Khảo Sát Sơ Bộ Thành Phần Hóa Học Và Đánh Giá Một Số Hoạt Tính Sinh Học Trong Tơ Nấm Linh Chi Đen

21 2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau.. Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG

TP Hồ Chí Minh, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG

TP Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dựa trên cơ sở thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới

Tp Hồ Chí Minh Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác

TP HCM, ngày 20 tháng 8, năm 2015

Trần Lê Việt Hà

Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hoàng Dũng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án cũng như lúc viết bài báo cáo, để hôm nay

em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nhất của mình

Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn cùng làm việc tại phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công việc một cách tốt nhất

Con vô cùng cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con trong suốt quá trình học tập Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 đã hỗ trợ, chia sẻ việc học tập trong thời gian 4 năm Đại học

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 1

3 Mục đích nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 3

7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Nấm linh chi 5

1.1.1 Khái quát chung 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học 6

1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi 8

1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 8

1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi 13

1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 16

1.2.1 Vị trí phân loại 16

1.2.2 Đặc điểm hình thái 17

1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3.1 Thiết bị 20

2.3.2 Hóa chất 20

2.3.3 Môi trường sử dụng 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng 21

2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A subresinosum 21

2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau 25

2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 29

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 31

3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng 31

3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A subresinosum 33

3.2.1 Định tính anthraglycosid 33

3.2.2 Định tính flavonoid 33

3.2.3 Định tính acid béo 34

3.2.4 Định tính alkaloid 35

3.2.5 Định tính tinh dầu 36

3.2.6 Định tính carotenoid 36

3.2.7 Định tính phytosterol 36

3.2.8 Định tính steroid 37

3.2.9 Định tính tanin 38

3.2.10 Định tính đường khử 38

3.2.11 Định tính antocyanosid 39

3.2.12 Định tính saponin 40

3.2.13 Định tính acid uronic 41

3.2.14 Định tính acid hữu cơ 41

3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen 44

3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol 44

3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng 45

3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum 47

3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi 47

3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết 49

3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 55

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DMSO : Dimethylsunfoxide

DPPH : 2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl

HPLC : High-performance liquid chromatography

IC50 : The half maximal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50%)

LB : Luria Bertani

MeOH : Methanol

OD : Optical Density

PDA : Potato Dextrose Agar

PD-broth : Potato Dextrose Broth

UV : Ultra Violet

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi 8

Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi 10

Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) 13

Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen 31

Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết 42

Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi 43

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên 44

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được 46

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch 47

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được 50

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được 51

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được 52

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được 53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi 7

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi 7

Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum (Corner, 1993) 17

Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum 19

Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc 22

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen 26

Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 28

Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform 30

Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước 30

Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng 32

Hình 3.2 Định tính anthraglycosid 33

Hình 3.3 Định tính flavonoid 33

Hình 3.4 Định tính acid béo 34

Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 35

Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat 35

Hình 3.7 Định tính carotenoid 36

Hình 3.8 Định tính phytosterol 36

Hình 3.9 Định tính steroid 37

Hình 3.10 Định tính tanin 38

Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun 38

Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun 39

Hình 3.13 Định tính antocyanosid 39

Hình 3.14 Định tính saponin 40

Hình 3.15 Định tính acid uronic 41

Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ 41

Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH 45

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được 46

Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane 48

Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform 48

Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate 49

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được 50

Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được. 51

Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được. 52

Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được 53

Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết 54

Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm 55

Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm 56

Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm 57

Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm 58

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương” Đến đời Minh (năm 1590) trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan…

Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi… Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi vẫn đang được chú trọng Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch quả thể

nấm Linh chi tốn khá nhiều thời gian Amauroderma subresinosum là một loại nấm

Linh chi đen thường thấy ở các rừng quốc gia Việt Nam Đây là một loại nấm hiếm

trong họ Ganodermataceae, hoạt tính của A subresinosum hiện nay vẫn chưa được

nghiên cứu thấu đáo Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu “Khảo sát

sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm

Linh chi đen Amauroderma subresinosum” để nâng cao hiệu quả sản xuất hoạt tính

cần thiết của nấm Linh chi mà không cần chờ thời gian ra quả thể, đáp ứng nhanh nhu cầu sử dụng của con người

