCl: ≤ 0,1% chất khô.

Chỉ số acid, được xác định bằng số mg KOH cần thiết để trung hòa hoàn toàn acid béo tự do trong 1g chất béo, tối đa không vượt quá 2,0 mg KOH/g dầu Tiêu chuẩn này áp dụng riêng cho các sản phẩm chiên.

 Chỉ số peroxide (số mg Na2S2O3 0.002N dùng để chuẩn 1g mẫu thử):

 Trong vắt mì: ≤ 0,4 ml Na2S2O3 0,002 N/g

 Trong dầu sa tế: ≤ 0,5 ml Na2S2O3 0,002 N/g

Chỉ tiêu vi sinh

 Tồng số vi khuẩn hiếu khí (khuẩn lạc/g) : ≤ 10 4

 Samonella trong 25g : không phát hiện

 Tổng số bào tử nấm men, nấm mốc : ≤ 10 2

Chỉ tiêu về kim loại nặng

 Hàm lượng asen (As) : ≤ 0.1 mg/kg

 Hàm lượng chì (Pb) : ≤ 0.5 mg/kg

 Hàm lượng thủy ngân (Hg) : ≤ 0.05 mg/kg

 Hàm lượng cadimi (Cd) : ≤ 1.0 mg/kg

Chỉ tiêu về độc tố vi nấm

Hàm lượng aflatoxin tổng số không lớn hơn 10 g/kg.

Phụ gia thực phẩm

Việc sử dụng phụ gia thực phẩm cần tuân thủ mức tối đa theo CODEX STAN 192 – 1995, tiêu chuẩn chung về phụ gia thực phẩm Đặc biệt, đối với các sản phẩm dạng sợi, ống sơ chế và tương tự, cần áp dụng các loại phụ gia được quy định trong tiêu chuẩn này cho đến khi có cập nhật mới.

Số INS Phụ gia thực phẩm Mức tối đa

Chất điều chỉnh độ axit

270 Axit lactic (L-, D-, và DL-) GMP

500(ii) Natri hydro cacbonat GMP

304 Ascorbyl palmitat 500 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo ascorbyl stearat

306 Hỗn hợp tocopherol đậm đặc 200 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp

310 Propyl gallat 200 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo chất béo hoặc dầu

320 Hydroxyanisol đã butylat hóa (BHA)

321 Hydroxytoluen đã butylat hóa (BHT)

101(i) Riboflavin 200 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo riboflavin

110 Vàng mặt trời lặn (Sunset yellow FCF) 300 mg/kg

141(i) Phức chất đồng clorophyll 100 mg/kg

141(ii) Phức chất đồng clorophyllin, các muối natri và kali 100 mg/kg

143 Fast green FCF 290 mg/kg

150b Caramel II-caustic sulphit 50000 mg/kg

150c Caramel III-amoniac 50000 mg/kg

150d Caramel IV-amoniac sulphit 50000 mg/kg

160a(i) Beta caroten (tổng hợp) 1200 mg/kg

160a(ii) Caroten thực vật 1000 mg/kg

160a(ii) Beta-caroten (Blakeslea trispora) 1000 mg/kg

160e Beta-apo-carotenal 200 mg/kg

160f Axit beta-apo-8’ caroten, metyl hoặc etyl este 1000 mg/kg

162 Đỏ củ cải đường GMP

Chất tạo hương (Flavour Enhancers)

407 Carrageenan và các muối Na, K, NH4 của chúng (kể cả furxellaran) GMP

407a Tảo Eucheuma đã chế biến GMP

414 Gum Arabic (gôm keo) GMP

1401 Tinh bột đã xử lý bằng axit GMP

1402 Tinh bột đã xử lý bằng kiềm GMP

1403 Tinh bột đã tẩy trắng GMP

1404 Tinh bột đã oxi hóa GMP

1405 Tinh bột đã xử lý bằng enzym GMP

Distarch phosphat đã este hóa bằng natri trimetaphosphat; este hóa bằng phospho oxyclorua

1413 Distarch phosphat đã phosphat hóa GMP

1414 Distarch phosphat đã axetylat hóa GMP

1422 Distarch adipat đã axetylat hóa GMP

1450 Tinh bột natri octenyl suxinat GMP

1451 Tinh bột oxi hóa đã axetylat hóa GMP

2000 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo phospho

420 Sorbitol và sorbitol syrop GMP

405 Propylen glycol alginate 5000 mg/kg

430 Polyoxyetylen (8) stearat 5000 mg/kg (theo chất khô) riêng lẻ hoặc kết hợp

432 Polyoxyetylen (20)sorbitan monolaurat 5000 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo

434 Polyoxyetylen (20)sorbitan monopalmitat Polyoxyetylen (20) sorbitan este tổng số

471 Mono và di-glyxerit của các axit béo GMP

472e Diaxetyltartaric và các este axit béo của glycerol 10000 mg/kg

473 Sucrosa este của các axit béo 2000 mg/kg

475 Este polyglyxerol của các axit béo 2000 mg/kg

476 Este polyglyxerol của các axit rixinoleic nội este hóa 500 mg/kg

477 Propylen glycol este của các axit béo 5000 mg/kg (theo chất khô

481(i) Natri stearoyl lactylat 5000 mg/kg

482(i) Canxi stearoyl lactylat 5000 mg/kg

491 Sorbitan monostearat 5000 mg/kg (theo chất khô) riêng lẻ hoặc kết hợp

20 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính theo lưu huỳnh dioxyt

2000 mg/kg riêng lẻ hoặc kết hợp tính

202 Kali sorbet theo axit sorbic

Chất nhiễm bẩn

Tuân thủ các mức tối đa được quy định trong CODEX STAN 193 – 1995 Tiêu chuẩn chung đối với chất nhiễm bẩn và độc tố trong thực phẩm.

Bao bì và điều kiện đóng gói

Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền được đóng gói trong bao bì an toàn, đảm bảo vệ sinh và giữ nguyên giá trị dinh dưỡng, đồng thời bảo vệ các đặc tính cảm quan và công nghệ của sản phẩm.

Bao bì và vật liệu bao gói cần được chế tạo từ các chất liệu an toàn, phù hợp với mục đích sử dụng Điều quan trọng là bao bì không được phép truyền tải các chất độc hại, mùi hoặc vị không mong muốn vào sản phẩm.

Vệ sinh thực phẩm

Sản phẩm mì ăn liền cần được chế biến và xử lý theo tiêu chuẩn TCVN 5603:2008, tuân thủ các quy định trong Quy phạm thực hành vệ sinh thực phẩm (CAC/RCP 1-1969; Rev.4-2003) và các văn bản Codex liên quan Việc áp dụng các nguyên tắc này đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng.

Xác định các nguyên tắc vệ sinh thực phẩm là rất quan trọng và cần được áp dụng xuyên suốt trong toàn bộ chu trình thực phẩm, từ khâu sản xuất đến tay người tiêu dùng Mục tiêu chính là đảm bảo thực phẩm an toàn và phù hợp cho sức khỏe con người.

HACCP là một phương pháp hiệu quả nhằm tăng cường an toàn thực phẩm bằng cách áp dụng các nguyên tắc kiểm soát nguy cơ Để thực hiện HACCP, cần xác định các điểm kiểm soát quan trọng và thiết lập quy trình giám sát chặt chẽ Hướng dẫn cụ thể về các quy phạm vệ sinh cần thiết sẽ giúp cải thiện chất lượng thực phẩm trong từng giai đoạn của chu trình sản xuất, từ nguyên liệu đầu vào cho đến sản phẩm cuối cùng.

Vi sinh vật trong sản phẩm thực phẩm cần phải tuân thủ các tiêu chuẩn vi sinh vật đã được quy định theo CAC/GL 21 – 1997, nhằm đảm bảo an toàn và chất lượng thực phẩm.

Ghi nhãn

Sản phẩm mì ăn liền được ghi nhãn phù hợp với TCVN 7087:2008 (CODEX STAN 1 – 2005) Ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn.

Việc mô tả, trình bày hoặc ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn cần phải chính xác và minh bạch, tránh gây hiểu nhầm hoặc lừa dối người tiêu dùng Điều này nhằm đảm bảo rằng mọi thông tin về đặc tính của thực phẩm đều được truyền đạt đúng cách, không tạo ra ấn tượng sai lệch về sản phẩm.

Khi mô tả nhãn thực phẩm bao gói sẵn, cần tránh sử dụng từ ngữ, hình ảnh hay hình thức thể hiện có thể gây nhầm lẫn với sản phẩm khác Việc này nhằm ngăn chặn sự lừa dối và bảo vệ người tiêu dùng khỏi những hiểu lầm về mối liên hệ giữa thực phẩm bao gói sẵn và các sản phẩm không liên quan.

Ghi nhãn bắt buộc đối với thực phẩm bao gói sẵn bao gồm:

 Khối lượng tịnh và khối lượng ráo nước.

 Tên và địa chỉ của nhà sản xuất, cơ sở đóng gói, nhà phân phối, tổ chức xuất, nhập khẩu hoặc nhà cung cấp.

 Ký mã hiệu nhận biết lô hàng.

 Thời hạn và hướng dẫn bảo quản.

Tên sản phẩm cần ghi rõ là “Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền”, “Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi có chiên” hoặc “Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi không chiên”, tùy thuộc vào loại sản phẩm Các tên gọi khác có thể được sử dụng nếu phù hợp với quy định hiện hành.

2.9.2 Ghi nhãn đối với sản phẩm “HALAL”

Khi ghi nhãn thực phẩm "Halal" cho sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền, cần tuân thủ tiêu chuẩn CODEX CAC/GL 24 – 1997, hướng dẫn chung về việc sử dụng thuật ngữ Halal.

Mì ăn liền phải được bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát, sạch sẽ, tránh ánh nắng mặt trời.

Do nhà sản xuất công bố.

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CHẤT

Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu theo CAC/GL 50 – 2004 Hướng dẫn chung về lấy mẫu.

Trong tiêu chuẩn này, việc lấy mẫu bao gồm các bước sau:

 Lấy một số lượng xác định mẫu ban đầu để tạo mẫu chung.

 Giảm mẫu chung thành mẫu phòng thử nghiệm.

Trong quá trình lấy mẫu ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc, cần chú ý rằng thành phần của các lô hàng thường không đồng đều và các chất nhiễm bẩn phân bố không đồng đều Do đó, việc lấy đủ số lượng mẫu ban đầu và trộn kỹ là rất quan trọng để tạo ra mẫu chung Đối với hàng hóa dạng tĩnh, cần đảm bảo rằng các mẫu ban đầu được phân bố đồng đều trong khối lượng hạt, cả ở bề mặt và sâu bên dưới.

Cần đảm bảo rằng tất cả thiết bị sử dụng đều sạch, khô và không có mùi lạ để tránh nhiễm bẩn Quy trình lấy mẫu phải được thực hiện cẩn thận, bảo vệ vật liệu khỏi các nguồn ô nhiễm bên ngoài như mưa và bụi.

Tất cả các quy trình lấy mẫu cần được thực hiện nhanh chóng để ngăn chặn sự thay đổi của chất bay hơi trong mẫu Nếu bất kỳ bước nào trong quá trình lấy mẫu kéo dài, các mẫu ban đầu, mẫu riêng hoặc mẫu chung phải được bảo quản trong các vật chứa kín.

Trong trường hợp có tranh chấp, mẫu phải do các đại diện của bên mua và bên bán cùng lấy hoặc do bên thứ ba được chỉ định.

Cần chú ý để đảm bảo tính nguyên vẹn của các mẫu từ thới điểm được lấy đến thời điểm sử dụng trong phòng thử nghiệm.

3.1.2.1 “Thùng” hoặc bao tải và túi được lấy mẫu

Lô hàng bao gồm một tập hợp các đơn vị cơ bản, hay còn gọi là "đơn vị được bao gói", được lấy từ một hoặc nhiều nguồn sản xuất và có cùng mã nhận diện cho từng bao bì.

Các đơn vị bao gói thường được vận chuyển trong thùng hoặc pallet chứa số lượng phù hợp Để xác định số lượng thùng hoặc pallet cần lấy mẫu, cần áp dụng phương pháp thích hợp cho các loại bao tải.

3.1.2.2 Mẫu ban đầu hoặc các đơn vị bao gói Đơn vị bao gói phải được lấy mẫu ban đầu ngẫu nhiên từ toàn bộ lượng chứa trong lô hàng được chọn để lấy mẫu.

3.1.2.3 Số lượng và khối lượng của mẫu ban đầu

Các mẫu ban đầu cần được lấy từ giữa và toàn bộ chiều dài của từng đơn vị bao gói, sử dụng xiên lấy mẫu hình nón đặc biệt Mẫu sẽ được thu thập từ số bao quy định dưới đây.

Sử dụng công thức dưới đây để xác định tần suất lấy mẫu trên lô, F(n), cho các lô hàng được bán dưới dạng bao gói riêng lẻ như bao hoặc bao gói dùng để bán lẻ.

Lấy mẫu ban đầu từ mỗi bao hoặc túi thứ n, trong đó n là số đơn vị bao gói giữa hai mẫu ban đầu, và số thập phân cần được làm tròn đến số nguyên.

 mB : khối lượng của lô hàng, tính bằng kilogam (kg).

 m1 : khối lượng của mẫu ban đầu, tính bằng kilogam (kg).

 mA : khối lượng của mẫu chung, tính bằng kilogam (kg).

 mP : khối lượng của bao gói riêng lẻ, tính bằng kilogam (kg).

Tần suất lấy mẫu cho lô hàng được xác định dựa trên khối lượng mẫu ban đầu 0,100 kg, tương ứng với số lượng mẫu tối thiểu cần lấy Nếu khối lượng mẫu ban đầu lớn hơn 0,100 kg, tần suất lấy mẫu vẫn được tính theo 0,100 kg.

Mẫu chung phải được trộn kỹ trước khi chia mẫu để thu được mẫu phòng thử nghiệm.

Để thu được số lượng mẫu phòng thử nghiệm với khối lượng quy định, cần áp dụng phương pháp và dụng cụ phù hợp nhằm đảm bảo tính đại diện của mẫu Trong trường hợp các mẫu chung quá lớn, có thể sử dụng dụng cụ thay thế, miễn là chúng có khả năng tạo ra các mẫu phòng thử nghiệm đại diện.

Dụng cụ phải được làm sạch kỹ giữa mỗi lần lấy mẫu để tránh bị nhiễm bẩn chéo.

 Phương pháp hình nón và chia bốn

 Trộn kỹ mẫu chung bằng cách lặp lại các thao tác ít nhất 2 lần Trộn mẫu trên bề mặt sạch, không thấm nước.

 Gom lại để tạo thành hình nón

 Dàn đều bề mặt của đống và chia thành bốn phần A, B, C, D.

 Loại bỏ 2 phấn đối diện (B và C) và trộn hai phần còn lại (A và D)

 Lặp lại toàn bộ quy trình cho đến khi thu được cỡ mẫu phòng thử nghiệm yêu cầu.

 Dụng cụ chia mẫu hình nón

 Để chia mẫu chung dùng dụng cụ có đế nếu cần và dùng các hộp hoặc thùng thu nhận mẫu.

 Trộn đều mẫu bằng cách lặp lại các quy trình ít nhất 3 lần và trộn các mẫu con trong thùng chứa

 Đưa mẫu chung vào thùng chứa kín.

 Hai mẫu con được thu vào hai hộp thu nhận.

 Giữ lại lượng mẫu trong một hoặc hai hộp thu nhận.

 Để lại hai hộp rỗng vào vị trí cũ.

 Lặp lại các thao tác trên nhiều lần cho đến khi thu được cỡ mẫu phòng thử nghiệm yêu cầu.

3.1.4 Bao gói và dán nhãn mẫu

Các mẫu phòng thử nghiệm cần được lưu trữ trong các vật chứa sạch và phù hợp với khối lượng mẫu Khối lượng mẫu phải đáp ứng yêu cầu cho tất cả các phép phân tích cần thực hiện Đồng thời, các vật chứa cũng phải đảm bảo duy trì các đặc tính ban đầu của mẫu phòng thử nghiệm.

Để bảo đảm chất lượng mẫu bên trong, các vật chứa nên được đổ đầy và được làm kín Việc này không chỉ giúp tránh thay đổi mẫu mà còn ngăn chặn hành vi giả mạo, đồng thời dễ dàng nhận biết nếu có sự can thiệp.

