Vật liệu – nội dung, phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Nụ hoa hòe đươcg̣ thu hái taịThái Bıợ̀nh (huyện Đông Hưng, xã Đông Xuân) vào tháng 9-10 năm 2017, sau đóđươcg̣ sấy khô ởnhiêṭđô g̣50 o C, nghiền.
Dụng cụ và hóa chất
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Dụng cụ
May cô quay chân không Rotovapor ı́May sấy đông khô Modul yo – D ı́Máy lắc ổn nhiệt
Máy li tâm (Mikro 2204 Hettich)
Máy voltex (Maxit mix II)
Bể ổ nhiệt(Schutzart DIN EN 60529-IP 20)
May sắc ký lỏng hiêụnăng cao HPLC ı́
Dụng cụ: Ống eppendort 1,5ml và ống eppendorf 2ml, pipet 100àl và 1000àl, cốc đong, ống đong, buret, đĩa peptri.
Chemical products originating from Germany include acetronitrile, ethanol, methanol, carbon tetrachloride, distilled water, ultrafiltered water, DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine Serum), and Penicillin/Streptomycin.
Phòng thí nghiệm bộ môn hóa sinh khoa CNTP, phòng thí nghiệm trung tâm khoa CNTP, phòng thí nghiệm khoa Cơ điện.
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Nôi dung 1: Xác định được hàm lượng rutin trong nguyên liệu hoa hòe
-Địa điểm thu hoa hòe tại Thái Bình: huyện Đông Hưng, xã Đông Xuân.
-Chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng rutin trong nguyên liệu.
3.3.2 Nội dung 2: Tinh sạch và xác định được hàm lượng rutin trong bột rutin tinh sạch
Quá trình tinh sạch rutin được thực hiện bằng cách chiết xuất từ hoa hòe sử dụng dung môi MeOH và kết tủa với H2SO4, theo phương pháp được mô tả bởi Dansh et al (2014).
-Tỷ lệ bột rutin tinh sạch thu được;
-Hàm lượng rutin trong bột rutin (độ tinh sạch).
3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính sinh học của rutin tinh sạch
- Khả năng kháng oxi hóa:
+ Khả năng kháng oxi hóa được đánh giá dựa trên khả năng làm mất màu DPPH của rutin tinh sạch ở cỏc nồng độ: 20, 30, 35, 40, 45 àg/ml
+ So sánh khả năng kháng oxi hóa của vitamin C ở các nồng độ:
+ Tỷ lệ ức chế DPPH
+ Giá trị IC 50 của bột rutin tinh sạch và vitamin C
- Đánh giá khả năng kháng khuẩn:
Khả năng kháng khuẩn được xác định qua sự hình thành vòng kháng khuẩn của vi khuẩn E.Coli và Salmonella khi tiếp xúc với các nồng độ rutin tinh khiết.
+ Rutin tinh sạch: 400 àg/ml.
+ Rutin tinh sạch: 600 àg/ml.
+ Rutin tinh sạch: 800 àg/ml.
+ Rutin tinh sạch: 1000 àg/ml.
Theo dõi sự hình thành vòng kháng khuẩn của các nồng độ sau 20 giờ
Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng viêm và độc tính tế bào thông qua việc ức chế sản sinh khí NO ở tế bào RAW 264.7, cũng như tỷ lệ sống sót của tế bào trong môi trường MTT sau 24 giờ, theo các điều kiện cụ thể đã được thiết lập (G.C Gurtner et al., 2008).
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT (đối chứng)
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT, bổ sung LPS
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT, bổ sung LPS, bổ sung rutin 30àg/ml
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT, bổ sung LPS, bổ sung rutin 100àg/ml
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT, bổ sung LPS, bổ sung Cardamonin 0,3àM/ml (đối chứng dương 1)
+ Tế bào RAW 264.7 nuôi cấy trong môi trường nhân tạo MTT, bổ sung LPS, bổ sung Cardamonin 3àM/ml (đối chứng dương 2)
3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung rutin từ bột hoa hòe và rutin tinh sạch đến chất lượng cảm quan và hàm lượng rutin của sản phẩm cốm.
Cốm giàu rutin được sản xuất bởi Công ty cổ phần Biofile, sử dụng bột hoa hòe với tỉ lệ 40g và 50g cùng với rutin tinh khiết 4g và 5g cho mỗi 500g sản phẩm.
+ Chất lương cảm quan: Màu sắc, mùi, vị, trạng thái.
+ Hàm lượng rutin trong trong sản phẩm
Phương pháp nghiên cứu
Hoa hòe được thu hái tại tỉnh Thái Bình, sau đó chọn nụ hoa và sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C Sau khi sấy, hoa hòe được nghiền nhỏ để thu bột, tiếp tục sử dụng để tinh sạch hoa hòe.
3.4.2 Phương pháp tinh sạch rutin
Quátrình tinh sạch rutin được trình bày theo quy trình sau:
Bột hoa hòe khô được đóng gói trong túi giấy lọc 15g và được chiết xuất bằng phương pháp soxhlet với 200ml methanol cho đến khi dung môi mất màu.
Sau bốn lần chiết, dịch lọc được cô quay để giảm bớt dung môi Tất cả dung dịch sau khi cô quay được cho vào bình, tiếp theo là thêm 100ml dung dịch CCl4 và khuấy nhẹ Cuối cùng, thêm 100ml nước cất vào bình và để yên cho dung dịch tách lớp.