2 Tình hình nghiên cứu

❖ Ngoài nước

Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Linh chi cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau

Trong một nghiên cứu của Mekkaway, Min và cộng sự (1998) cho biết Ganoderiol F, ganodermanontriol, acid ganoderic beta, ganodermanondiol, ganoderma nontriol, acid ganolucidic A, gucidumol B có trong dịch chiết nước của Linh chi có tác dụng chống HIV và còn nhiều ứng dụng có lợi khác của nấm Linh chi

Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự, nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn

dịch từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum có khả năng chữa lành nhanh vết thương

sau khi phẫu thuật điện ở mô gan chuột

❖ Trong nước

Những năm gần đây, tại Việt Nam, trên thị trường thuốc y học cổ truyền dân tộc

cả nước, đặc biệt tại TP.HCM, xuất hiện nhiều loại thuốc mới mang tên Linh chi với giá bán rất đắt (mắc hơn nhân sâm) Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu ngày càng tăng Nhiều cơ sở đã tiến hành chế biến nuôi trồng, nghiên cứu thăm dò những dược chất có trong nấm Linh chi

Một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu

tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở

chuột cống” [15],“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam

(Ganoderma lucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh,

Đào Văn Phan), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao”

(Đoàn Suy Nghĩ) [4], “Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma

subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh

Khang) [13]

3 Mục đích nghiên cứu

Nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma

subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân

đoạn cao chiết

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm

Linh chi A.subresinosum

5 Phương pháp nghiên cứu

- Tăng sinh tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối

- Thu dịch chiết tơ nấm để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi

- Dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để khảo sát khả năng kháng khuẩn của tơ nấm với các phân đoạn dung môi khác nhau

- Dùng phương pháp thử nghiệm DPPH để khảo sát khả năng chống oxy hóa của

tơ nấm Linh chi A.subresinosum

- Ghi chép và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, Statgraphics centurion

6 Các kết quả đạt được của đề tài

- Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày trong điều kiện nhiệt độ 30oC và đặt nơi tránh ánh sáng

- Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì

có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ,…

- Trong các phân đoạn chiết của tơ nấm, cao Methanol được đánh giá có khả năng

kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli,

P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml cũng như khả năng bắt gốc tự do IC50 là 1,094 mg/ml

- Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm

có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa

của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất

- Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định được

7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp

Đồ án gồm có 4 chương:

• Chương 1: Tổng quan tài liệu

• Chương 2: Vật liệu và phương pháp

• Chương 3: Kết quả và thảo luận

• Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm linh chi

1.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganodermataceae, người miền Bắc xưa còn

gọi là nấm lim Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…[8]

Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen Mặt dưới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu

▪ Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

▪ Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

▪ Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)

▪ Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

▪ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

▪ Tử chi (Linh chi tím) Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm Chúng đã được sử dụng

là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,

đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp [17]

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác 1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” [2], giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược

(1720-1.1.2 Đặc điểm sinh học

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganodermataceae)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi

nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [6]

Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm) Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3 cm Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu

đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh

- vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2 – 15 cm, dày 0,8 – 1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi

1.1.2.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm Bào

tử nấm thường có dạng hình trứng cụt đầu màu rỉ sắt Cấu tạo vỏ ngoài bào tử gồm hai lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai nhỏ, nối liền hai lớp vỏ Bào tử nấm Linh chi có kích thước trung bình 4,5 – 6,5 x 8,5 – 11,5 µm Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính Chu kỳ sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào

tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ kết thành nụ nấm, nụ phát triển thành chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành Trên tai nấm sinh ra các bào tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục [1]

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi

1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi

Linh chi phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng khắp ở các loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho Nấm Linh chi tiết ra các men phân giải màng tế bào endopolygalacturonase (endo – PG) và endopectin methyl – translinase (endo – PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh gây nên tình trạng các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra [9]

Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi [1]

Ánh sáng Không cần Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía

1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi

Nấm Linh chi có lịch sử lâu đời trong nền y học cổ truyền các nước phương Đông Nhiều thành phần có hoạt tính sinh học đã được xác định trong quả thể, tơ nấm, bào tử và trong cả môi trường nuôi cấy Polysaccharide và triterpenes là hai hoạt chất

sinh học chính trong số đó Polysaccharide từ Ganoderma lucidum được tìm thấy trước

tiên trong phòng thí nghiệm có tác dụng chống lại ung thư theo con đường điều biến miễn dịch hoạt chất sinh học chống lại sự oxy hóa, cân bằng lượng cholesterol, chống tăng huyết áp, bảo vệ gan, tổng hợp cholesterol…[25]