Thông tin trên nhãn của mẫu thử phòng thử nghiệm cần được ghi bằng mực không xóa được và rõ ràng Đồng thời, các thông tin này phải bao gồm đầy đủ các yêu cầu theo hợp đồng.

 Bản chất của sản phẩm

 Số nhận biết lô hàng

 Số hợp đồng (nếu có)

 Vị trí và điểm lấy mẫu

 Tên của người lấy mẫu

Mẫu cần được gửi đến phòng thử nghiệm càng nhanh càng tốt.

Mẫu cần được bảo quản và vận chuyển trong các điều kiện thích hợp để để duy trì tính nguyên vẹn của mẫu.

Báo cáo lấy mẫu có thể bao gồm một vài hoặc tất cả các thông tin sau:

 Tên và chữ ký của những người được ủy quyền lấy mẫu

 Tên và chữ ký người bán hàng

 Tên và chữ ký của người mua hàng

 Tên và chữ ký của người phân mẫu

 Mô tả sản phẩm, bao gồm:

 Mô tả thao tác lấy mẫu, bao gồm:

 Vị trí và điểm lấy mẫu

 Số lượng mẫu ban đầu trên một lô

 Số lượng các mẫu phòng thử nghiệm trên một lô

 Quy trình lấy mẫu đã sử dụng (dụng cụ, …)

 Nơi gửi mẫu (Tên và địa chỉ mà mẫu được gửi đến…)

 Các điều kiện vận chuyển và bảo quản.

3.1.7 Vệ sinh và an toàn

Dụng cụ lấy mẫu cần đáp ứng các yêu cầu an toàn, bao gồm đủ ánh sáng để kiểm tra, vận hành và bảo dưỡng Ngoài ra, người sử dụng cần đeo mặt nạ phù hợp khi làm việc trong môi trường có bụi bẩn.

Tiến hành đánh giá cảm quan

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 5604:1991 (ST SEV 4710 – 84) Tiêu chuẩn Quốc gia về Sản phẩm thực phẩm và gia vị - Điều kiện chung để tiến hành Đánh giá cảm quan.

Lấy mẫu theo yêu cầu của tiêu chuẩn về lấy mẫu.

Chuyển mẫu đến phòng cảm quan, mẫu sản phẩm phải được bao gói sao cho để không bị giảm chất lượng khi vận chuyển và bảo quản.

Chuyên gia lấy mẫu phải là người có đủ thẩm quyền và phải chịu trách nhiệm về tính đúng đắn của việc lấy mẫu.

Khi gửi mẫu đến phòng kiểm nghiệm ngoài khu vực lấy mẫu, các mẫu phải được đóng gói cẩn thận trong bao bì chung như hòm, túi hoặc hộp Bao bì này cần được niêm phong hoặc kẹp chì và đi kèm với nhãn chỉ số biên bản lấy mẫu.

Khi lấy mẫu phải lập biên bản trong đó có ghi:

 Tên, địa chỉ cơ quan tiến hành lấy mẫu

 Họ tên ngưới lấy mẫu

 Nơi, ngày tháng và phương pháp lấy mẫu

 Tên sản phẩm được lấy mẫu và số liệu cần thiết để nhận biết mẫu

 Số lượng và ký hiệu quy ước của mẫu lấy

 Lượng sản phẩm từ đó mẫu được lấy

 Các ghi chú liên quan đến lô, mục đích thử nghiệm

 Chữ ký, dấu, các ký hiệu khác cần để nhận biết người lấy mẫu.

3.2.2 Yêu cầu đối với phòng cảm quan

Phòng thí nghiệm để tiến hành đánh giá cảm quan cần có những gian phòng sau:

 Phòng cho chuyên gia thử nếm làm việc.

 Phòng để các chuyên gia thử nếm làm việc cần:

 Không ồn ào và rung động.

 Thông gió tốt nhưng không bị gió lùa, không bị ảnh hưởng của những chất gây mùi trong phòng thí nghiệm.

Chiếu sáng tốt là yếu tố quan trọng trong môi trường làm việc, với ánh sáng ban ngày là lựa chọn lý tưởng, miễn là không có tia nắng trực tiếp Đảm bảo ánh sáng đồng đều và không được nhỏ hơn mức cần thiết cho các vị trí làm việc là điều cần thiết để nâng cao hiệu quả và sức khỏe của nhân viên.

500 lux Việc chiếu sáng cần đảm bảo tốt việc đánh giá màu sắc sản phẩm.

 Sơn màu sáng hài hòa.

 Nhiệt độ không khí trong phòng phải là (20 ± 2) o C, độ ẩm tương đối (75 ±5)%.

 Sạch, không có mùi và bụi, và phải làm sạch bằng các hóa chất nhưng không để lại mùi.

 Yêu cầu đối với nơi làm việc của chuyên gia thử nếm:

Vị trí làm việc của chủ tịch hội đồng thử nếm cần được bố trí để có thể quan sát toàn bộ các thành viên, trong khi đó các chuyên gia thử nếm cũng nên có vị trí tương tự để đảm bảo không ảnh hưởng lẫn nhau trong quá trình đánh giá Việc sử dụng cabin hoặc bàn có vách ngăn là cần thiết để tạo không gian làm việc riêng biệt cho từng chuyên gia Các bàn cần được sắp xếp ở vị trí có ánh sáng tốt nhất, theo hình vòng tròn hoặc thành 1-2 dãy Trong trường hợp cần thiết, các chuyên gia có thể ngồi xung quanh một bàn với vách ngăn phù hợp để duy trì hiệu quả công việc.

 Nếu không có vách ngăn các vị trí của các chuyên gia thử nếm được bố trí cái nọ sau cái kia.

 Số vị trí cần là: 1 chỗ dành cho chủ tịch hội đồng, 5 đến 9 cho các chuyên gia thử nếm.

Mỗi vị trí làm việc cần được trang bị bàn đủ ánh sáng, dễ vệ sinh và ghế ngồi thoải mái để đảm bảo hiệu suất làm việc tốt nhất.

 Các văn bản về quy tắc cơ bản của việc đánh giá.

 Bút bi hoặc bút máy.

 Chất điều vị để phục hồi vị giác bình thường.

 Dụng cụ chứa chất thải.

Tất cả các vị trí làm việc cần được trang bị thiết bị chỉ báo và truyền tin quang điện hoặc điện tử Đặc biệt, vị trí chủ tịch nên được bổ sung thêm thiết bị xử lý thông tin để nâng cao hiệu quả công việc.

 Phòng chuẩn bị cần có:

 Những tủ để bảo quản tài sản, mẫu để phân tích cảm quan, những phương tiện để trung hòa vị giác thích hợp.

 Bàn làm việc để chuẩn bị mẫu.

 Tủ lạnh và tủ mát.

 Vòi nước nóng và nước lạnh.

 Dụng cụ chai lọ thích hợp.

 Bộ đồ ăn không bị oxy hóa.

 Cân có giới hạn lớn nhất 1000g và sai số của phép cân không lớn hơn ± 1g.

 Dụng cụ đo nhiệt độ.

 Dụng cụ để làm ẩm, nghiền và xử lý nhiệt.

3.2.3 Chuẩn bị tiến hành đánh giá

Mẫu sản phẩm thực phẩm và gia vị được chuẩn bị để đánh giá theo tiêu chuẩn về phương pháp thử đối với sản phẩm đó.

Cỡ mẫu cần phải đủ để tiến hành đánh giá theo các chỉ tiêu chất lượng.

Mẫu thử nếm cần được thực hiện ở nhiệt độ tương ứng với sản phẩm khi sử dụng, hoặc theo nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn phương pháp thử nghiệm của sản phẩm đó.

Khi thực hiện cảm quan kín với các mẫu thử trong bao gói của xí nghiệp, cần phải loại bỏ thông tin về cơ sở sản xuất hoặc chuyển chúng vào dụng cụ trung gian khác để đảm bảo tính khách quan.

Những mẫu trước khi chuyển đến thử nếm cần phải được mã hóa bằng số hay chữ cái.

Những mẫu của một loại sản phẩm được tập hợp thành một loại.

Chủ tịch hội đồng cảm quan đề xuất quy định thứ tự thử sản phẩm theo mức độ tăng dần của cường độ mùi, số lượng gia vị, và lượng các thành phần như dầu mỡ.

Các sản phẩm được đánh giá theo thứ tự từ mùi nhẹ đến vừa phải và sau đó là mạnh Tương tự, trong việc đánh giá vị, mức độ muối và độ cay cũng được phân loại từ ít đến nhiều.

3.2.4 Tiến hành đánh giá Đánh giá chất lượng của sản phẩm được các chuyên gia cảm quan tiến hành theo tiêu chuẩn và phương pháp thử sản phẩm đó.

Trước khi thực hiện đánh giá, cần chuẩn bị mẫu chuẩn có chất lượng tốt Kết quả đánh giá từ các mẫu này sẽ không được đưa vào xử lý.

Khi đánh giá mùi và vị của mẫu, nên cho các chuyên gia thử nếm từng mẫu một, tối đa là ba mẫu Trong khi đánh giá bằng mắt, có thể sử dụng tới sáu mẫu trong một bộ Việc đánh giá mùi và vị cần được thực hiện riêng biệt để tránh ảnh hưởng từ ngoại hình, trạng thái và màu sắc của mẫu.

Trong thời gian thử nếm, các thành viên hội đồng cần sử dụng chất điều vị khi cần thiết.

Tùy theo tính chất của sản phẩm sau khi tiến hành đánh giá 5 – 8 mẫu nghỉ không ít hơn 15 phút.

3.2.5 Xử lý kết quả đánh giá

Trước khi công bố kết quả, mỗi chuyên gia nếm thử sẽ ghi lại đánh giá và lập luận của mình vào phiếu thử nếm, đồng thời gạch bỏ các kết quả sai và ký tên xác nhận.

Chuyên gia thử nếm sẽ thông báo đánh giá của mình cho chủ tịch hội đồng bằng cách sử dụng thiết bị chỉ báo điện tử hoặc quang điện, đồng thời có thể trình bày bảng hoặc chuyển phiếu đánh giá đã được ký.

Sau khi đánh giá được kết quả trung bình hoặc quyết định duy nhất của các chuyên gia thử nêm viết nó vào phiếu thử nếm.

Sau khi đánh giá các mẫu riêng lẻ hoặc bộ mẫu, người ta sẽ công bố kết quả trung bình hoặc quyết định duy nhất, sau đó tiến hành thảo luận về chúng.

Mỗi chuyên gia thử nếm ký tên vào phiếu thử nếm và chuyển nó cho chủ tịch hội đồng hoặc người được chủ tịch ủy nhiệm.

Chủ tịch hội đồng hoặc người được ủy nhiệm tiến hành xử lý kết quả đánh giá của các chuyên gia.

Kết quả của việc tiến hành đánh giá được ghi vào biên bản hay sổ, với nội dung sau:

 Ngày tháng và nơi tiến hành đánh giá.

 Danh sách hội đồng thử nếm.

 Thông tin về mẫu đem đánh giá (tên sản phẩm, cơ sở sản xuất thông tin về lô, ngày tháng lấy mẫu,…)

 Kết quả xứ lý thống kê các đánh giá của các thành viên hội đồng.

 Kết luận về sản phẩm.

 Chữ ký của chủ tịch và thư ký hội đồng thử nếm.

Xác định độ ẩm

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 7879:2008 (CODEX STAN 249:2006) Tiêu chuẩn

Quốc gia về Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền.

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

 Đĩa nhôm: đường kính ≥ 55 mm, chiều cao ≥ 15 mm và có nắp đậy kín khi lật ngược.

 Tủ sấy bằng khí: kiểm soát được chính xác đến ± 1 o C.

 Bình hút ẩm kín khí: silica đã được sấy ở 150 o C được dùng làm chất hút ẩm.

Để chuẩn bị sản phẩm ăn liền, đầu tiên, lấy vắt sản phẩm ra khỏi bao gói và giữ gói gia vị lại Tiếp theo, chuyển vắt sản phẩm vào túi nhựa để bảo quản độ ẩm, sau đó dùng tay hoặc búa gỗ để làm vỡ vắt thành các miếng nhỏ Sử dụng hai sàng với kích thước lỗ 2,36 mm và 1,7 mm để lựa chọn các miếng có kích thước phù hợp, từ đó trộn kỹ và dùng làm mẫu thử Nếu các miếng sản phẩm nhỏ hơn kích thước lỗ sàng, hãy bẻ chúng thành các mảnh dài từ 1cm đến 2cm, trộn kỹ và sử dụng làm mẫu thử.

 Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi có chiên

Cân khoảng 2g mẫu thử đã trộn đều, chính xác đến 1mg, cho vào đĩa đã được sấy khô ở 105°C và làm nguội, với khối lượng đã biết Không đậy nắp đĩa, tiến hành sấy khô đĩa, nắp và mẫu thử trong 2 giờ tại tủ sấy thông gió.

Sấy ở nhiệt độ 105°C trong 2 giờ, tính từ khi tủ sấy đạt đủ nhiệt Sau khi hoàn tất, đậy nắp đĩa trong tủ sấy, chuyển ngay sang bình hút ẩm và cân chính xác đến 1mg khi đạt nhiệt độ phòng Ghi lại sự hao hụt khối lượng để xác định độ ẩm bằng phương pháp gián tiếp.

Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi không chiên được chế biến theo quy trình tương tự như ngũ cốc dạng sợi chiên, tuy nhiên thời gian sấy khô mẫu thử là 4 giờ.

Tính theo công thức sau đây: Độ ẩm (%) = m 1− m 1 m2 × 100 Trong đó:

 m1: khối lượng phần mẫu thử trước khi sấy (g).

 m2: khối lượng phần mẫu thử sau khi sấy (g).

Kết quả thử nghiệm được tính bằng trung bình cộng của hai phép xác định song song Chênh lệch giữa hai kết quả xác định song song không được vượt quá ± 0,5%.

Ghi kết quả phân tích chính xác đến 0,1%.

Chiết dầu ra khỏi sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 7879:2008 (CODEX STAN 249:2006) Tiêu chuẩn

Quốc gia về Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền.

Lấy sản phẩm ăn liền ra khỏi bao bì, giữ gói gia vị lại Chuyển sản phẩm vào túi nhựa để bảo quản độ ẩm, sau đó dùng tay hoặc búa gỗ để nghiền nát thành các miếng nhỏ Sử dụng hai sàng với kích thước lỗ 2,36 mm và 1,7 mm để chọn các miếng có kích thước phù hợp và trộn đều Nếu miếng vẫn quá nhỏ, tiếp tục bẻ cho đến khi đạt chiều dài từ 1cm đến 2cm, sau đó trộn kỹ và dùng làm mẫu thử.

Cân 25g mẫu thử và cho vào bình nón Erlenmeyer 200 ml Thay không khí trong bình bằng khí N2, sau đó thêm 100 ml dầu nhẹ và đậy nắp, để yên trong 2 giờ Gạn phần nổi qua giấy lọc vào phễu chiết, rồi thêm 50 ml dầu nhẹ vào phần còn lại và lọc tiếp Thêm 75 ml nước vào phễu chiết, lắc kỹ, để tách lớp và rút phần chất lỏng phía dưới Lặp lại quá trình với nước và loại bỏ lớp chất lỏng phía dưới Cuối cùng, gạn lớp dầu ete sau khi khử nước bằng Na2SO4 vào bình hình quả lê, và bay hơi dầu ete trong bình cầu dưới 40°C, phun khí N2 lên dịch chiết để loại bỏ hoàn toàn dầu ete.

Xác định trị số acid

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 7879:2008 (CODEX STAN 249:2006) Tiêu chuẩn

Quốc gia về Sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền.

3.5.1 Định nghĩa và nguyên tắc

Trị số acid của dầu chiết xuất từ sản phẩm ngũ cốc dạng sợi ăn liền có chiên là số mg KOH cần thiết để trung hòa 1g dầu Dầu được hòa tan trong hỗn hợp ete và ancol, sau đó được chuẩn độ bằng dung dịch KOH chuẩn.

Bình hút ẩm kín khí: silicagel đã đốt ở 150 0 C được dùng làm chất hút ẩm.

Để chuẩn hóa dung dịch kali hydroxit 0,05 mol/l, hòa tan 3,5g kali hydroxit trong nước không chứa CO2, sau đó thêm etanol 95% cho đến khi đạt 1 lít Trộn đều và để yên dung dịch trong vài ngày, đảm bảo không có CO2 lẫn vào Sử dụng phần nổi phía trên để thực hiện chuẩn hóa.