Lớp dưới của dung dịch là CCl4 màu vàng đen trong, trong khi lớp trên là MeOH và nước có màu vàng sữa đục Sau khi tách lớp trên, thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc và để lạnh kết tinh qua đêm Lọc và rửa kết tủa nhiều lần bằng nước cất, sau đó sấy ở 95°C để thu được rutin tinh sạch dạng bột màu vàng hơi xanh Rutin này được sử dụng để đánh giá đặc tính sinh học và làm nguyên liệu sản xuất sản phẩm cốm.
3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng rutin
Nội dung rutin trong hoa hòe, bột rutin tinh khiết và sản phẩm cốm được xác định bằng phương pháp HPLC theo hướng dẫn của Tapan Seal (2016) với một số điều chỉnh nhỏ.
Chiết xuất rutin từ hoa hòe được thực hiện bằng cách sấy hoa hòe ở 50 độ C, sau đó nghiền thành bột và hòa trộn với 500 ml Ethanol 70% Quá trình chiết lắc diễn ra trong 4 giờ ở nhiệt độ 37-40 độ C với tốc độ 150 vòng/phút Cuối cùng, mẫu chiết xuất được phân tích bằng hệ thống HPLC để xác định hàm lượng rutin trong nguyên liệu hoa hòe ban đầu.
Chuẩn bị mẫu xác định rutin từ bột rutin tinh sạch bằng phương pháp soxhlet theo tác giả Darshan và công sự (2014) đã thu được bột rutin tinh sạch có màu vàng xanh Hàm lượng rutin trong bột này được xác định thông qua hệ thống HPLC.
- Chiết xuất rutin từ cốm sản phẩm: Sản phẩm sau khi được sấy tại nhiệt độ
Trong 2 ngày, sản phẩm được xử lý ở nhiệt độ 50 độ C và sau đó nghiền thành bột mịn Bột này được chiết xuất bằng dung môi EtOH 70% nhằm xác định hàm lượng rutin có trong sản phẩm cốm thu được.
Để chuẩn bị dung dịch rutin chuẩn, cân 0.0326g rutin vào ống eppendorf 2ml và thêm 1ml EtOH 70%, thu được rutin chuẩn với nồng độ 3.26mg/ml Tiếp theo, pha loãng dung dịch này 10 lần bằng Ethanol 70% để đạt được nồng độ 1.63mg/ml Sau đó, tiếp tục pha loãng dung dịch 1.63mg/ml thêm 2 lần nữa để có nồng độ 0.815mg/ml Cuối cùng, tiến hành phân tích các dung dịch ở ba nồng độ trên bằng máy HPLC.
Phân tích các hợp chất hữu cơ và hợp chất thứ cấp được thực hiện dựa trên ứng dụng của Shimadzu (Nhật Bản) và Agilent (Mỹ) Dịch thu được sẽ được bơm vào cột C18 Ascentis để tiến hành phân tích.
- Thành phần các pha đông:g̣
+ Tốc đô g̣dòng: 1ml/phút
- Chương trình tách (pha đông)g̣
Hình 3.1 Tương quan giữa nồng độ rutin và Diện tích phổ
3.4.4 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học của rutin tinh sạch từ hoa hòe
3.4.4.1 Phương pháp xác định khả năng kháng oxi hóa
Khả năng kháng oxi hóa được xác định bằng phương pháp DPPH theo mô tả của (Tabart et al., 2009).
DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl) là một gốc tự do có màu tím, với độ hấp thụ quang cực đại tại Amax = 517nm Khi dung dịch chứa chất chống oxi hóa được thêm vào dung dịch DPPH, màu tím của gốc tự do sẽ giảm dần; mức độ nhạt màu tương ứng với khả năng kháng oxi hóa cao hơn Nhờ vào khả năng làm mất màu tím của gốc tự do DPPH, ta có thể xác định khả năng kháng oxi hóa của rutin tinh khiết chiết xuất từ hoa hòe.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: sử dụng MeOH 99,5%
Để chuẩn bị dịch chiết, cân 0,01g bột rutin tinh sạch từ hoa hòe và thêm 1ml MeOH 99,5%, sau đó vortex cho bột rutin tan hoàn toàn Dịch thu được được pha loãng 10 lần với MeOH 99,5%, tạo thành các nồng độ khác nhau để thử nghiệm khả năng kháng oxi hóa của bột rutin tinh sạch.
Để chuẩn bị dung dịch vitamin C, cân 0,01g bột vitamin C và hòa tan trong 1ml nước cất Sau đó, pha loãng dung dịch này 10 lần với nước để tạo thành dung dịch A Tiếp theo, pha loãng dung dịch A để đạt nồng độ 250 µg/ml.
+ 750àl nước) Lấy dịch đú đi pha thành cỏc nồng độ tiếp theo rồi xỏc định khả năng kháng oxi hóa.
-Cân 50,03mg DPPH cho vào ống falcon 15ml.
Pha 251,5ml methanol (MeOH) trong lọ tối màu để tạo ra dung dịch DPPH với nồng độ 0,2 mg/ml Lắc đều dung dịch trong 30 phút cho đến khi DPPH hoàn toàn tan, sau đó bảo quản trong tủ lạnh.
Để chuẩn bị dung dịch DPPH 0,02mg/ml, cho 50ml DPPH 0,2mg/ml vào 450ml MeOH trong lọ 500ml tối màu Sau đó, điều chỉnh thể tích lên 500ml bằng MeOH và lắc đều trong 10 phút để thu được dung dịch.