Nghiên cứu mới nhất của Viện Nghiên cứu Linh chi hoang dại của Trung Quốc cho thấy, Linh chi có lượng germanium (một chất giúp khí huyết lưu thông, thúc đẩy

sự hấp thụ ôxy của tế bào) cao hơn nhân sâm 8 lần Lượng polysaccaride cao trong Linh chi giúp tăng cường miễn dịch, làm mạnh gan, cô lập và diệt các tế bào ung thư Các hoạt chất của Linh chi còn có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, chữa trị các

bệnh liên quan đến tim và huyết áp, làm mạnh thận, bổ phổi, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chống lão hóa…[6]

1.1.4.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs)

Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận

từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể [24, 25]

Vai trò dược học của polysaccharide:

▪ Kích thích hệ miễn dịch cơ thể

▪ Gia tăng khả năng dung nạp oxygen

▪ Giảm gốc tự do hydroxyl

▪ Ức chế khối u phát triển

▪ Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ

▪ Tăng chức năng gan

▪ Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường

▪ Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein

1.1.4.2 Ganoderic Acid

Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử

ganoderma Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng Hàm lượng

G.acid cao thì có nhiều vị đắng

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpen

có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexane, eter ethyl, chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [14, 16]

Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi [8]

Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng:

▪ Giảm độ nhớt máu

▪ Ức chế kết dính tiểu cầu

▪ Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

▪ Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

▪ Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não

▪ Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

❖ Tính chất

Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài akcaloid ở dạng lỏng và có màu Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ Tính base của các alkaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ Các alkaloid tính base yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước Các alkaloid ở dạng

tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ: chloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol

và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: chloroform, eter, benzen Chính vì thế, tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống [14]

❖ Công dụng

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid

▪ Tác dụng lên hệ thần kinh

▪ Tác dụng lên huyết áp

▪ Tác dụng trị ung thư

1.1.4.5 Hợp chất Saponin

❖ Khái niệm chung về Saponin

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC Saponin bị tủa bởi chì acetate, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

o Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean

o Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan

1.1.4.6 Germanium hữu cơ

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của

oxygen Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển [21]

Chức năng của Germanium:

▪ Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

▪ Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

▪ Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi

Ở các nước Đông Nam Á, (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn

về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý và phương cách điều trị lâm sàng Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New York

Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)

Thanh chi (long Chi) Xanh Vị chua, tính bình, không độc chữa trị sáng

mắt, bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ

Hồng chi (xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,

dưỡng tim, bổ trung, trị tức ngực

Hoàng chi (kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì

khí

Bạch chi (ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông

✓ Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

✓ Bảo can (bảo vệ gan)

✓ Cường tâm (thêm sức cho tim)

✓ Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hóa)

✓ Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

✓ Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc)

✓ Giải cảm (giải toả trạng thái bị cảm)

✓ Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh:

Đối với bệnh về hệ tim mạch: nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định

huyết áp Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn định Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng [6, 8]

Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm

cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỉ trọng cao trong máu, làm giảm hệ

số sinh bệnh Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim

Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với

những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [9]

Khả năng miễn dịch: nấm Linh chi có chứa một lượng lớn Germanium hữu cơ,

Polysaccharides và Triterpenes Những thành phần này đã được chứng minh là tốt hơn cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta [10]

Chữa bệnh gan: ở Trung Quốc, Linh chi thường được kê vào đơn thuốc cho

những bệnh nhân bị viêm gan mãn tính Trong điều trị lâu dài từ 2 – 15 tuần thì tỉ lệ chữa hiệu quả là từ 70,7 – 98 % Ở Nhật, phần chiết nấm Linh chi đã được báo cáo là

có hiệu quả đối với những bệnh nhân suy gan

Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị,

giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [7]

Khả năng kháng HIV: để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virus HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người Sự nhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1 Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996) Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác

đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001)

o Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1 Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV– 1

o Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma)

o Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (- OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột [8, 25]