Cân một lượng acid amidosunfuric cần thiết và đặt vào bình hút ẩm với độ ẩm dưới 2,0 kPa trong 48 giờ Sau đó, cân từ 1g đến 1,25g chính xác đến 0,1mg, hòa tan trong nước không chứa CO2 và pha loãng đến 250 ml Lấy 25 ml dung dịch này cho vào bình Erlenmeyer, thêm 2 đến 3 giọt chỉ thị xanh bromotymol, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch kali hydroxit 0,05 mol/l cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh nhạt.

Hệ số phân tử gam = số gamacid amidosulfuric× độ tinh khiết ×25

 Hỗn hợp ete – ancol: các thể tích bằng nhau của etanol (99,5%) và ete.

 Dung dịch phenolphtalein: 1% trong ancol.

Trước khi lấy mẫu, cần hóa lỏng dầu chiết bằng nồi cách thủy Sau đó, cân từ 1g đến 2g mẫu đã hóa lỏng và cho vào bình Erlenmeyer Tiếp theo, thêm 80 ml hỗn hợp ete – ancol cùng vài giọt dung dịch phenolphtalein Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch kali hydroxit trong cồn 0,05 mol/l cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt và ổn định trong 30 giây Để thực hiện phép thử trắng, chỉ cần sử dụng hỗn hợp ete – ancol và dung dịch phenolphtalein.

Tính theo công thức sau đây:

Trị số acid (mg/g) = ( số ml mẫu thử−số ml mẫutrắng)×hệ số phân tử gam số gam mẫuthử x 2,806

Xác định độ chua

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 1875-76 Tiêu chuẩn Quốc gia về Mì sợi Phương pháp thử.

3.6.1 Định nghĩa Độ chua của mì (tính bằng độ) là số mililit NaOH 1N tiêu tốn khi chuẩn độ acid có trong 100g bột.

Cân 5g mẫu đã nghiền với độ chính xác 0,01g và chuyển vào bình nón khô, sạch, dung tích 100 – 150 ml Rót 30 - 50 ml nước cất trung tính vào bình và lắc đều khoảng 3 phút cho đến khi các vụn nhỏ phân tán hoàn toàn Tráng các phân tử bám vào thành bình bằng nước cất, sau đó thêm 5 giọt dung dịch phenolphtalein 1% và chuẩn độ bằng dung dịch kiềm 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 1 phút.

3.6.3 Tính toán Độ chua (tính bằng độ) theo công thức:

 V : Thể tích dung dịch kiềm 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ, (ml)

 20 : Hệ số để chuyển ra 100g sản phẩm

 10 : Hệ số để chuyển nồng độ dung dịch kiềm thành 1N

 K : Hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch kiềm đến 0,1N

Kết quả thử nghiệm được tính bằng trung bình cộng của hai phép xác định song song Sự chênh lệch giữa hai kết quả không được vượt quá 0,5 độ.

Ghi kết quả phân tích với độ chính xác đến 0,1 độ.

Định lượng acid béo và cholesterrol

Sau khi cân lipid toàn phần, hòa vào 10 ml dung dịch kali hydroxyt 0,5N trong cồn và chuyển vào bình cầu, lắp ống sinh hàn ngược, đun sôi trong 30 phút để xà phòng hóa Tiến hành cất thu hồi cồn và hòa tan xà phòng vào 20 ml nước sôi, sau đó chuyển sang bình lắng gạn 100 ml, rửa bình cầu bằng 10 – 20 ml nước sôi và chuyển toàn bộ vào bình lắng gạn.

Để giải phóng acid béo, acid hóa 1ml acid acetic đậm đặc và sau đó làm nguội Chiết xuất acid béo bằng 40 – 50 ml ete, thực hiện 3 lần Sau khi tập hợp cả 3 lần ete, để lắng và loại bỏ nước, chuyển ete vào bình cầu đã sấy khô và cân sẵn Tiến hành thu hồi ete và sấy cặn còn lại chứa acid béo ở nhiệt độ 100 – 105 o C cho đến khi đạt trọng lượng không đổi, từ đó tính hàm lượng acid béo trong 1kg mì.

Cặn có acid béo được sử dụng để định lượng cholesterol bằng cách hòa tan cặn trong 5 ml aceton và thêm dung dịch digitonin 1% trong cồn 80 độ, đảm bảo mỗi mg cholesterol tương ứng với 0,5 – 1 ml dung dịch digitonin Sau đó, bình cầu được đặt lên nồi cách thủy sôi cho đến khi dung môi bay hơi hết, tiếp theo cho vào 50 ml nước nóng và dùng que thủy tinh nghiền, đun sôi trong 2 – 3 phút để hòa tan digitonin thừa Khi hỗn hợp đã nguội đến 60 độ C, thêm 25 ml aceton và đun sôi lại, sau đó lọc qua phễu xốp dung dịch cồn nóng với vòi nước chảy tạo chân không Khi đã lọc được khoảng 40 ml dung dịch, thêm 25 ml aceton để hòa tan phần cuối, giúp việc lọc dễ dàng hơn Cuối cùng, tráng bình cầu với 8 ml aceton, sau đó nhiều lần với ete (5 ml mỗi lần), rồi với 5 ml clorofom và kết thúc với 8 ml ete.

Sau khi hòa tan hoàn toàn acid béo và loại bỏ digitonin dư thừa, hợp chất cholesterol digitonin còn lại trên phễu xốp đã được rửa sạch Sau đó, hợp chất này được sấy khô ở nhiệt độ 100 – 105 độ C cho đến khi đạt trọng lượng ổn định, từ đó xác định được hàm lượng cholesterol.

Hàm lượng cholesterol trong mẫu thử = P− G P 1 ×0,243 Trong đó:

 P : Trọng lượng của phễu và kết tủa cholesterol digitonin.

Xác định hàm lượng tro

3.8.1 Xác định hàm lượng tro toàn phần

Dùng sức nóng (550 – 600 o C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ Phần còn lại đem cân, và tính ra phần trăm tro có trong thực phẩm.

3.8.1.2 Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử

 Chén nung bằng sứ hoặc bằng kim loại.

 Đèn cồn hay bếp điện.

 Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (550 – 600 o C).

 Bình hút ẩm, phía dưới để chất hút ẩm.

Nung chén sứ hoặc chén kim loại đã được rửa sạch ở nhiệt độ 550 – 600 °C cho đến khi đạt trọng lượng ổn định Sau đó, để nguội trong bình hút ẩm và tiến hành cân chính xác đến 0,0001g.

Cho khoảng 5g mì đã đập nhỏ vào chén và cân chính xác bằng cân phân tích Sau đó, đặt tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 độ.

600 o C Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thời gian nung thường khoảng 6 – 7 giờ.

Trong trường hợp có tro đen, cần lấy ra để nguội, sau đó thêm vài giọt HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến khi tro chuyển sang màu trắng Sau khi nguội trong bình hút ẩm, tiến hành cân với độ chính xác như đã nêu Tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 30 phút, rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khi đạt trọng lượng không đổi Kết quả giữa hai lần nung và cân liên tiếp không được chênh lệch quá 0,0005g cho mỗi 1g mẫu thử.

Hàm lượng tro theo % tính bằng công thức:

 G1 : Trọng lượng của chén và trọng lượng mì, (g).

 G2 : Trọng lượng của chén và trọng lượng của tro trắng sau khi đã nung và cân tới trọng lượng không đổi, (g).

3.8.2 Xác định hàm lượng tro tan trong nước

Hòa tan tro toàn phần vào nước cất sôi và lọc qua giấy lọc không tro, sau đó hứng dịch lọc vào chén sứ đã nung, để nguội và cân Rửa lại phần tro không tan, giấy lọc và phễu bằng nước cất sôi nhiều lần Dịch lọc được dồn vào chén sứ, cô cạn ở nồi cách thủy, sấy khô ở nhiệt độ 100 – 101 o C và nung đến tro trắng ở 550 – 600 o C trong 30 phút Cuối cùng, để nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0.0001g.

Hàm lượng tro tan trong nước theo % tính bằng công thức:

 G3 : Trọng lượng của chén và trọng lượng tro tan trong nước, (g).

3.8.3 Xác định hàm lượng tro không tan trong nước

Sau khi hòa tan tro trong nước cất sôi, rửa phần không tan và lọc qua giấy lọc không tro, toàn bộ giấy lọc cùng phần tro không tan được cho vào chén sứ đã nung, sau đó để nguội và cân Tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 100 – 101 độ C và nung cho đến khi đạt được tro trắng Cuối cùng, để nguội trong bình hút ẩm và cân bằng cân phân tích với độ chính xác 0.0001g.

 Hàm lượng tro không tan trong nước theo % tính bằng công thức:

 G3 : Trọng lượng của chén và trọng lượng của tro không tan trong nước, (g).

 Có thể tính hàm lượng tro không tan trong nước bằng cách tính:

 X1: Hàm lượng tro toàn phần.

 X2: Hàm lượng tro tan trong nước.

Xác định hàm lượng muối ăn (NaCl)

3.9.1 Phương pháp định lượng trực tiếp (phương pháp Mohr)

3.9.1.1 Nguyên lý Áp dụng phản ứng:

Khi cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch trung tính chứa NaCl, phản ứng sẽ xảy ra cho đến khi NaCl kết hợp hoàn toàn với AgNO3 Khi đó, một giọt AgNO3 dư thừa sẽ phản ứng với K2CrO4, tạo ra Ag2CrO4 có màu đỏ gạch, đánh dấu sự kết thúc của phản ứng.

2AgNO3 + K2CrO4  Ag2CrO4 + 2KNO3

Từ lượng AgNO3, ta có thể tính ra hàm lượng NaCl trong 100g mì.

3.9.1.2 Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử

 Bình nón dung tích 200 - 250ml

 Bình định mức dung tích 100ml

 Pipet bầu 10ml, một hoặc hai vạch

 K2CrO4 10% trong nước trung tính

 Dung dịch NaHCO3 0,01N và dung dịch acid acetic 0,01N

 Dung dịch phenolphtalein 1% và dung dịch para – nitrophenol 0,15%

Lấy mẫu mì tiến hành nung thành tro trắng, hòa tan trong nước cất và chuẩn độ.

Sau khi chuẩn bị mẫu thử, hãy cho vào bình định mức và thêm nước cất cho đến gần đủ 100ml Kiểm tra xem dung dịch có đạt độ pH trung tính hay không; nếu không, cần tiến hành trung hòa trước khi thêm nước cất cho đủ 100ml.

Lấy 10ml cho vào bình nón với 3 giọt K2CrO4 Chuẩn độ từ từ dung dịch AgNO3 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ gạch bền vững.

Hàm lượng muối ăn NaCl theo %, tính bằng công thức:

 n : Số ml AgNO3 0,1N đã sử dụng để chuẩn độ mẫu thử

 0,00585g : Hệ số g NaCl trương đương với 1ml AgNO3 0,1N

3.9.2 Phương pháp định lượng gián tiếp

3.9.2.1 Nguyên lý Áp dụng hai phản ứng liên tiếp:

Khi cho AgNO3 vào dung dịch NaCl, AgCl sẽ kết tủa hoàn toàn, tạo thành phản ứng đầu tiên Lượng AgNO3 thừa sau đó được chuẩn độ bằng KSCN trong phản ứng thứ hai Cuối cùng, giọt KSCN thừa sẽ kết hợp với ion Fe3+ trong phèn sắt amoni, tạo ra phức hợp Fe(SCN)3 có màu đỏ, đánh dấu sự kết thúc của phản ứng.

3.9.2.2 Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử

 Bình nón dung tích 200 – 250 ml.

 Bình định mức 100 ml, 200 ml.

 Pipet bầu 10 ml một hoặc hai vạch.

 Dung dịch khử tạp chất gồm hai dung dịch:

 Kali feroxyanua 15 g, nước cất vừa đủ 100ml.

 Kẽm acetat 20 g, nước cất vừa đủ 100 ml.

 Dung dịch phèn sắt amoni (NH4)2SO4.Fe2(SO4)3.24H2O bão hòa (khoảng 40%).

Nung 5g mì trong 1 giờ ở 220 o C Chiết suất tro nhiều lần bằng dung dịch HNO3

2%, lọc trên giấy lọc không tro Dịch lọc cho vào bình định mức và định mức thành

100 ml Lấy 10 ml dịch lọc, định lượng bằng phượng pháp gián tiếp.

Lấy một lượng nhất định mẫu thử chuẩn bị cho vào bình định mức 200 ml, với

20 ml HNO3 5% và 20 ml AgNO3 0,1N lắc đều Cho nước vừa đủ 200 ml Lắc đều để nơi tối cho tạo tủa AgCl Sau đó đem dịch tủa đi lọc.

Lấy 100 ml dịch lọc trong, cho thêm 5 ml dung dịch phèn sắt amoni và định lượng AgNO3 thừa bằng KSCN 0,1N cho đến màu hồng gạch

Làm một mẫu trắng với nước cất không chứa halogenua.

Hàm lượng muối ăn (NaCl) theo % tính bằng công thức:

 N: số ml KSCN 0,1N sử dụng để định lượng mẫu trắng.

 n: số ml KSCN 0,1N sử dụng để định lượng mẫu thử.

 P: trọng lượng mẫu thử sau khi đã tính toán độ pha loãng, (g).

Xác định hàm lượng vụn, sản phẩm biến dạng

Tiêu chuẩn cơ sở TCVN 1875-76 quy định về Mì sợi, bao gồm phương pháp thử nghiệm Để thực hiện, cần đổ cẩn thận một đơn vị bao gói lên bề mặt sạch, như bàn hoặc giấy, sau đó lựa chọn riêng từng loại vụn và sản phẩm bị biến dạng, đồng thời cân riêng từng loại để đảm bảo độ chính xác trong kiểm tra.

Tính khối lượng của từng loại bằng phần trăm so với khối lượng của một đơn vị bao gói.

Xác định tạp chất sắt

Tiêu chuẩn cơ sở TCVN 1875-76 quy định về chất lượng mì sợi tại Việt Nam Phương pháp thử nghiệm yêu cầu đổ mì lên giấy sạch, tạo thành lớp dày từ 4 đến 5 mm Để kiểm tra hàm lượng sắt, sử dụng nam châm có sức nâng tối thiểu 8 kg cho mỗi 1 kg khối lượng nam châm.

Di chuyển nam châm theo chiều dọc và ngang, đồng thời thường xuyên loại bỏ sắt dính vào nam châm Tập trung các mảnh sắt này lên mặt kính đồng hồ và cân chúng trên cân phân tích với độ chính xác đạt 0,0002 g.

Hàm lượng tạp chất sắt tính bằng bằng mg/kg.

Xác định phẩm màu

Tiêu chuẩn cơ sở: Thường quy kỹ thuật Xác định phẩm màu dùng trong thực phẩm (Quyết định số 883/2001/QĐ-BYT ngày 22 tháng 3 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ

Trong môi trường acid, phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính acid sẽ được hấp phụ vào sợi len lông cừu nguyên chất màu trắng Sau đó, chúng được chiết xuất từ sợi len bằng dung dịch amoniac Cuối cùng, việc định tính được thực hiện thông qua phương pháp sắc ký trên giấy, trong khi định lượng được thực hiện bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.

 Bình triển khai sắc ký.

 Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.

 Pipet bầu 5ml, 10 ml, 20ml.

 Bình định mức 50ml, 100ml, 200ml

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có các qui định khác Bao gồm:

 Giấy chỉ thị màu vạn năng.

 Acid acetic 10% (đong 10 ml acid acetic đậm đặc thêm nước cất vừa đủ 100ml)

 Dung dịch amoniac ( NH3) 1,25% (Đong 50 ml dung dịch amoniac 25 %, thêm nước cất 2 lần vừa đủ 1000 ml).

 Len lông cừu nguyên chất màu trắng.

 Hỗn hợp nước: Cồn 90 o (1:1) (Đong 50 ml cồn 90 o thêm nước cất vừa đủ 100 ml).

 Amoni acetat 0,02 M (cân 1,5416g amoni acetat thêm nước cất vừa đủ 1000ml).

Phẩm màu trong danh mục cho phép có nồng độ 1g/lit trong amoni acetat 0,02M (Cân chính xác 100mg phẩm chuẩn thêm amoni acetat 0,02M vừa đủ 100ml).

Hệ dung môi khai triển:

 Natri citrat (2g) nước (80 ml) amoniăc 25% (20 ml).

Cân chính xác 20g mẫu thử và cho vào cối sứ 250ml, thêm 10g celite và nghiền kỹ Tiếp theo, thêm 10ml nước cất để tạo thành bột nhão, sau đó cho 30ml aceton vào và nghiền tiếp để chiết xuất màu Lọc dịch chiết vào bình gạn và chiết bã còn lại hai lần với 30ml aceton mỗi lần Tập trung tất cả dịch chiết vào bình lắng gạn, thêm 30ml nước cất và lắc đều, sau đó cho thêm 30ml n-hexan để loại bỏ chất béo Cuối cùng, lắc nhẹ và để lắng cho tách thành hai lớp.

 Lớp trên là n- hexan có chứa chất béo.

 Lớp dưới gồm phẩm màu tan trong nước và aceton.

Lấy 200ml dịch chiết vào bát sứ, sau đó đun cách thủy để bay hơi hoàn toàn dung môi Tiến hành acid hóa bằng dung dịch CH3COOH 10% đến pH=5 Tiếp theo, hấp phụ màu vào len và chiết màu từ len ra bằng dung dịch amoniac 1,25%.

3.12.4.2 Phát hiện phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính kiềm không được phép dùng trong chế biến thực phẩm

Vì không được phép dùng trong thực phẩm bất kỳ một phẩm màu kiềm nào, cho nên trước hết nên kiểm tra sự có mặt của nhóm này.

Để tiến hành thí nghiệm, cho 5ml dung dịch thử vào ống nghiệm, sau đó thêm 5 giọt amoniac 25% và 5ml ether thường Lắc đều hỗn hợp, rồi rót lớp ether sang ống nghiệm khác và loại bỏ phần nước Dù lớp ether có màu hay không, vẫn tiếp tục thực hiện các bước theo quy trình đã định.

 Rửa lớp ether bằng cách lắc với nước Lấy lớp ether, bỏ phần nước, lặp lại nhiều lần.

 Cho thêm 5ml dung dịch acid acetic 10% và lắc. Đánh giá: dung dịch Acid acetic bên dưới có màu là phần kiềm không được phép sử dụng.

3.12.4.3 Định tính phẩm màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước bằng kỹ thuật sắc ký trên giấy.

 Chuẩn bị giấy sắc ký

Chuẩn bị giấy sắc ký Whatman 1 hoặc FN4 kích thước 20 x 30cm Sử dụng bút chì đen để kẻ một đường thẳng song song, cách cạnh đáy 2,5cm, chia thành các đoạn cách nhau 2cm và cách mép giấy 3cm Đánh dấu tên mẫu bằng bút chì đen.

 Chuẩn bị bình sắc ký

Bình có chiều cao 25 cm và đường kính 18 cm với đáy bằng Đổ một trong năm hệ dung môi khai triển vào bình sao cho lớp dung môi có chiều dày 1,5 cm, sau đó đậy nắp bình lại Để quá trình bão hòa diễn ra trong 30 phút.

 Tiến hành chấm sắc ký

Hoà cặn mẫu thử đã chiết bằng 0,5 ml dung dịch cồn : nước (1:1)

Trước khi chấm dùng máy sấy, sấy nhẹ giấy sắc ký Dùng micropipet chấm 10 -

Trong quy trình phân tích mẫu phẩm màu chuẩn, cần sử dụng 20 microlit mẫu trong danh mục cho phép Vết chấm màu phải gọn gàng, có đường kính khoảng 3mm Sau mỗi lần chấm, cần sấy nhẹ để tránh tình trạng loang rộng Cuối cùng, dùng kim chỉ trắng khâu tờ giấy lại thành hình trụ, đảm bảo mép giấy cách nhau khoảng 0,5 cm.

Để triển khai sắc ký, đặt cuộn giấy sắc ký đã chấm vào bình sắc ký theo chiều thẳng đứng, tránh chạm vào thành bình Sau đó, đậy nắp bình và để yên cho dung môi thấm vào giấy Khi tuyến dung môi chạy đến cách mép trên giấy sắc ký khoảng 2,5cm (thời gian khoảng 1 - 2 giờ tùy theo hệ dung môi), lấy ra và để bay hết hơi dung môi trong tủ hút cho đến khi giấy khô.

So sánh màu sắc và vị trí vết của phẩm mẫu thử với các phẩm chuẩn trong danh mục cho phép Nếu màu sắc và vị trí vết của phẩm mẫu thử trùng khớp với vết của phẩm chuẩn trên sắc ký đồ (Rf của mẫu thử = Rf của mẫu chuẩn), thì có thể kết luận rằng phẩm đó được phép sử dụng.

3.12.4.4 Định lượng phẩm màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.

Để làm giàu mẫu, hòa cặn chiết được với 0,5ml dung dịch cồn: nước (1:1) và dùng micropipet chấm lên giấy sắc ký Sau khi triển khai sắc ký, cắt các vết màu trên giấy để tách riêng từng loại Tiến hành chiết màu nhiều lần bằng dung dịch amoni acetat 0,02 M cho đến đủ 10ml, sau đó định lượng trên máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ở các bước sóng phù hợp cho từng phẩm màu.

Chuẩn bị mẫu trắng là dung dịch amoni acetat 0,02M.

Bước 2 là xây dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng các nồng độ đã biết từ dung dịch chuẩn mẹ Tiếp theo, vẽ đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ phẩm chuẩn Dựa vào đồ thị này, ta có thể tính toán được nồng độ của chất cần xác định.

Để xác định nồng độ của các loại phẩm màu, cần pha chuẩn với các nồng độ 0,001; 0,003; 0,006; 0,009 và 0,012 mg/ml Sau đó, sử dụng máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS với cuvet có chiều dày 1cm để đo và vẽ đường chuẩn.

Bảng 3.1 Phổ hấp thụ thích hợp cho mỗi loại phẩm màu

TT Danh mục phẩm mầu λ (nm)

Nồng độ phẩm màu trong 100 gam thực phẩm được tính theo công thức:

 C: Nồng độ chất màu trong 100g thực phẩm (mg).

 Cx: Nồng độ chất màu tìm được từ đồ thị chuẩn.

 V: Thể tích pha loãng (ml).

 A: Lượng mẫu cân dùng phân tích gam hoặc ml.

 Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,001mg/ml.

 Độ thu hồi của phương pháp là 90%.

 Sai số của phương pháp 10%.

Xác định Aflatoxin B 1 và hàm lượng tổng số Aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 7596:2007 (ISO 16050:2003) Tiêu chuẩn quốc gia về

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để xác định Aflatoxin B1 và tổng hàm lượng Aflatoxin B1, B2, G1 và G2 trong ngũ cốc, các loại hạt cùng với các sản phẩm chế biến từ chúng Việc phát hiện và định lượng chính xác các loại aflatoxin này là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Mẫu thử được chiết xuất bằng hỗn hợp metanol và nước, sau đó được lọc và pha loãng với nước Cuối cùng, mẫu chiết được đưa vào cột ái lực có chứa các kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin.

Aflatoxin B1, B2, G1 và G2 được tách và làm sạch trên cột, sau đó được cô đặc và loại bỏ khỏi các kháng thể bằng metanol Định lượng aflatoxin được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo, sử dụng phát hiện huỳnh quang và dẫn xuất sau cột.

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có các qui định khác.

 Nước, theo loại 1 của TCVN 4851 – 89 (ISO 3696:1987).

 Iot, tinh thể hoặc pyridinium hydrobromid perbromid (PBPB).

 Aflatoxin, dạng tinh thể hoặc viên nang.

Cảnh báo: Aflatoxin được xác định là chất gây ung thư cho con người, theo thông tin từ Tổ chức Quốc tế Nghiên cứu về bệnh ung thư thuộc Tổ chức Y tế Thế giới Hãy chú ý đến những cảnh báo này để bảo vệ sức khỏe của bạn.

Phòng phân tích cần được bảo vệ khỏi ánh sáng mặt trời bằng cách sử dụng tấm hấp thụ tia cực tím (UV) cho cửa sổ Nên kết hợp ánh sáng dịu không trực tiếp hoặc sử dụng tấm chắn với ánh sáng nhân tạo, như đèn huỳnh quang, để tạo điều kiện làm việc hiệu quả.

 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

 Metanol, loại dùng cho phân tích.

 Metanol, loại dùng cho HPLC.

Toluen là một chất dễ cháy và nguy hiểm, do đó, việc chuẩn bị chất chuẩn với dung môi này cần được thực hiện trong tủ hút Ngoài ra, các thao tác bên ngoài tủ hút, như đo các chất chuẩn bằng sắc ký phổ UV, cũng phải được tiến hành với các chất chuẩn trong các vật chứa kín để đảm bảo an toàn.

Trộn 98 phần thể tích của toluen với 2 phần thể tích của axetonitril.

Trộn 7 phần thể tích metanol với 3 phần thể tích nước.

Các hỗn hợp dung môi chiết khác có thể được áp dụng cho pha động nếu chúng được chứng minh là hiệu quả hơn hoặc được nhà sản xuất cột ái lực miễn nhiễm (IA) khuyến cáo.

Trộn 3 phần thể tích nước với 1 phần thể tích axetonitril và 1 phần thể tích metanol Khử khí dung dịch trước khi sử dụng.

 Thuốc thử dẫn xuất sau cột

Hòa tan 100 mg iốt trong 2 ml metanol, sau đó thêm 200 ml nước và khuấy trong 1 giờ Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm và chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tuần Bảo quản dung dịch ở nơi tối hoặc trong chai thủy tinh màu nâu, và trước khi sử dụng, khuấy dung dịch trong 10 phút.

Cách khác, hòa tan 50 mg PBPB trong 1000 ml nước Dung dịch này có thể được sử dụng trong vòng 4 ngày nếu được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ phòng.

 Dung dịch gốc Aflatoxin B1, B2, G1 và G2.

Cảnh báo: Bảo quản dung dịch chứa Aflatoxin tránh ánh sáng (để nơi tối, sử dụng lá nhôm hoặc dụng cụ thủy tinh màu hổ phách).

Hòa tan aflatoxin B1, B2, G1 và G2 riêng biệt trong hỗn hợp toluen/axetonitril để tạo ra dung dịch với nồng độ 10 g/ml Để xác định chính xác nồng độ aflatoxin trong từng dung dịch gốc, cần ghi lại đường hấp thụ tại bước sóng từ 330 nm đến 370 nm sử dụng cuvet thủy tinh thạch anh.

Sử dụng máy đo quang phổ với hỗn hợp toluen/axetonitril làm đối chứng để đo nồng độ của từng loại aflatoxin Nồng độ aflatoxin, ký hiệu pi, được tính bằng microgam trên mililit thông qua công thức: pi = Amax × Mi × 1000 / (εi × d).

 Amax là độ hấp thụ được xác định ở mức tối đa của đường hấp thụ.

 Mi là khối lượng phân tử của từng alatoxin, tính bằng gam.

 i là hệ số hấp thụ phân tử của từng loại alatoxin trong toluen/axetonitril.

Giá trị hệ số hấp thụ phân tử (ε) được xác định trong dung dịch aflatoxin với nồng độ c = 1 mol/l và chiều dài cuvet d = 1 cm Hệ số này thường được trình bày không có đơn vị, nhưng có thể tính toán từ công thức A = ε x c x d, với đơn vị tính là l.mol -1 cm -1.

 d là chiều dài đường quang của cuvét, tính bằng centimet.

Mi và i được đưa ra trong bảng sau.

Bảng 3.2 Khối lượng phân tử và hệ số hấp thụ phân tử của aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 và

 Dung dịch gốc của hỗn hợp aflatoxin.

Chuẩn bị dung dịch gốc có chứa 500 ng/ml aflatoxin B1, 125 ng/ml aflatoxin B2,

Dung dịch chứa 250 ng/ml aflatoxin G1 và 125 ng/ml aflatoxin G2 trong toluen/axetonitril cần được bảo quản cẩn thận Trước khi bảo quản, hãy cân bình và gói kín bằng lá nhôm Nên bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4 o C Trước khi sử dụng, hãy cân lại bình và ghi lại bất kỳ sự thay đổi nào về khối lượng sau khi bảo quản.

Việc phơi nhiễm dưới ánh sáng UV trong quá trình đo độ hấp thụ thường gây cản trở việc quan sát sự thay đổi của phản ứng quang hóa.

 Dung dịch chuẩn của hỗn hợp aflatoxin.

Chuyển lượng dung dịch gốc aflatoxin đã trộn vào bốn bình định mức 2 ml Bay hơi dung dịch dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô Thêm 1 ml metanol vào mỗi bình để hòa tan cặn khô, sau đó pha loãng đến vạch bằng nước và trộn đều Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày để sử dụng.

Bảng 3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Thể tích được lấy từ dung dịch gốc l

Nồng độ của aflatoxin ng/ml

Chú thích: Các giá trị đã cho chỉ là hướng dẫn Dãy chuẩn bao gồm các nồng độ của các mẫu.

Ngâm dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm đã tiếp xúc với dung dịch aflatoxin trong axit sulfuric trong vài giờ, sau đó rửa sạch ba lần bằng nước để loại bỏ hoàn toàn vết axit Để xác nhận axit đã được loại bỏ, tiến hành kiểm tra pH.

Xác định Ocratoxin A

3.14.1.Xác định ocratoxin A – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng silicagel.

Tiêu chuẩn cơ sở TCVN 7595-1:2007 (ISO 15141-1:1998) quy định phương pháp xác định ocratoxin A trong ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc Phần 1 của tiêu chuẩn này tập trung vào việc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với quá trình làm sạch bằng silicagel để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy trong việc phát hiện chất độc hại này.

Sau khi acid hóa bằng acid clohydric và tăng nồng độ ion bằng magie clorua, ocratoxin A (OTA) được chiết xuất bằng toluen Dịch chiết được làm sạch qua cột sillicagel nhỏ và xác định OTA bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên cột pha đảo, với việc nhận dạng và sửa đổi qua huỳnh quang Kết quả có thể được xác minh lại bằng dẫn xuất với bo triflorua trong dung dịch metanol, nếu cần thiết.

Ocratoxin A là một chất độc hại ảnh hưởng đến gan và thận, và có nguy cơ gây ung thư Để đảm bảo an toàn khi xử lý các hợp chất này, cần tuân thủ các biện pháp phòng ngừa thích hợp, đặc biệt là tránh xử lý chúng ở dạng khô do tính chất tĩnh điện có thể dẫn đến phân tán và hít phải Đối với các dụng cụ thủy tinh, có thể khử nhiễm bằng dung dịch natri hypoclorit 4% Lời cảnh báo từ Tổ chức Quốc tế về Nghiên cứu bệnh ung thư cần được chú ý nghiêm túc.

Trong quá trình phân tích, cần sử dụng thuốc thử đạt tiêu chuẩn chất lượng tinh khiết và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước loại 1 theo TCVN 4851.

89 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác Dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

 Acid acetic băng, (CH3COOH)  98%.

 Dung dịch acid clohydric, c(HCl) = 2 mol/l.

 Dung dịch megie clorua, c(MgCl2) = 0,4 mol/l.

 Hỗn hợp dung môi I: toluen và acid acetic băng với các phần tương ứng là 99 +

1 theo các phần thể tích (V + V).

 Hỗn hợp dung môi II: aceton và toluen với các phần tương ứng là 5 + 95 (V + V).

 Hỗn hợp dung môi III: toluen và acid acetic băng với các phần tương ứng là 90 + 10 (V + V).

 Pha động: trộn 99 phần thể tích acetonitril với 99 phần thể tích nước và 2 phần thể tích acid acetic băng và khử khí dung dịch này trước khi sử dụng.

 Bo triflorua trong dung dịch metanol, (BF3) = 14 g/ 100 ml.

Cảnh báo: sử dụng tủ hút thông gió tốt Tránh tiếp xúc với da, mắt và đường hô hấp.

 Ocratoxin A, dạng tinh thể hoặc dưới dạng viên nang.

Hòa tan 1 mg ocratoxin A (tinh thể) hoặc lượng ocratoxin A trong 1 viên nang vào hỗn hợp dung môi I để tạo dung dịch có nồng độ khoảng 20 μg/ml Để xác định nồng độ chính xác, ghi lại độ hấp thụ tại các bước sóng cách nhau 5 nm trong khoảng từ 300 nm đến 370 nm sử dụng cuvet thạch anh 1 cm với dung môi làm chất chuẩn Xác định bước sóng có độ hấp thụ cực đại bằng cách ghi lại giá trị tại các bước sóng cách nhau 1 nm xung quanh giá trị cực đại Tính nồng độ khối lượng của ocratoxin A (microgam/ml) theo công thức: ρ=Amax ×M ×100 k × δ.