Khả năng antioxidant: nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponin và

triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985) Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi Chính vì vậy con người

có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng [8]

- Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ Chúng làm phục hồi các

tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể [1, 6]

Để sử dụng nấm Linh chi chữa bệnh, người ta thường dùng một số cách như sau: [29]

▪ Ngâm rượu: nấm Linh chi thái mỏng, ngâm trong rượu mạnh 40o – 45oC, sau

20 ngày có thể sử dụng (ngày uống 2 lần, mỗi lần một chén con)

▪ Sắc nước uống: lấy một khối lượng Linh chi khoảng 3 – 16 gam cho 1 lần sắc (đổ 3 bát nước đun sôi cô đặc để lấy một bát, làm 3 lần như vậy) Sau đó

đổ trộn lẫn với nhau để uống

▪ Uống dạng trà: sấy nấm Linh chi, nghiền nát thành bột, mỗi lần uống 3 – 7 gam (cho vào 200 ml nước sôi) hãm lại sau 10 phút rồi uống

▪ Bào chế ở dạng chè, thuốc viên…

1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)

1.2.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại nấm linh chi: [27]

- Giới: Mycota

Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ

Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma (trên 100

loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài) [6]

Nấm Linh chi được xem là nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên thân cây gỗ Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống hoặc không Khi theo

dõi quá trình phát sinh hình thái ở các loài Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán

và tạo kiểu đính tâm rất tương đồng với các loài Ganoderma mọc tự do dưới đất Cho nên có thể xem chi Amauroderma đã phát sinh trực tiếp từ Ganoderma và đây là nhánh phân hoá lớn nhất trong họ Ganodermataceae [6]

Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum (Corner, 1993)

a: Hệ sợi sinh dưỡng; b: Hệ sợi cứng trong hịt nấm c: Hệ sợi bên trong thịt nấm; d: Bào tử đảm

Bào tử kích thước khá lớn, hình elip, bề mặt bào tử gần như nhẵn dưới kính hiển

vi quang học, kích thước bào tử 9 – 10 µm x 4 – 5 µm [7] Corner dựa vào kích thước,

hình dạng bào tử nấm và khẳng định chi Amauroderma thuộc họ Ganodermataceae

[23] Nấm Linh chi là dạng thể quả Thể quả có cuống dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi đính tâm Cuống nấm thường hình trụ hoặc thanh mảnh (cỡ 0,3 – 0,8 cm đường kính), hoặc mập khỏe (2 – 3,5 cm đường kính), ít khi phân nhánh, dài từ 2,7 – 22 cm, đôi khi có uốn khúc cong quẹo Lớp vỏ cuống láng đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng, không

có lông, phủ suốt lên bề mặt tán nấm

Quả thể nấm A subresinosum có dạng hình quạt Ở giai đoạn mầm nấm có dạng

hình tròn, màu trắng Sau khoảng 20 - 25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình quạt và lớp sắc tố nâu - đen bắt đầu hình thành xung quanh cuống nấm Phía ngoài cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng đục, dày và sau khoảng 30 – 40 ngày tiếp theo thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen - quế, lúc này quả thể đã già Trên mặt mũ nấm

có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất Mũ nấm rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung Mép

mũ thường dày, uốn lượn cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa Mặt dưới quả thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6 ống/mm Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành [26]

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường Trên mặt nấm có vân gợn đồng tâm và có chia rãnh phóng xạ, màu sắc đỏ nâu, nâu tím, nâu đen, nhẵn bóng, láng như veni, thường sẫm màu dần khi già Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm Phần đính cuống gồ lên hay lõm Phần thịt nấm màu vàng kem – nâu nhợt, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới

Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum

1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen

- Năm 2006, Lê Xuân Thám và công sư đã phát hiện và định danh loài Linh chi

đen Amauroderma subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vườn Quốc gia Cát Tiên

- Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế bào ung thư từ ba loài nấm Linh chi đen, Linh chi đỏ và Linh chi vàng từ vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng Kết quả tác giả đã tinh sạch được 12 hợp chất ergosterol peroxide có khả năng kháng 4 dòng tế bào ung thư biểu mô, gan, phổi và vú