 Amax là độ hấp thụ xác định được tại điểm cực đại của đường hấp thụ (ở đây tại 333 nm).

 M là khối lượng phân tử tương đối của ocratoxin A (M = 403 g/mol).

 k là hệ số hấp thụ phân tử của ocratoxin A, trong hỗn hợp dung môi I (ở đây là 544m 2 /mol).

  là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet.

 Dung dịch chuẩn ocratoxin A,  = 1 g/ml:

Cho bay hơi 1 ml dung dịch chuẩn gốc hoặc một phần tương đương với 100 g ocratoxin A dưới dòng khí nitơ cho đến khi khô, sau đó sử dụng pha động để pha loãng đến 100 ml.

Dung dịch này có thể bảo quản ở 4 o C trong tủ lạnh Cần kiểm tra tính ổn định của dung dịch.

 Dung dịch hiệu chuẩn ocratoxin A:

Sử dụng pipet để lấy các thể tích phù hợp của dung dịch chuẩn ocratoxin A, với nồng độ ocratoxin A trong các dung dịch hiệu chuẩn cần nằm trong khoảng từ 0,2 ng đến 1,0 ng trong thể tích 20 µl.

 Dung dịch natri hypoclorit, (NaOCl) = 4 g/100 ml.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:

 Máy nghiền phòng thử nghiệm, thích hợp để nghiền mẫu đến 1mm.

 Bộ cất quay, có nồi cách thủy có thể kiểm soát được nhiệt độ từ 20 o C đến 50 o C.

 Máy đo phổ, có thể đo ở bước sóng từ 300 nm đến 370 nm, có chiều rộng đường phổ không quá ± 2 nm.

 Cuvet thạch anh, có chiều dài đường quang 1 cm và hấp thụ không đáng kể ở bước sóng từ 300 nm đến 370 nm.

 Ống ly tâm, ví dụ: có dung tích 250 ml, bằng chất dẻo polyetylen khối lượng riêng cao (HDPE), có nắp vặn.

 Máy ly tâm lạnh, thích hợp nhất là máy ly tâm lạnh, có thể tạo ra lực hấp dẫn ít nhất là 3500 g ở đáy của các ống ly tâm.

Sau khi mở bao gói, cần ổn định silicagel đã hoạt hóa có chất chỉ thị ẩm ở nhiệt độ 105 o C trong 2 giờ và bảo quản đúng cách Trước khi sử dụng, hãy rửa bằng 10 ml toluen và kiểm tra độ thu hồi cho mỗi mẻ mới Nếu sử dụng cột SEP-PAK, cần tuân thủ các quy định ghi trên hộp.

 Khối lượng trung bình của vật liệu nhồi bên trong : 690 mg.

Trong một ống polypropylen 3 ml.

 Bình chứa dung môi, giống như một ống syranh.

 Bình hình quả lê, 50ml, có khớp nối thủy tinh mài.

 Bộ lọc màng, dùng cho các dung dịch lỏng, có đường kính 4 mm và cỡ lỗ 0,45m được làm bằng polytetrafluoroetylen (PTFE).

 Sàng, có cỡ lỗ không quá 1mm.

 Lọ, có nắp vặn hoặc lọ có nắp xoáy.

 Thiết bị HPLC, gồm có:

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các thành phần chính như bình chứa dung môi, bơm, hệ thống bơm mẫu, và detector huỳnh quang với khả năng điều chỉnh bước sóng Ngoài ra, thiết bị còn được trang bị bộ xử lý dữ liệu, chẳng hạn như bộ tích phân và máy vẽ đồ thị, nhằm nâng cao hiệu quả phân tích.

Cột tách phân tích pha đảo, như cột C18, có khả năng phân giải pic ocratoxin A khỏi các pic khác Thông số kỹ thuật của cột bao gồm chiều dài 250 mm, đường kính trong 4 mm và kích thước hạt hình cầu 5 µm.

 Bộ phận bảo vệ trước cột, C18: chiều dài: 40 mm, đường kính trong: 4 mm, hạt hình cầu có cỡ: 5 m.

Quy trình phân tích phải hoàn thành trong ngày, và nếu nhiều mẫu thử được chuẩn bị đồng thời, tất cả các mẫu đó cần được phân tích cùng một lúc trong suốt đêm bằng cách sử dụng bộ bơm mẫu tự động.

Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm nghiền nhỏ mẫu cho đến khi lọt qua sàng 1mm và dùng máy trộn để trộn kỹ.

3.14.1.4.3 Chiết ocratoxin A ra khỏi mẫu

Cân 20 g (m o ) mẫu đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm Đối với hàm lượng ocratoxin A lớn hơn 5,0 g/kg thì lặp lại phép phân tích sử dụng 10,0 g phần mẫu thử, mặt khác, cũng phải tính đến nguy cơ bị giảm độ thu hồi Tiếp theo, cho

30 ml dung dịch acid clohydric, 50 ml dung dịch magie clorua, dùng đũa thủy tinh để khuấy và thêm 100 ml toluen (V 1 ).

Lắc hỗn hợp trong 60 phút và tiến hành ly tâm huyền phù, thời gian ly tâm tùy thuộc vào hiệu quả của máy ly tâm và việc làm lạnh để tránh mất toluen Sau đó, lấy 50 ml toluen từ lớp trên và nạp vào cột phan rắn loại nhỏ dùng một lần, cột này được kết nối với syranh để chứa dung môi.

Rửa cột hai lần, mỗi lần bằng 10 ml n – hexan và rủa tiếp hai lần, mỗi lần bằng

10 ml hỗn hợp dung môi II Tiếp theo, rửa bằng 5 ml toluen Loại bỏ tất cả nước rửa.

Để rửa giải ocratoxin A, sử dụng hai phần hỗn hợp dung môi III, mỗi phần 15 ml, cho vào bình hình quả lê 50 ml Tiến hành bay hơi dịch rửa giải dưới áp suất giảm cho đến khi khô, chú ý giữ nhiệt độ không vượt quá 40 oC Sau đó, lấy phần cặn ra và dùng pipet hút 1 ml (V3) pha động, cho vào bình hình quả lê và lọc qua bộ lọc màng vào lọ bằng dung dịch mẫu thử.

Việc rửa giải ocratoxin A và các bước thực hiện liên quan có thể thay đổi tùy thuộc vào loại cột chiết pha rắn được sử dụng Cần kiểm tra thể tích rửa giải để đảm bảo phù hợp với loại cột đang áp dụng.

3.14.1.4.4 Điều kiện vận hành HPLC

Khi sử dụng cột và pha động thì cài đặt như sau đậy là thích hợp:

 Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

 Phát hiện huỳnh quang: bước sóng kích thích: 330 nm, bước sóng phát xạ: 460 nm.

Chuẩn bị đường chuẩn ngay từ khi bắt đầu phân tích và bất cứ khi nào thay đổi các điều kiện sắc ký.

Bơm ít nhất bốn dung dịch hiệu chuẩn có các nồng độ thích hợp khác nhau.

Vẽ đồ thị các giá trị phát huỳnh quang của các dung dịch hiệu chuẩn ocratoxin

A dựa theo các nồng độ khối lượng ocratoxin A tính bằng nanogam.

Cần kiểm tra độ tuyến tính.

Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 o C.

Chuẩn bị hai đĩa rót với môi trường cấy quy định và lượng mẫu thử phù hợp; nếu sản phẩm ban đầu là dạng lỏng, sử dụng mẫu lỏng, hoặc nếu sản phẩm ở dạng khác, dùng huyền phù ban đầu theo quy định.

Chuẩn bị các cặp đĩa rót trong cùng điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu Sau đó, ủ các đĩa ở 30°C trong điều kiện hiếu khí trong 72 giờ.

Tính số lượng vi sinh vật trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn.

3.15.2 Môi trường cấy và dịch pha loãng

3.15.2.1 Môi trường thạch để đếm đĩa (PCA)

 Chuẩn bị từ môi trường đông khô thương mại:

Theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 ở 25°C, nếu cần.

 Chuẩn bị từ các thành phần khô cơ bản:

Hòa tan các thành phần trong nước theo thứ tự: cao nấm men, pepton từ casein, glucoza và bột sữa gầy nếu cần thiết Đun nóng nước để tăng tốc độ hòa tan.

Thêm thạch và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi tan hết thạch Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 ở 25°C, nếu cần.

 Phân phối, khử trùng và bảo quản:

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, với các lượng từ 12 ml đến 15 ml vào mỗi ống hoặc bình hoặc chai có dung tích không quá 500 ml.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

Để đảm bảo chất lượng, nếu môi trường được sử dụng ngay, cần làm nguội trong nồi cách thủy đến nhiệt độ từ 44°C đến 47°C Nếu không sử dụng ngay, hãy bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3°C ± 2°C, không quá 3 tháng, trong điều kiện không làm thay đổi thành phần và đặc tính của nó.

Trước khi tiến hành kiểm tra vi sinh vật, cần hoàn toàn làm tan chảy môi trường và để nguội trong nồi cách thủy ở nhiệt độ từ 44°C đến 47°C Để xác định nhiệt độ của thạch, hãy sử dụng một nhiệt kế đặt trong dung dịch kiểm soát thạch 15 g/I, được chứa trong vật chứa tương tự như môi trường Nhiệt độ dung dịch kiểm soát cũng cần trải qua quá trình đun nóng và làm nguội giống như môi trường.

 Kiểm tra tính năng của thành phần nuôi cấy về sự đẩm bảo chất lượng

Cho thạch vào nước và đun đến sôi, thường xuyên khuấy cho đến khi tan hết thạch, hoặc dùng hơi nước trong khoảng 30 phút.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 ở 25°C, nếu cần.

 Phân phối, khử trùng và bảo quản:

Phân phối vào các ống nghiệm hoặc bình hoặc chai có dung tích thích hợp, mỗi ống 4 ml.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

Nếu môi trường được sử dụng ngay, cần làm nguội trong nồi cách thủy đến nhiệt độ từ 44°C đến 47°C Nếu không sử dụng ngay, hãy bảo quản ở nơi tối, với nhiệt độ 3°C ± 2°C, không quá 6 tháng để đảm bảo không làm thay đổi thành phần và đặc tính của nó.

Trước khi tiến hành kiểm tra vi sinh vật, cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường và để nguội trong nồi cách thủy đến nhiệt độ từ 44°C đến 47°C nhằm tránh chậm trễ khi rót môi trường.

Theo TCVN 6507 – 1:2005, tiêu chuẩn Việt Nam quy định về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, hướng dẫn cách chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Bài viết này tập trung vào các nguyên tắc chung để tạo ra huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân phục vụ cho việc kiểm tra vi sinh vật Việc tuân thủ các quy định này là cần thiết để đảm bảo độ chính xác trong quá trình kiểm tra vi sinh vật.

Có thể sử các dụng dịch pha loãng sau:

3.15.2.3.1 Dung dịch pha loãng SPW

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0.2 ở 25 o C, nếu cần.

3.15.2.3.2 Dung dịch đệm Pepton BPW

 Pepton từ mô động vật : 10.0 g.

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0.2 ở 25 o C, nếu cần.

Dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần có thể thay thế cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng đáp ứng các tiêu chuẩn và đặc tính cần thiết.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 30°C ± 1°C.

 Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm

 Pipet, có dung tích danh định 1 ml.

 Nồi cách thủy, có thể hoạt động ở 44°C đến 47°C.

Thiết bị đếm khuẩn lạc bao gồm bộ chiếu sáng với phông tối, kết hợp với kính lúp có độ phóng đại khoảng 1.5x và bộ đếm cơ học hoặc điện tử số.

 pH mét, có độ chính xác ± 0.1 đơn vị pH ở 25°C.

 Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp và không lớn hơn 500 ml.

3.15.4 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu tuân theo CAC/GL 50 – 2004 Hướng dẫn chung vầ lấy mẫu. Việc chuẩn bị mẫu thử theo các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887).

3.15.5.1 Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu)

Theo TCVN 6507 – 1:2005, tiêu chuẩn Việt Nam quy định về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, hướng dẫn cách chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 1 của tiêu chuẩn này nêu rõ các nguyên tắc chung trong việc chuẩn bị huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng, đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy trong quá trình kiểm nghiệm vi sinh vật.

Cân một mẫu thử đại diện với khối lượng m, đảm bảo sai số cho phép là ± 5% (tối thiểu 10g, trừ khi có quy định khác), và cho vào một chén hoặc túi vô trùng.

Cho một lượng dịch pha loãng 9m ml Lượng thêm này có thể được cân hoặc đong với sai số cho phép là ± 5%.

Trong một số trường hợp cụ thể, đặc biệt là với các sản phẩm có huyền phù ban đầu 1+9 quá sánh hoặc quá đặc, có thể cần tăng thêm dịch pha loãng Điều này cần được xem xét cho các thao tác tiếp theo và phải được tính vào phần tính kết quả.

Dung dịch pha loãng ban đầu ảnh hưởng đến giá trị giới hạn của phép định lượng, phụ thuộc vào kỹ thuật sử dụng, ví dụ như kỹ thuật rót đĩa với 1 ml chất cấy của huyền phù 1/10 có giới hạn 10 vi sinh vật trong 1 gam Đối với một số sản phẩm cụ thể, có thể sử dụng lượng dịch pha loãng nhỏ hơn để đạt số đếm thấp hơn giới hạn này Cần lưu ý rằng việc cấy huyền phù có thể gặp khó khăn do tỷ lệ chất cấy/môi trường không cân bằng, dẫn đến ức chế sự phát triển vi sinh vật Để bảo vệ vi sinh vật khỏi tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ của dịch pha loãng cần duy trì xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thao tác Cuối cùng, để các hạt lớn lắng xuống trong 15 phút, có thể sử dụng các hệ thống lọc để đạt kết quả tương đương.

Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia Coli giả định – Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

đếm số có xác suất lớn nhất

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là trong việc phát hiện và định lượng Escherichia coli giả định Phương pháp kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất được sử dụng để xác định sự hiện diện của loại vi khuẩn này, giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe động vật Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn đáp ứng yêu cầu nghiêm ngặt về an toàn vệ sinh thực phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm và chăn nuôi.

 Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu của mẫu thử vào môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc.

 Ủ ống nghiệm ở 37 o C đến 48 giờ Sau 24 giờ và 48 giờ kiểm tra ống về sự sinh khí.

 Nếu thấy ống nghiệm mờ, đục, hoặc sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa môi trường lỏng chọn lọc (canh thang EC).

 Ủ ống nghiệm thu được trong bước 3 ở 44 o C đến 48 giờ Sau 24 giờ và 48 giờ, kiểm tra các ống về sự sinh khí.

 Nếu ống nghiệm thu được trong bước 4 cho thấy sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa nước pepton không chứa indol.

 Ủ ống nghiệm thu được trong bước 5 ở 44 o C trong 48 giờ Kiểm tra ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân hủy của tryptophan trong pepton.

Các ống nghiệm có mờ đục hoặc sinh khí trong môi trường tăng sinh lỏng, và khi được cấy truyền có sinh khí trong canh thang EC cũng như sinh indol trong nước pepton ở 44 o C, được coi là có chứa E.coli giả định Kết quả cho thấy sự "có mặt" hoặc "không có mặt" của E.coli giả định trong x g hoặc x ml sản phẩm.

 Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép.

 Cấy một lượng qui định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn.

Trong cùng điều kiện, tiến hành cấy một lượng quy định của các dung dịch pha loãng thập phân từ huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ đơn.

 Ủ ấm các ống môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép ở 37 o C đến 48 giờ Sau

24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.

Mỗi ống môi trường nồng độ kép xuất hiện mờ, đục hoặc có sinh khí, trong khi mỗi ống môi trường nồng độ đơn cho thấy sự sinh khí Các mẫu này được cấy truyền vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng chọn lọc (canh thang EC) để phân tích.

 Ủ các ống thu được trong bước 4 ở 44 o C trong 48 giờ Sau 24 giờ đến 48 giờ, kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.

 Mỗi ống nghiệm thu được trong bước 5 cho thấy sinh khí được cấy truyền sang ống nghiệm chứa nước pepton không chứa indol.

 Ủ các ống thu được trong bước 6 ở 44 o C đến 48 giờ Kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân huỷ của tryptophan trong pepton.

Để xác định số lượng E.coli giả định có xác suất lớn nhất, cần tham khảo bảng MPN (xem phụ lục C) dựa trên số lượng ống chứa môi trường với nồng độ đơn và nồng độ kép Quy trình này được thực hiện sau khi tiến hành cấy truyền trong môi trường có sinh khí (EC) và sinh indol trong nước pepton ở nhiệt độ 44 o C.

3.16.2.Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử

Về thực hành các phòng thử nghiệm hiện hành, TCVN 6404 (ISO 7218).

Để tăng độ tái lặp của kết quả, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô khi chuẩn bị dịch pha loãng Việc tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà sản xuất là rất quan trọng.

Các hóa chất sử dụng phải đạt chất lượng phân tích và thích hợp để phân tích vi sinh vật.

Nước sử dụng phải là nước cất có chất lượng tương đương.

3.16.2.1.2 Dịch pha loãng thường dùng

 Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần.

 Pepton từ các mô động vật: 10,0g.

 Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na2HPO4.12H2O): 9,0g.

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4): 1,5g.

 Hòa tan các thành phần trong nước, , đun nóng nếu cần.

 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần.

 Phân phối và khử trùng dịch pha loãng:

 Phân phối dịch pha loãng với lượng cần thiết để chuẩn bị các huyền phù ban đầu vào các bình có nắp với dung tích thích hợp.

Để chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân, cần phân phối dịch pha loãng vào các ống nghiệm với lượng phù hợp, sao cho mỗi ống nghiệm sau khi khử trùng sẽ chứa 9,0ml Sai số cho phép của thể tích cuối cùng này sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2%.

 Đậy nắp các ống nghiệm.

 Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

3.16.2.2 Môi trường tăng sinh chọn lọc (Canh thang lauryl sunfat)

Môi trường nồng độ kép

Môi trường nồng độ đơn

Thủy phân mô thực vật và động vật bằng enzym 40,0 g 20,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 5,5 g 2,75 g

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

Phân phối từng lượng 9 ml môi trường này vào các ống nghiệm có kích thước

Các ống Durham có kích thước 16 mm x 160 mm được sử dụng cho môi trường nồng độ đơn, trong khi các ống thử kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm chứa các ống Durham với môi trường nồng độ kép và 10 ml dung dịch.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 o C.

Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi đã khử trùng.

3.16.2.3 Canh thang EC (môi trường chọn lọc)

 Dịch thủy phân casein bằng enzym : 20 g.

 Muối mật (bile salts) số 3 : 1,5 g.

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : 1,5 g.

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x

160 mm chứa các ống Durham.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 o C.

Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi đã khử trùng.

3.16.2.4 Nước pepton, không chứa indol

 Dịch thủy phân casein bằng enzym : 10 g.

Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường từ 5 ml đến 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 o C.

3.16.2.5 Thuốc thử Indol (Thuốc thử Kovacs)

 2-Metyl butan-1-ol hoặc pentan-1-ol : 75 g.

Hoà tan 4-Dimetylaminobenzaldehyd trong cồn bằng cách đun nhẹ trong nồi cách thủy, duy trì ở nhiệt độ khoảng từ 50 o C đến 55 o C.

Làm nguội và thêm acid.

Bảo quản tránh ánh sáng và giữ ở nhiệt độ khoảng 4 o C.

Thuốc thử phải có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt.

3.16.3.Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể thay thế các dụng cụ thủy tinh bằng thiết bị và dụng cụ dùng một lần nếu chúng đáp ứng các quy định kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm phân tích vi sinh thông thường, cụ thể là:

 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 37 o C ± 1 o C và 44 o C ± 1 o C.

 Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 44 o C ± 1 o C.

 Các ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm, 18 mm x 180 mm và

 Que cấy vòng, bằng platin/iridi hoặc niken/crom có đường kính khoảng 3 mm hoặc các vòng lấy mẫu 10  vô trùng sử dụng một lần.

 Các ống Durham, có kích thước thích hợp dùng cho các ống nghiệm.

 Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml.

 pH mét, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 o C và có thể đọc đến 0,01 đơn vị pH.

3.16.4 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu phải tuân thủ theo CAC/GL 50 – 2004, hướng dẫn chung về quy trình lấy mẫu Để đảm bảo chất lượng, cần chuẩn bị mẫu thử theo các tiêu chuẩn cụ thể phù hợp với sản phẩm liên quan Trong trường hợp không có tiêu chuẩn cụ thể, các bên liên quan nên thống nhất và thỏa thuận về phương thức lấy mẫu.

3.16.5.1.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cho 1 ml huyền phù ban đầu vào 9 ml canh thang lauryl sunfat nồng độ đơn (tức là 0,1 g hoặc 0 1 ml mẫu) hoặc 10 ml huyền phù ban đầu cho vào 10 ml canh thang lauryl sunfat nồng độ kép (tức là 1 g hoặc 1 ml mẫu) Đối với các thể tích của các phần mẫu thử lớn hơn, thì chuẩn bị huyền phù ban đầu bằng cách cho x ml hoặc x g vào 9 x ml dịch pha loãng, sau đó cho toàn bộ huyền phù ban đầu vào 90 x ml canh thang lauryl sunfat nồng độ đơn Ví dụ, cho 5 ml hoặc 5 g mẫu thử vào 45 ml dịch pha loãng, và cho toàn bộ huyền phù ban đầu này vào 450 ml canh thang lauryl sunfat nồng độ đơn, hoặc cho phần mẫu thử vào một thể tích tương tự của canh thang lauryl sunfat nồng độ kép.

Ủ môi trường tăng sinh chọn lọc với canh thang lauryl sunfat được thực hiện bằng cách đặt các ống canh thang lauryl sunfat nồng độ đơn hoặc nồng độ kép trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ ± 2 giờ Nếu không có sự sinh khí và không có hiện tượng mờ đục cản trở quan sát trong giai đoạn này, cần tiếp tục ủ thêm 48 giờ ± 2 giờ.

3.16.5.1.3 Cấy và ủ môi trường chọn lọc (canh thang EC).

Sau khi ủ môi trường nồng độ kép và quan sát thấy hiện tượng mờ đục hoặc sinh khí, hoặc sau khi ủ môi trường nồng độ đơn và thấy sinh khí, cần cấy một vòng dịch cấy vào canh thang EC Tiếp theo, ủ hỗn hợp này trong nồi cách thủy hoặc tủ ấm ở 44 oC trong 24 giờ ± 2 giờ Nếu không thấy sinh khí trong canh thang EC sau giai đoạn này, cần kéo dài thời gian ủ để tổng thời gian đạt 48 giờ ± 2 giờ.

3.16.5.1.4 Cấy và ủ môi trường nước pepton

Sau khi đã ủ, nếu quan sát thấy sinh khí, cấy vào nước pepton, đã được làm ấm trước đến 44 o C một vòng dịch cấy Ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 44 o C.

3.16.5.1.5 Kiểm tra về sự sinh indol

Thêm 0,5 ml thuốc thử indol vào các ống nước pepton đã ủ, sau đó trộn đều và kiểm tra sau 1 phút Nếu pha cồn xuất hiện màu đỏ, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của indol.

Môi trường tăng sinh chọn lọc có sự sinh khí trong ống nghiệm chứa canh thang EC và sinh indol trong ống nước pepton được xác định là dương tính.

3.16.5.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Phương pháp định lượng coliform – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng Coliform – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Chuẩn bị hai môi trường đặc chọn lọc và lấy mẫu thử theo quy định; nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, lấy một lượng mẫu thử phù hợp, hoặc nếu sản phẩm ở dạng khác, lấy một lượng huyền phù ban đầu theo quy định.

Chuẩn bị các cặp đĩa môi trường chọn lọc trong cùng điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu Ủ các đĩa ở nhiệt độ 30C hoặc 37C trong 24 giờ Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng và xác nhận số khuẩn lạc nếu cần thông qua quá trình lên men lactoza.

Số coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu thử được tính từ số khuẩn lạc đặc trưng thu được trên các đĩa được chọn.

3.17.2.Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về việc chuẩn bị, pha chế và thử tính năng của môi trường cấy.

Để đảm bảo độ tái lặp cao trong kết quả, việc sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị dịch pha loãng là rất quan trọng Bên cạnh đó, cần tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn từ nhà sản xuất để đạt được hiệu quả tối ưu.

Các hóa chất sử dụng phải đạt chất lượng phân tích và thích hợp để phân tích vi sinh vật.

Nước sử dụng phải là nước cất có chất lượng tương đương.

3.17.2.1.2 Dịch pha loãng thường dùng

 Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần.

 Pepton từ các mô động vật: 10,0g.

 Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na2HPO4.12H2O): 9,0g.

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4): 1,5g.

 Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

 Phân phối và khử trùng dịch pha loãng:

Phân phối dịch pha loãng với lượng cần thiết để chuẩn bị các huyền phù ban đầu vào các bình có nắp với dung tích thích hợp.

Để chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân, cần phân phối dịch pha loãng với lượng chính xác vào các ống nghiệm, đảm bảo mỗi ống nghiệm sau khi khử trùng chứa 9,0ml Sai số cho phép của thể tích cuối cùng sau khử trùng không được vượt quá ± 0,2% Cuối cùng, đậy nắp các ống nghiệm để bảo quản.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

3.17.2.2 Môi trường đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể

 Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym: 7 g.

Để duy trì tính chọn lọc và đặc trưng của môi trường, hãy trộn đều các thành phần khô với nước và để yên trong vài phút Sau đó, điều chỉnh pH sao cho đạt khoảng 7,4 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 C sau khi đun sôi Đun sôi hỗn hợp và khuấy đều thỉnh thoảng để đảm bảo các thành phần hòa tan hoàn toàn.

Giữ sôi trong 2 phút Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy ở nhiệt độ

44C đến 47C. Để tránh làm quá nhiệt, không đun môi trường quá lâu cũng như không đun lại.

Do đó, không khử trùng trong nồi áp lực và cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường tại thời điểm sử dụng.

Sử dụng môi trường trong vòng 4 h sau khi chuẩn bị.

3.17.2.3 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng

 Dịch thủy phân casein bằng emzym: 10 g.

Để hòa tan các thành phần hoặc môi trường khô trong nước, cần đun nóng nhẹ trên nồi cách thủy nếu cần thiết Sau đó, điều chỉnh pH sao cho đạt 7,2 ± 0,2 ở 25 C sau khi khử trùng.

Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm chứa các ống Durham Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 C Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

3.17.3.Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể sau:

 Thiết bị để thanh trùng khô (tủ sấy) hoặc để thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ ấm, có thể hoạt động ở 30C ± 1C hoặc 37C ± 1C.

 Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

 Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml.

 Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có khả năng hoạt động từ 44  C đến 47  C hoặc ở 100C.

 Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm một nguồn chiếu sáng và dụng cụ đếm cơ học hoặc điện tử.

 Ống nghiệm, kích thước khoảng 16 mm x 160 mm.

 Ống Durham, có kích thước phù hợp với ống nghiệm.

 Bình hoặc chai, để đun sôi và bảo quản môi trường cấy.

 pH mét, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25  C.

 Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc loại vòng cấy dùng một lần.

3.17.4.Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

Lấy mẫu theo CAC/GL 50 – 2004 Hướng dẫn chung về lấy mẫu.

Chuẩn bị mẫu theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261).

3.17.5.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu bằng cách pha loãng theo tiêu chuẩn TCVN 6507 (ISO 6887) để đảm bảo tính chính xác trong quá trình phân tích Các dung dịch pha loãng tiếp theo cũng cần được thực hiện theo đúng quy trình quy định.

Chuẩn bị hai đĩa cho sản phẩm lỏng hoặc cho mỗi bộ pha loãng đã chọn Sử dụng pipet vô trùng để cho 1 ml mẫu thử vào tâm mỗi đĩa, nếu là sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng phù hợp Mỗi dung dịch pha loãng cần sử dụng một pipet vô trùng riêng.

Rót 15 ml môi trường VRBL vào mỗi đĩa Petri ở nhiệt độ 44 o C đến 47 o C Thời gian từ khi hoàn tất chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 1/10 cho sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường vào đĩa không được vượt quá 15 phút.

Trộn dịch cấy với môi trường và để hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt đĩa Petri trên bề mặt phẳng và mát Đồng thời, chuẩn bị một đĩa kiểm tra với 15 ml môi trường để kiểm tra độ vô trùng.

Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL ở 44 o C đến

47 o C lên bề mặt của môi trường cấy Để cho đông lại như mô tả ở trên.

Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm ở 30 o C hoặc 37 o C (như thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

Sau thời gian ủ quy định, chọn các đĩa Petri có từ 10 đến 150 khuẩn lạc Sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc để đếm các khuẩn lạc màu đỏ ánh tía với đường kính từ 0,5 mm trở lên, có thể có vùng mật tủa đỏ xung quanh Các khuẩn lạc này được xem là coliform điển hình và không cần thử khẳng định thêm Để biết thêm chi tiết về kỹ thuật đếm khuẩn lạc, tham khảo TCVN 6404 (ISO 7218) Cũng cần đếm và khẳng định các khuẩn lạc điển hình có kích thước nhỏ hơn.

Chú thích: Vẻ bề ngoài của vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh các khuẩn lạc phụ thuộc vào loại coliform và chất lượng của môi trường.

Cấy khuẩn lạc của từng loại không điển hình vào ống nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng Ủ các ống nghiệm ở 30 o C hoặc 37 o C trong 24 giờ ± 2 giờ Nếu các ống Durham xuất hiện khí, chúng được xác định là có chứa Coliform Kết quả được ghi nhận và đếm trong phép tính.

Dựa trên phân bố Poisson của vi sinh vật trong các chất nền, giới hạn tin cậy của phương pháp này thay đổi từ ± 16% đến ± 52% theo số lượng khuẩn lạc Trên thực tế, sai lệch này có thể còn lớn hơn Trong các nghiên cứu hợp tác khác nhau, độ lệch chuẩn của độ lặp lại (sr) là 0,20 log, trong khi độ lệch chuẩn của độ tái lập (sR) là 0,35 log.

Chi tiết hơn về các giới hạn tin cậy, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

 Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

 Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết.

 Phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này.

Tất cả các thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với những chi tiết bất thường khác, có thể ảnh hưởng đến kết quả.

 Các kết quả thử nghiệm thu được.

 Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 o C.

Cấy một lượng mẫu thử quy định lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc trong các đĩa Petri, với điều kiện sản phẩm ban đầu là dạng lỏng hoặc huyền phù.

Chuẩn bị các đĩa trong cùng một điều kiện và sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu Sau đó, ủ các đĩa ở điều kiện hiếu khí tại nhiệt độ 30°C trong khoảng thời gian từ 18 đến 48 giờ.

Để xác định số lượng B.cereus trong một mililit hoặc một gam mẫu, cần dựa vào số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn Kết quả này phải có ý nghĩa và được xác nhận theo các quy định của phép thử.

3.18.2 Môi trường cấy và thuốc thử

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường khô trong nước và đun nóng nếu cần thiết Điều chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH của môi trường hoàn chỉnh đạt 7,2 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 oC.

Phân phối các lượng 90 ml môi trường vào các bình cầu dung tích thích hợp. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

Hòa tan Polymyxin B sunfat trong nước Lọc để khử trùng.

3.18.2.1.3 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng

Sử dụng trứng gà nguyên vẹn, rửa sạch bằng bàn chải trong dung dịch tẩy rửa, sau đó tráng dưới nước chảy và ngâm trong etanol 95% trong 30 giây rồi để khô Dùng kỹ thuật vô trùng, đập từng quả trứng và tách lòng đỏ, chuyển lòng đỏ vào ống đong vô trùng, thêm bốn phần nước vô trùng Sau đó, chuyển hỗn hợp một cách vô trùng vào bình cầu và khuấy mạnh Đun nóng hỗn hợp trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 44°C đến 47°C trong 2 giờ và để yên.

18 h đến 24 h ở 5 o C ± 3 o C để tạo kết tủa.

Bằng cách vô trùng thu lấy nhũ tương phía trên.

Dung dịch nhũ tương này có thể bảo quản đến 72 h ở 5 o C ± 3 o C.

3.18.2.1.4 Môi trường hoàn chỉnh (thạch MYP)

 Môi trường cơ bản :90 ml.

 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng:10,0 ml

Làm tan chảy môi trường cơ bản và làm nguội trong nồi cách thủy để ở 44 o C đến 47 o C.

Cho các dung dịch còn lại vào, trộn kỹ sau mỗi lần thêm.

Làm nguội môi trường hoàn chỉnh trong nồi cách thủy để ở 44 o C đến 47 o C.

3.18.2.1.5 Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các phần từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh sang các đĩa Petri vô trùng và để cho đông đặc.