- Năm 2011, Đăng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần

hóa học của nấm Linh chi đen Việt Nam A.subresinosum Kết quả xác định được 14

loại acid béo thiết yếu từ nấm Linh chi đen

- Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống

oxy hóa của các Polysaccharides thô chiết xuất từ nấm Linh chi đen Amauroderma

subresinosum

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 4/5/2015 đến 16/8/2015, tại phòng Vi sinh thuộc Viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) được thu hái tại vùng núi

Chứa Chan tỉnh Đồng Nai và giữ giống tại Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

- Cân phân tích A&D, EK-300i

- Cân kỹ thuật A&D, HR-200

- Bếp điện từ

- Nồi hấp Autoclave TOMY, ES-315

- Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710ATS, Japan

- Tủ sấy Sanyo-MIR-162

- Máy cô quay Heidolph

- Máy đo OD, Elisa 96 giếng

- Máy Votex Disruptor genie, USA

- Bể điều nhiệt Cole-parmer, BT-15

- Máy HPLC Waters 2695 Separations Module

- Cột HPLC Silica Chrom_Silicycle (Canada) Kích thước 4,6 × 250 mm, 5µm

2.3.3 Môi trường sử dụng

2.3.3.1 Môi trường nhân giống

▪ Môi trường PDA

Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g Agar: 20 g

2.3.3.2 Môi trường tăng sinh

▪ Môi trường PD-broth

Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng

Theo dõi khoảng thời gian tơ nấm Linh chi tăng trọng khi nuôi trồng trong môi trường lỏng Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 18 mỗi lần thu 5 chai, mẫu thu được đem đi sấy ở 55oC đến khối lượng không đổi và cân trọng lượng khô

Cách tiến hành: đổ 80 ml môi trường lỏng vào chai thủy tinh Hấp khử trùng ở

121oC trong 15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào Giống lấy từ tơ nấm nuôi cấy trên môi trường agar, mỗi lần cấy cắt một miếng nhỏ (1,5 x 1,5 cm) nhẹ nhàng cho vào chai (tránh để mẫu chìm xuống nếu không tơ nấm sẽ rất khó phát triển) Chai đã cấy được ủ ở nhiệt độ 30oC và đặt ở nơi tránh ánh sáng

2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A subresinosum

❖ Nguyên tắc

Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là tách các hợp chất hữu cơ thành các nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất này trong các dung

môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng

❖ Phương pháp chiết [11]

Dietyl eter

Ethanol

Nước 70oC/cách thủy

Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc

➢ Chiết với dietyl eter

Trong một erlen 100 ml, cho vào 5g mẫu khô và 30ml dietyl eter, khuấy trộn đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc Lặp lại sự chiết với dietyl eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết cuối nhạt màu

Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết 3 × 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình lóng có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter

Lấy lớp nước kiềm: cho vào becher, trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến

khi trung tính Lọc bằng phễu để lấy tủa Hòa tủa này vào 5ml ethanol 90o và chia dung dịch này vào đều trong 3 ống nghiệm

▪ Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có antraglycosid

Mẫu khô

Bã

Dịch chiết nước Dịch chiết cồn

Dịch chiết Eter

Bã

Bã

▪ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu

thấy có màu đỏ, có thể có flavonoid

▪ Ống 3: Nhỏ một vài giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc

có vết mờ, có thể có acid béo

Lấy lớp dietyl eter: cho vào bình lóng, rửa dung dịch eter này với nước cất (3 x

20 ml), tiếp theo chiết với dung dịch H2SO4 2% (3 x 5 ml) sẽ có hai lớp: lớp etyl eter

và lớp nước của acid

▪ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alkaloid

Thuốc thử Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Bouchardat cho tủa màu nâu;

▪ Lớp ethyl eter được chia đều vào ba chén sứ và cho bốc hơi đến khô:

* Chén 1: nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu

* Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh có thể có

carotenoid

* Chén 3: Sử dụng thuốc thử Lieberman (Ac2O/H2SO4): nhỏ 10 giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, rồi rót hết dung dịch này vào một ống nghiệm Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch trong

ống nghiệm có màu vàng lục hoặc lục đỏ, có thể có phytosterol (steroid

thực vật)