Các đĩa có thể được bảo quản đến 4 ngày ở nhiệt độ 5 o C ± 3 o C trước khi làm khô.

Trước khi sử dụng, hãy làm khô các đĩa bằng cách tháo nắp và úp bề mặt thạch xuống Đặt chúng vào tủ sấy hoặc tủ ấm ở nhiệt độ 37°C cho đến khi bề mặt thạch khô hoàn toàn.

3.18.2.2.1 Môi trường cơ bản: Thạch huyết No.2

 Pepton proteoza hoặc pepton tương đương:15 g.

 Sản phẩm thủy phân gan :2,5 g.

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

Phân phối vào các bình cầu và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

3.18.2.2.2 Huyết cừu đã khử sợi huyết (Môi trường hoàn chỉnh)

 Môi trường cơ bản :100 ml

 Huyết cừu đã khử sợi huyết :5 ml đến 7 ml

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ từ 44 o C đến 47 o C, bổ sung huyết cừu đã khử sợi huyết vào môi trường cơ bản Trộn đều.

Rót các phần ít nhất 12 ml môi trường hoàn chỉnh sang các đĩa Petri và để cho đông đặc.

3.18.3.Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần có thể thay thế cho các dụng cụ thủy tinh tái sử dụng nếu chúng đáp ứng các tiêu chuẩn cần thiết.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ sấy hoặc tủ ấm, được thông gió đối lưu, để làm khô các đĩa thạch, có khả năng hoạt động ở 37 o C ± 1 o C và 55 o C ± 1 o C.

 Tủ ấm, có thể làm việc ở 30 o C ± 1 o C.

 Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 44 o C đến 47 o C.

 pH mét, có độ chính xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25 o C.

 Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, hoặc 140 mm, nếu cần.

Pipet chia vạch hiệu chuẩn dành riêng cho vi khuẩn học có dung tích 10 ml và 1 ml, với các vạch chia 0,5 ml và 0,1 ml tương ứng Sản phẩm này được thiết kế với lỗ xả có đường kính từ 2 mm đến 3 mm.

Dụng cụ dàn mẫu là que gạt có đường kính khoảng 3,5 mm và chiều dài 20 cm, được làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo Một đầu của que được uốn thành góc vuông với đoạn dài khoảng 3 cm, và các đầu được làm nhẵn bằng nhiệt để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình sử dụng.

3.18.4.Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này, vì vậy cần tham khảo tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cụ thể Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn riêng, các bên liên quan nên tự thỏa thuận về phương pháp lấy mẫu.

Việc chuẩn bị mẫu thử cần tuân thủ các tiêu chuẩn riêng phù hợp với từng sản phẩm Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể, các bên liên quan có thể tự thỏa thuận để thống nhất về vấn đề này.

3.18.5.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu theo TCVN 6507 (ISO 6887) là bước quan trọng trong quy trình phân tích Đảm bảo rằng các dung dịch pha loãng tiếp theo được thực hiện chính xác để đạt được kết quả đáng tin cậy.

Để tiến hành kiểm tra B.cereus, lấy hai đĩa thạch và sử dụng pipet vô trùng để cho vào mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử, nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù Nếu cần, lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Đối với một số sản phẩm, để ước tính B.cereus với số lượng nhỏ, có thể tăng giới hạn phát hiện lên 10 lần bằng cách kiểm tra 1,0 ml mẫu thử Phân phối 1 ml dịch cấy lên bề mặt của đĩa Petri lớn (140 mm) hoặc lên ba đĩa nhỏ (90 mm) bằng dụng cụ dàn mẫu vô trùng Chuẩn bị cho phép xác định kép với hai đĩa lớn hoặc sáu đĩa nhỏ.

Khi sử dụng que dàn mẫu để phân bố dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch, hãy thực hiện nhanh chóng và cẩn thận để tránh chạm vào các mép đĩa Đảm bảo sử dụng một que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa Sau khi dàn đều, đậy nắp các đĩa lại và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút để chất cấy có thể bám chắc vào thạch.

Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và để 18 h đến 24 h trong tủ ấm ở 30 o C Nếu không thể nhìn thấy rõ các khuẩn lạc thì ủ các đĩa thêm 24 h trước khi đếm.

Sau giai đoạn ủ, chọn các đĩa, tốt nhất là ở hai độ pha loãng liên tiếp, có ít hơn

Phương pháp xác định Staphylococcus aureus

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 4830: 2005 (ISO 6888:1999) Tiêu chuẩn quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đóng vai trò quan trọng trong an toàn thực phẩm Phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase, bao gồm Staphylococcus aureus và các loài khác, thường được thực hiện trên đĩa thạch Việc xác định sự hiện diện của các vi khuẩn này giúp đánh giá nguy cơ ô nhiễm và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.19.1.Phương pháp định lượng Staphylococcus aureus có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch: kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird- Parker

Để tiến hành cấy, hãy đặt mẫu lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa Đối với sản phẩm ở dạng lỏng, sử dụng một lượng mẫu thử quy định; trong khi đó, nếu sản phẩm ở dạng khác, cần dùng một lượng huyền phù ban đầu quy định.

Dưới cùng một điều kiện, tiến hành cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu, sử dụng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng Ủ các đĩa trong môi trường hiếu khí ở nhiệt độ 35C hoặc 37C và kiểm tra kết quả sau 24 giờ và 48 giờ.

Để xác định số lượng Staphylococcus aureus có phản ứng dương tính với coagulase, cần tính toán số lượng khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình trong một mililit hoặc một gam mẫu từ các đĩa ở các bộ phận pha loãng đã chọn Kết quả này phải có ý nghĩa và được xác nhận bằng kết quả thử coagulase dương tính.

3.19.1.2 Môi trường cấy và dịch pha loãng Để làm tăng độ tái lập của kết quả, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh đông khô để chuẩn bị dịch pha loãng Cần tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các hóa chất sử dụng phải đạt chất lượng phân tích và thích hợp để phân tích vi sinh vật.

Nước sử dụng phải là nước cất hoặc có chất lượng tương đương

3.19.1.2.1.1 Môi trường thạch Baird-Parker

Có thể sử dụng môi trường bán sẵn, trong trường hợp này phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7.2 ± 0.2 ở 25C, nếu cần.

Chuyển các lượng 100 ml môi trường vào các bình hoặc các lọ có dung tích thích hợp.

Khử trùng môi trường 15 phút ở 121C.

Hòa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ.

Bột phải dễ tan Nếu có mặt chất không hòa tan màu trắng trong nước thì loại bỏ bột đó.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0.22 àm để khử trựng.

Dung dịch có thể được bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ 3C ± 2C.

Loại bỏ dung dịch, nếu có kết tủa màu trắng.

 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng

Chú thích: Có thể sử dụng dung dịch bán sẵn, nếu có.

Để đảm bảo an toàn khi sử dụng trứng gà tươi, hãy rửa trứng bằng bàn chải trong dung dịch tẩy rửa, sau đó rửa sạch dưới nước chảy Tiếp theo, khử trùng vỏ trứng bằng cách ngâm trong etanol 70% trong 30 giây và để khô tự nhiên, hoặc có thể phun cồn và tiệt trùng bằng ngọn lửa.

Trong điều kiện vô trùng, đập vỡ từng quả trứng và tách lòng đỏ khỏi lòng trắng bằng cách chuyển lòng đỏ qua lại giữa hai nửa vỏ quả Sau đó, cho lòng đỏ vào bình vô trùng, thêm bốn phần nước vô trùng và trộn đều Đun nóng hỗn hợp trong nồi cách thủy ở 47C trong 2 giờ, sau đó để ở nhiệt độ 3C ± 2C từ 18 đến 24 giờ để tạo kết tủa Cuối cùng, trong điều kiện vô trùng, thu phần chất lỏng nổi phía trên và bảo quản trong bình vô trùng để sử dụng.

Dịch nhũ tương này có thể bảo quản ở nhiệt độ 3C ± 2C tối đa 72 h.

Pha loãng bằng nước đến 100 ml.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0.22 àm để khử trựng.

Dung dịch có thể bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ 3C ± 2C.

 Môi trường cơ bản : 100 ml.

 Dung dịch kali telurit : 1.0 ml.

 Nhũ tương lòng đỏ trứng : 5.0 ml

 Dung dịch sulfamezathin (nếu cần) : 2.5 ml

Làm tan chảy môi trường cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy đến khoảng 47C.

Dưới điều kiện vô trùng, thêm hai dung dịch kali telurit và nhũ tương lòng đỏ trứng, đồng thời nếu nghi ngờ có loài Proteus trong mẫu thử, bổ sung dung dịch sulfamezathin Mỗi dung dịch cần được làm ấm ở 47°C trong nồi cách thủy và lắc kỹ sau khi thêm.

Chuẩn bị các đĩa thạch bằng cách đổ một lượng môi trường hoàn chỉnh vào đĩa Petri vô trùng, sao cho độ dày của môi trường thạch đạt khoảng 4 mm, sau đó để cho thạch đặc lại.

Trước khi làm khô, các đĩa có thể được bảo quản đến 24h ở nhiệt độ 3C ± 2C.

Chú thích: Đối với các đĩa sản xuất công nghiệp, cần tuân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất về thời gian bảo quản.

Trước khi sử dụng, hãy làm khô các đĩa bằng cách mở nắp và úp bề mặt thạch xuống dưới Đặt chúng vào tủ ấm với nhiệt độ từ 25C đến 50C cho đến khi các giọt nước trên bề mặt môi trường biến mất.

3.19.1.2.1.2 Môi trường canh thang não – tim (Brain-heart infusion broth)

 Peptone từ mô tế bào động vật : 10.0 g.

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7.4 ± 0.2 ở 25C.

Chuyển các lượng môi trường cấy từ 5 ml đến 10 ml vào ống hoặc lọ có dung tích thích hợp.

Khử trùng môi trường 15 phút ở 121C.

Sử dụng huyết tương thỏ khô có bán sẵn và hồi nước theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Nếu không sẵn có huyết tương thỏ khô, thì pha loãng một thể tích của huyết tương thỏ vô trùng tươi với ba thể tích nước vô trùng.

Khi kali xitrat hoặc natri xitrat được dùng làm chất chống đông vón huyết tương, cần thêm dung dịch EDTA để tạo ra dung dịch 0.1% EDTA trong huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng.

Huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng phải được dùng ngay, trừ khi có quy định của nhà sản xuất.

Trước khi sử dụng, cần kiểm tra mẻ huyết tương với các chủng Staphylococcus aureus dương tính với coagulase và Staphylococcus aureus âm tính với coagulase.

Theo TCVN 6507 – 1:2005, tiêu chuẩn Việt Nam quy định về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, hướng dẫn cách chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Tiêu chuẩn này cũng đề cập đến các dung dịch pha loãng thập phân cần thiết để kiểm tra vi sinh vật, nhấn mạnh các nguyên tắc chung trong quá trình chuẩn bị.

Có thể sử các dụng dịch pha loãng sau:

3.19.1.2.2.1 Dung dịch pha loãng SPW

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0.2 ở 25 o C, nếu cần.

3.19.1.2.2.2 Dung dịch đệm Pepton BPW

 Pepton từ mô động vật : 10.0 g.

Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0.2 ở 25 o C, nếu cần.

Dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần có thể thay thế cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng đáp ứng các tiêu chuẩn cần thiết.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ ấm, để duy trì môi trường đã cấy, các đĩa và ống ở trong dải nhiệt độ 35C ±

 Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 25C ± 1C đến 50C ± 1C.

 Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được nhiệt độ ở 47C ±

Ống nghiệm, bình hoặc lọ có nắp vặn là thiết bị quan trọng trong việc khử trùng và bảo quản môi trường cấy Chúng có dung tích phù hợp để ủ môi trường dạng lỏng, đặc biệt là các ống đựng dung dịch hồng cầu vô trùng và các lọ đáy tròn kích thước khoảng 10 mm x 75 mm.

 Đĩa Petri, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.

 Que cấy thẳng và pipet Pasteur.

 Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0.1 ml, 0.1 ml và 0.5 ml.

 Dụng cụ dàn mẫu, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.

 pH mét, có thể đọc chính xác đến 0.01 đơn vị pH ở 25C, có thể đo chính xác đến ± 0.1 đơn vị pH.

3.19.1.4 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu theo CAC/GL 50 – 2004 Hướng dẫn chung về lấy mẫu.

Chuẩn bị mẫu theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261).

3.19.1.5.1 Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu)

Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Các đĩa Petri được cấy một lượng mẫu thử theo quy định, tùy thuộc vào trạng thái của sản phẩm ban đầu, có thể là dạng lỏng hoặc huyền phù Đối với các đĩa Petri khác, cần sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu trong cùng một điều kiện.

Rót môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật rót đĩa và phủ lên bề mặt bằng chính môi trường đó Sau đó, ủ các đĩa trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ 37°C trong khoảng thời gian 20 giờ ± 2 giờ Cuối cùng, tiến hành định lượng các khuẩn lạc điển hình.

Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu.

3.20.2.Môi trường cấy và thuốc thử

Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 để chuẩn bị và kiểm tra tính năng môi trường cấy.

3.20.2.1 Môi trường thạch sunfit xycloserin (SC)

Chú thích: Loại thạch này được chỉ rõ từ đấu “TSC không chứa lòng đỏ trứng”.

 Dinatri disunfit (Na2S2O5), dạng khan: 1,0 g.

Để chuẩn bị môi trường, hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi và điều chỉnh pH đạt 7,6 ± 0,2 ở 25°C Phân phối môi trường cơ bản vào các bình hoặc chai phù hợp và khử trùng trong 15 phút ở nồi hấp áp lực với nhiệt độ 121°C Sau khi khử trùng, bảo quản môi trường trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5°C ± 3°C và chỉ sử dụng trong vòng 2 tuần sau khi chuẩn bị.

Trong một số trường hợp, cần chuẩn bị các đĩa môi trường cơ bản thạch SC để kiểm tra tính di động và môi trường nitrat Để thực hiện, chuyển khoảng 15 ml môi trường cơ bản đã làm tan chảy và làm nguội đến 44°C - 47°C vào các đĩa Petri và để đông đặc Đảm bảo làm khô đĩa ngay trước khi sử dụng.

 D-Xycloserin (chỉ sử dụng bột tinh thể trắng) : 4,0 g.

Hòa tan D-xycloserin trong nước và lọc dung dịch để khử trùng Bảo quản trong tủ lạnh ở 3°C ± 2°C.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị.

Trước khi áp dụng phương pháp rót đĩa, hãy làm nguội 100 ml môi trường cơ bản tan chảy vô trùng đến nhiệt độ từ 44°C đến 47°C, sau đó thêm 1 ml dung dịch D-xycloserin.

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1  0,2 ở 25 o C.

Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

Trước khi sử dụng, môi trường này phải được khử khí.

3.20.2.3 Môi trường lactoza sunfit (LS)

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi (nếu cần) Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 ± 0,2 ở 25°C.

Phân phối vào các ống nghiệm có ống Durham mỗi ống 8 ml môi trường và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C

Môi trường này có thể bảo quản đến 4 tuần ở 3°C ± 2°C

 Dinatri disunfit (Na2S2O5), dạng khan: 1,2 g.

Hòa tan dinatri disunfit trong nước và lọc để khử trùng Sử dụng dung dịch trong ngày.

3.20.2.3.3 Dung dịch amoni sắt (III) citrat

Hòa tan amoni sắt (III) xitrat trong nước và lọc để khử trùng Sử dụng dung dịch trong ngày.

Trước khi kết thúc quá trình chuẩn bị, nếu môi trường không được sử dụng trong ngày, cần khử khí bằng cách đun nóng và làm nguội nhanh Nếu môi trường được chứa trong các chai có nắp vặn, hãy nới lỏng nắp trước khi gia nhiệt và vặn chặt lại ngay trước khi làm nguội.

Cứ 8 ml môi trường cơ bản thì bổ sung 0,5 ml dung dịch dinatri disunfit và 0,5 ml dung dịch amoni sắt (III) citrat.

Sử dụng dung dịch hoàn chỉnh trong ngày.

3.20.2.4 Môi trường nitrat để thử tính di động

 Dinatri hidro octophosphat (Na2HPO4): 2,5 g.

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25°C

Chuyển môi trường vào các ống cấy với dung tích 10 ml và khử trùng trong 15 phút ở 121°C trong nồi hấp áp lực Nếu không sử dụng ngay, bảo quản trong tủ lạnh ở 5°C ± 3°C Trước khi sử dụng, làm nóng môi trường bằng cách cách thủy hoặc bằng hơi nước trong 15 phút và nhanh chóng làm nguội đến nhiệt độ ủ.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị.