➢ Chiết với ethanol 90 o

Bã cao sau khi chiết với ethyl eter được chiết với ethenol (3 x 30ml) Sau mỗi lần chiết, lọc qua ngang qua một tờ giấy lọc, gộp ba lần chiết lại để có dung dịch alcol

Dung dịch được chia làm 6 phần, mỗi phần khoảng 15 ml dung dịch

Phần 1: Pha loãng dung dịch alcol với 4 lần thể tích nước cất Kiềm hóa bằng

dung dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc

• Phần tủa được hòa với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm Thêm vào thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc

theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh

dương lục, có thể có steroid

• Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa Lọc lấy tủa và hòa tủa với

3 – 4 ml etanol 90o và chia đều vào hai ống nghiệm

* Ống 1: cho và giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antraglycosid

* Ống 2: cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu

đỏ, có thể có flavonoid

Phần 2: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào

hay ống nghiệm

* Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu

có màu xanh đen, có thể có tanin

* Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ

Phần 3: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn Hòa cặn này với 3 – 4 ml

H2SO4 2% Dung dịch này được thử với 2 loại thuốc thử alkaloid: Mayer, Bouchardat

Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid

Phần 4: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn Hòa cặn này với 3 – 4 ml

nước cất, đun nóng và lọc Cho vào dung dịch lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5

giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường

khử

Phần 5: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2

ống nghiệm Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ Ống 2: kiềm hóa nếu có màu lục Nếu cả

hai ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có antocyanosid

Phần 6: Chia dung dịch alcol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi đến cạn

* Ống 1: Cho vào 5 ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều

dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin

* Ống 2: Cho vào 0,5 ml chloroform và 0,5 ml anhidrid acetic Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân

cách xuất hiện màu tím, có thể có saponin triterpen; nếu có mặt phân cách xuất hiện màu xanh dương lục, có thể có saponin steroid

➢ Chiết với dung dịch nước H 2 SO 4 1%

Phần bả còn lại được chiết với dung dịch nước H2SO4 1% (3 x 20 ml) Lọc và chia dịch chiết vào 5 ống nghiệm

Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin

Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl eter (3 x 5 ml) Lóng lấy lớp dietyl eter Lại chiết lớp dietyl eter này với dung dịch H2SO4 1% Lóng lấy lớp nước, để định tính với 2 loại thuốc thử Mayer, Bouchardat Nếu dương tính với

tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid

Phần 3: Cho vào dung dịh lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc

thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử

Phần 4: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có

màu xanh đen, có thể có tanin

Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích etanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có

hợp chất đường loại acid uronic

2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau

❖ Quy trình tách chiết:

Từ 30g sinh khối tơ nấm được sấy khô, ly trích được 5,7 g cao Methanol thô Hòa tan cao này vào nước, rồi lần lượt trích lỏng – lỏng với hexane, chloroform, ethyl acetate thu được tương ứng 1,7 g cao Hexane, 0,3 g cao Chloroform, 0,23g cao Ethyl acetate, 2,8 g cao nước

- Chiết với MeOH

- Cô quay

- Hòa tan với nước

- Chiết với Hexane

2.4.3.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi

❖ Nguyên tắc: Dịch chiết nấm linh chi sẽ khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên vi khuẩn được kiểm tra Nếu dịch chiết kháng được vi khuẩn kiểm tra thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch Độ lớn của vòng kháng khuẩn sẽ tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn so với dịch chiết

❖ Mục đích: Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi thu được

❖ Tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis, E.coli và

P.aeruginosa Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường

- Hút 100 µl dịch nuôi cấy của từng loại vi khuẩn lần lượt cho vào các đĩa thạch, rồi dùng que cấy trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch

- Hút 60 µl nước cất vô trùng cho vào giếng đối chứng âm và hút 60 µl dịch chiết thô lần lượt cho vào các giếng còn lại

- Ủ đĩa ở 37 oC trong 24 giờ

- Quan sát và đo vòng kháng khuẩn và so sánh khả năng kháng khuẩn của các loại cao thu được

2.4.3.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tơ nấm Linh chi

❖ Nguyên tắc: DPPH (2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl; C18H12N5O6, M = 394.33)

là một gốc tự do, trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím và độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 517 nm [18] Khi phản ứng với các chất có tính kháng oxi hóa, electron