3.20.2.5 Thuốc thử để phát hiện nitrit

3.20.2.5.1 Dung dịch axit 5-Amino-2-naphthalenesunfonic (5-2-ANSA)

Hòa tan 0,1 g 5-2-ANSA trong 100 ml dung dịch axit axetic 15 % (phần khối lượng) Lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 5°C ± 3°C.

Hòa tan 0,4 g axit sunfanilic trong 100 ml dung dịch axit axetic 15 % (phần khối lượng) Lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 5°C ± 3°C.

3.20.2.5.3 Chuẩn bị thuốc thử hoàn chỉnh

Trước khi sử dụng, trộn lẫn hai dung dịch với các lượng bằng nhau Loại bỏ ngay thuốc thử không sử dụng.

3.20.2.6 Bụi kẽm - Môi trường lactoza-gelatin

Hòa tan các thành phần trong nước, trừ lactoza và phenol đỏ Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,5  0,2 ở 25°C.

Bổ sung lactoza và phenol đỏ vào ống nghiệm với lượng 10 ml, sau đó khử trùng trong nồi hấp áp lực ở 121°C trong 15 phút Nếu không sử dụng ngay trong ngày, cần bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C trong tủ lạnh.

Ngay trước khi sử dụng, đun nóng trong nồi cách thủy hoặc thổi bằng hơi nước trong 15 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ ủ.

Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 3 tuần sau khi chuẩn bị.

3.20.3.Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 37°C ± 1°C.

 Bình không khí cải biến, hoặc các dụng cụ thích hợp khác để cấy kỵ khí.

 pH mét, có thể đọc chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH ở 25°C, có thể cho các phép đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH.

Cấy vòng được thực hiện bằng vật liệu platin-iridi hoặc niken-crôm, có đường kính khoảng 3 mm Các kim cấy sâu cũng sử dụng cùng loại vật liệu hoặc các que cấy vòng và kim cấy vô trùng dùng một lần với chất lượng tương đương.

 Dụng cụ lọc, để khử trùng các dung dịch.

 Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp, cụ thể là các ống nghiệm

16 mm x 160 mm có các ông Durham lộn ngược, ví dụ: dài 35 mm và đường kính 7 mm.

 Pipet hoặc micropipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng.

 Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính 90 mm đến 100 mm.

 Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có thể hoạt động ở 44 o C đến 47 o C và ở

 Bầu cao su, để sử dụng với pipet chia độ khi phân phối các thành phần của thuốc thử phát hiện nitrit (nếu cần).

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này, vì vậy cần tham khảo tiêu chuẩn riêng cho từng sản phẩm Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn, các bên liên quan nên thỏa thuận về phương pháp lấy mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được mẫu đại diện, đảm bảo không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

3.20.5.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm.

3.20.5.2 Cấy và ủ (kỹ thuật rót đĩa)

Sử dụng pipet vô trùng, cho 1 ml mẫu thử vào mỗi đĩa Petri nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu vào giữa hai đĩa Petri trống.

Để tiến hành thí nghiệm, rót từ 10 ml đến 15 ml thạch SC vào mỗi đĩa và duy trì nhiệt độ từ 44°C đến 47°C trong nồi cách thủy Sau đó, trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa Khi môi trường đã đông đặc, phủ thêm một lớp dày 10 ml thạch SC và để cho đông đặc lại Tiếp theo, đặt các đĩa vào bình môi trường cải biến hoặc vật đựng thích hợp, ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37°C trong khoảng 20 giờ ± 2 giờ Lưu ý rằng thời gian ủ kéo dài có thể làm cho các đĩa bị quá đen.

Tiến hành quy trình tương tự đối với các dung dịch pha loãng đã chuẩn bị.

3.20.5.3 Đếm và chọn các khuẩn lạc

Sau khi hoàn thành giai đoạn ủ, hãy chọn tất cả các đĩa có chứa dưới 150 khuẩn lạc Từ những đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.

Chọn năm khuẩn lạc tiêu biểu và xác định chúng bằng kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS hoặc kỹ thuật khẳng định với môi trường nitrat để kiểm tra tính di động Đồng thời, sử dụng môi trường lactoza-gelatin để hỗ trợ trong quá trình xác định.

3.20.5.4.1 Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS

Phản ứng đặc trưng của C.perfringens và C.absonum trong môi trường lactoza sunfit khi ủ ở 46 °C cho thấy rằng không cần xác nhận sự thuần khiết của các khuẩn lạc màu đen từ môi trường thạch trước khi chuyển sang môi trường thioglycolat và cấy vào môi trường thạch lactoza sunfit.

Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycollat lỏng Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 18 h đến 24 h.

Sau khi ủ, dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolat sang môi trường LS Ủ trong các điều kiện hiếu khí ở 46°C trong 18 h đến

Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

Tiêu chuẩn cơ sở: TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002) Tiêu chuẩn Quốc gia về

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch.

Salmonella có thể tồn tại với số lượng nhỏ và thường đi kèm với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae hoặc các họ khác Vì vậy, việc tăng sinh sơ bộ là cần thiết để đảm bảo phát hiện được lượng nhỏ Salmonella hoặc các chủng Salmonella có hoạt tính suy giảm.

Qui trình phát hiện Salmonella cần qua bốn giai đoạn kế tiếp nhau:

Hình 3.1 : Quy trình phát hiện Salmonella

3.21.1.2 Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc

Cấy phần mẫu thử trong dung dịch đệm pepton ở nhiệt độ phòng, sau đó ủ ở

Nhiệt độ 37°C ± 1°C trong khoảng thời gian 18h ± 2h là điều kiện tối ưu cho một số loại thực phẩm nhất định Đối với số lượng lớn, cần làm nóng dung dịch đệm pepton đến 37°C ± 1°C trước khi tiến hành cấy mẫu thử.

3.21.1.3 Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Cấy dịch tăng sinh chọn lọc thu được vào môi trường Rappaport-Vassiliadis với đậu tương (môi trường RVS) và môi trường Tetrathionat/novobioxin muller- kauffmann (môi trường MKTTn).

Môi trường RVS được ủ ở 41,5°C ± 1°C trong 24 h  3 h và môi trường MKTTn được ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 h ± 3 h.

3.21.1.4 Đổ đĩa và nhận dạng

Cấy dịch tăng sinh thu được vào hai môi trường đặc chọn lọc:

 Thạch deoxycholat lyzin xyloza(thạch XLD).

Môi trường đặc chọn lọc bổ sung cho thạch XLD rất phù hợp để phân lập các chủng Salmonella, bao gồm Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi dương tính với lactose, vì vậy phòng thử nghiệm có thể lựa chọn sử dụng môi trường này.

Thạch XLD được ủ ở 37°C  1°C và được kiểm tra sau 24 h  3 h Môi trường thạch chọn lọc thứ hai được ủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Chú thích: Để tham khảo thạch Brilliant green (BGA), thạch bitsmut sunfit, v.v có thể được sử dụng làm môi trường đổ đĩa thứ hai.

3.21.1.5 Khẳng định để nhận dạng

Các khuẩn lạc Salmonella được cấy truyền và sau đó được đổ lên đĩa, sau đó được khẳng định để nhận dạng thông qua các phép thử sinh hóa và huyết thanh phù hợp.

3.21.2 Môi trường cấy, thuốc thử và huyết thanh

3.21.2.1 Yêu cầu chung Đối với thực hành của phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218),ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 về việc chuẩn bị, pha chế và thử tính năng của môi trường cấy.

3.21.2.2 Môi trường cấy và thuốc thử

3.21.2.2.1 Môi trường tăng sinh sơ bộ không chọn lọc: dung dịch đệm pepton

 Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na2HPO4.12H2O): 9,0 g.

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : 1,5 g.

 Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần.

 Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

 Phân phối môi trường vào các bình có dung tích thích hợp để thu được phần cần thiết cho thử nghiệm.

 Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

3.21.2.2.2 Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ nhất: Môi trường Rappaport-

Vassiliadis với đậu tương (môi trường RVS).

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : 1,4 g.

Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng đến khoảng 70°C, nếu cần.

Dung dịch này phải được chuẩn bị trong ngày cùng với việc chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh RVS.

 Magie clorua ngậm 6 phân tử nước (MgCI2.6H2O) : 400,0 g.

Hoà tan magie clorua trong nước.

Do muối MgCl2.6H2O có khả năng hút ẩm mạnh, cần hòa tan hoàn toàn lượng muối này ngay sau khi mở hộp Cụ thể, với 250 g MgCl2.6H2O, bạn cần thêm 625 ml nước, tạo ra dung dịch có tổng thể tích 788 ml và nồng độ khối lượng khoảng 31,7 g trên 100 ml MgCl2.6H2O.

Dung dịch có thể được giữ trong lọ thuỷ tinh tối màu có nắp đậy kín ở nhiệt độ phòng ít nhất 2 năm.

Hoà tan oxalat xanh malachit trong nước.

Dung dịch này có thể được giữ trong lọ thuỷ tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 8 tháng.

Cho 100 ml dung dịch B và 10 ml dung dịch C vào 1000 ml dung dịch A Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 5,2 ± 0.2, nếu cần.

Phân phối các lượng 10 ml vào các ống thử nghiệm trước khi sử dụng Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 115°C.

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở 3°C  2°C, sử dụng môi trường chuẩn bị trong ngày.

Thành phần môi trường cuối cùng bao gồm: 4,5 g/l pepton từ đậu tương, 7,2 g/l natri clorua, 1,44 g/l kali dihydro phosphat (KH2PO4 + K2HPO4), 13,4 g/l magie clorua khan (MgCl2) hoặc 28,6 g/l magie clorua ngậm 6 phân tử nước (MgCl2.6H2O), và 0,036 g/l oxalat xanh malachit.

3.21.2.2.3 Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai: Môi trường Novobioxin tetrathionat Muller-Kauffmann (Môi trường MKTTn)

 Natri thiosulfat ngậm 5 phân tử nước (Na2S2O3.5H2O): 47,8 g.

 Mật bò dùng cho vi khuẩn học : 4,78 g.

Hoà tan các thành phần cơ bản khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi trong 5 phút.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 8,0 ± 0,2 ở 25°C nếu cần.

Môi trường cơ bản có thể bảo quản được trong 4 tuần ở 3 o C ± 2°C.

Hoà tan hết kali iodua trong 10 ml nước, sau đó thêm iot và pha loãng bằng nước vô trùng đến 100 ml Không đun nóng.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong vật chứa kín, tối màu để ở nhiệt độ phòng.

Hoà tan muối natri novobioxin trong nước và lọc để khử trùng.

 Môi trường cơ bản : 1000 ml.

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho 5 ml dung dịch novobioxin vào 1000 ml môi trường cơ bản Trộn, sau đó thêm 20 ml dung dịch novobioxin Trộn kỹ.

Phân phối môi trường một cách vô trùng vào các bình vô trùng có dung tích thích hợp để thu được các phần cần thiết cho thử nghiệm.

Sử dụng môi trường hoàn chỉnh chuẩn bị trong ngày.

3.21.2.2.4 Môi trường đổ đĩa đặc chọn lọc

 Môi trường thứ nhất: Thạch deoxycholat lyzin xyloza (thạch XLD)

Để hòa tan các thành phần cơ bản khô hoặc hoàn chỉnh, hãy đun nóng nước và khuấy liên tục cho đến khi hỗn hợp bắt đầu sôi, đồng thời cần tránh hiện tượng quá nhiệt.

Chỉnh pH của môi trường cơ bản về 7,4 ± 0,2 ở 25°C nếu cần thiết Sau đó, rót môi trường vào các ống hoặc bình phù hợp Đun nóng và khuấy liên tục cho đến khi môi trường sôi và thạch hoàn toàn hòa tan, chú ý không để quá nhiệt.

 Chuẩn bị các đĩa thạch

Chuyển ngay vào nồi cách thuỷ ở 44°C đến 47°C, khuấy và rót vào các đĩa Để cho đông đặc

Trước khi sử dụng, hãy làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận bằng cách tháo nắp và úp bề mặt thạch xuống Sau đó, cho vào lò sấy ở nhiệt độ từ 37°C đến 55°C cho đến khi bề mặt thạch khô hoàn toàn.

Bảo quản các đĩa đã rót đến 5 ngày ỏ 3°C  2°C.

Việc lựa chọn môi trường thích hợp cho phòng thử nghiệm là quyền của từng đơn vị Cần tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn của nhà sản xuất trong quá trình chuẩn bị môi trường để đảm bảo hiệu quả sử dụng.

Hoà tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Chuyển môi trường cấy vào trong các ống hoặc bình có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

 Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng:

Chuyển 15 ml môi trường nấu chảy vào các đĩa Petri vô trùng, sau đó đặt vào nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 44°C đến 47°C Khuấy đều và rót vào các đĩa, sau đó để cho môi trường đông đặc.

Trước khi sử dụng, hãy làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận bằng cách tháo nắp và úp bề mặt thạch xuống Đặt chúng vào lò sấy ở nhiệt độ từ 37°C đến 55°C cho đến khi bề mặt thạch hoàn toàn khô.

Bảo quản các đĩa đã rót đến 5 ngày ỏ 3°C  2°C.

3.21.2.2.6 Thạch TSI (triple sugar/iron agar)

Hoà tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 o C, nếu cần.

Phân phối môi trường các lượng 10 ml vào các ống nghiệm hoặc các đĩa.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C. Đặt nghiêng để thạch có bề dày trên đáy từ 2,5 cm đến 5 cm.

 Kali dihydro phosphat (KH2PO4): 2,0 g.

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản khô trong nước và đun nóng nếu cần thiết Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng đạt 6,8 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần thiết.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

Hoà tan urê trong nước Lọc để khử trùng và kiểm tra độ vô trùng

 Môi trường cơ bản: 950 ml.

Chuẩn bị dung dịch urê trong điều kiện vô trùng bằng cách cho vào môi trường cơ bản đã được làm tan chảy, sau đó để nguội đến nhiệt độ từ 44°C đến 47°C.

Phân phối các lượng 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào trong các ống vô trùng. Đặt nghiêng ống nghiệm.

3.21.2.2.8 Môi trường L-Lyzin khử cacboxyl

Hoà tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Chuyển các lượng môi trường từ 2 ml đến 5 ml vào các ống cấy hẹp có nắp vặn. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

3.21.2.2.9 Thuốc thử phát hiện  -galactosidaza

Hoặc sử dụng các đĩa giấy làm sẵn theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

 Natri dihydro phosphat (NaH2PO4): 6,9 g.

 Natri hydroxit, dung dịch 10 mol/l : khoảng 3 ml.

Hoà tan natri dihydro phosphat trong khoảng 45 ml nước đựng trong bình định mức Dùng dung dịch natri hydroxit để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25°C.

Thêm nước vừa đủ 50 ml.

Hoà tan ONPG trong nước ở khoảng 50°C Làm nguội dung dịch.

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG.

3.21.2.2.10 Thuốc thử phản ứng Voges-Proskauer (VP)

Hoà tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,9 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Chuyển các lượng môi trường 3 ml vào các ống nghiệm.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

 Creatin ngậm 1 phân tử nước: 0,5 g.

Hòa tan creatin ngậm 1 phân tử nước trong nước.

 Dung dịch 1-Naphthol trong cồn

 Etanol, 96% ( phần thể tích): 100 ml.

Hoà tan 1-naphtol trong etanol.

Hoà tan kali hydroxit trong nước.

3.21.2.2.11 Thuốc thử phản ứng indol

Hoà tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,5 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần

Phân phối các lượng 5 ml môi trường vào một số ống nghiệm.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 o C.

 Axit clohydric, p = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml: 25 ml.

Trộn đều các thành phần trên.

3.21.2.2.12 Thạch dinh dưỡng nửa đặc

Hoà tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Chuyển môi trường vào các bình có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.

 Chuẩn bị các đĩa thạch:

Rót các lượng khoảng 15 ml môi trường mới chuẩn bị vào các đĩa Petri nhỏ vô trùng Không để cho các đĩa thạch bị khô.

3.21.2.2.13 Dung dịch muối sinh lý

Hòa tan natri clorua trong nước Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Phân phối các lượng dung dịch vào trong các bình hoặc các ống sao cho sau khi khử trùng mỗi bình hoặc ống chứa từ 90 ml đến 100 ml.

Khử trùng trong 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°C.