Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

Tên đề tài: Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài.. Mục đích chính của nghiên cứu này là nghiên cứu c

i

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Tên đề tài: Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Duyên

Mangiferin là hợp chất có hoạt tính sinh học chính ở trong lá xoài (Mangifera

Indica L) có tác dụng chống viêm, chống oxi hóa, điều trị bệnh tiểu đường, điều hòa hệ

miễn dịch và chống ung thư Mục đích chính của nghiên cứu này là nghiên cứu các điều kiện làm sạch cao chiết mangiferin thô từ bột lá xoài bằng phương pháp truyền thống -

sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau đồng thời khảo sát hoạt tính sinh học của các cao chiết thô và mangiferin tinh sạch để đánh giá hiệu quả làm sạch

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau khi khảo sát hàm lượng mangiferin và hoạt tính sinh học của các cao chiết thô thì cao thô siêu âm - ethanol cho hàm lượng mangiferin cao nhất (1,3865 ± 0,008 mg/g) và khả năng kháng khuẩn tốt nhất, trong khi đó cao

khi tinh sạch bằng phương pháp sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau thu được cao mangiferin tinh sạch với hiệu suất thu hồi 9,8 %, hàm lượng mangiferin trong cao tinh sạch là 11 ± 0,45 mg/g và hoạt tính sinh học giảm so với cao thô ban đầu: khả

năng kháng oxi hóa giảm 1,3 lần và chỉ kháng được vi khuẩn Vibrio thử nghiệm Trong

quá trình tinh sạch thu được các cao phân đoạn khác có hoạt tính sinh học rất cao, đặc biệt là cao ethyl acetate

Nội dung Đồ án Tốt nghiệp gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

1 Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và khảo sát

hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

+ Lời mở đầu

+ Chương 1: Tổng quan

+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

+ Chương 3: Kết quả và thảo luận

+ Chương 4: Kết luận và kiến nghị

+ Tài liệu tham khảo

+ Phụ lục

5 Các bản vẽ, đồ thị (ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ): Không

6 Họ tên người hướng dẫn: Nguyễn Thị Trúc Loan

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 05/01/2019

8 Ngày hoàn thành đồ án: 08/6/2019

Đà Nẵng, ngày 08 tháng 6 năm 2019

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường Đại học cho đến nay,

em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng, gia đình và bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng, quý thầy cô trong ngành Công nghệ Thực phẩm - những người

đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá để em có thể bước vào sự nghiệp trong tương lai

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Trúc Loan Cảm ơn cô đã tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án, đã giải đáp những

thắc mắc trong quá trình nghiên cứu Đồng thời, em cũng xin gởi lời cảm ơn đến Th.S

Đặng Thanh Long (Cán bộ Viện Sinh học - Đại học Huế) đã tạo điều kiện về phòng thí

nghiệm, trang thiết bị để em có thể hoàn thành đề tài một cách thuận lợi và kịp tiến độ

Trong quá trình thực hiện đồ án này vì kiến thức thực tế em còn hạn chế và thời gian thực hiện không nhiều nên sẽ không tránh khỏi sai sót Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến và nhận xét của quý thầy cô, các bạn để em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện hơn

Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Hội đồng Bảo vệ

Đồ án Tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đưa ra ý kiến đóng góp cho Đồ án Tốt nghiệp của em

Em xin chân thành cảm ơn!

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong đề tài do em tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Tác giả

Trần Thị Duyên

TÓM TẮT i

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii

CAM ĐOAN v

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây xoài và mangiferin 3

1.1.1 Tổng quan về cây xoài 3

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mangiferin 4

1.1.3 Tính chất của mangiferin 4

1.1.4 Tác dụng dược lí của dịch chiết mangiferin 5

1.2 Tổng quan về kháng oxi hóa và kháng khuẩn của dịch chiết mangiferin từ lá xoài 8

1.2.1 Kháng oxi hóa 8

1.2.2 Kháng khuẩn 10

1.3 Phương pháp tinh sạch truyền thống bằng sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau 11

1.3.1 Cơ sở của phương pháp 11

1.3.2 Lựa chọn dung môi và các yêu cầu 11

1.3.3 Định tính bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng 12

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15

1.4.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 15

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Lá xoài 18

2.1.2 Mangiferin chuẩn 18

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng 19

2.2.1 Hóa chất 19

2.2.2 Dụng cụ 19

2.2.3 Thiết bị 19

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19

2.4 Nội dung nghiên cứu 20

2.4.2 Định tính và định lượng mangiferin trong các cao chiết lá xoài 20

2.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết lá xoài 21

2.4.4 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau 21

2.4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1 Phương pháp chiết mangiferin bằng dung môi nước và ethanol 60° 21

2.5.2 Phương pháp cô đặc dịch chiết 22

2.5.3 Phương pháp định tính và định lượng mangiferin trong cao chiết thô và cao tinh sạch 22

2.5.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết thô và mangiferin tinh sạch 24

2.5.5 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp truyền thống 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả định tính mangiferin trong cao chiết lá xoài 29

3.2 Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại của mangiferin chuẩn và dịch chiết lá xoài 30

3.3 Kết quả đường chuẩn định lượng mangiferin trong dung môi ethanol bằng UV-VIS 31

3.4 Kết quả định lượng mangiferin trong các cao chiết thô 32

3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết thô 32

3.5.1 Kết quả đánh giá kháng oxi hóa của các cao chiết thô 32

3.5.2 Kết quả đánh giá kháng khuẩn của các cao chiết thô 34

3.6 Kết quả tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sử dụng các dung môi khác nhau 39

3.6.1 Các cao chiết phân đoạn và mangiferin tinh sạch 39

3.6.2 Kết quả định tính mangiferin trong mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn 39

3.6.3 Kết quả định lượng mangiferin trong mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn 40

3.7 Kết quả đánh giá lại hoạt tính sinh học của mangiferin tinh sạch 41

3.7.1 Kết quả đánh giá lại hoạt tính kháng oxi hóa 41

3.7.2 Kết quả đánh giá lại hoạt tính kháng khuẩn 44

3.8 Đề xuất qui trình công nghệ tinh sạch mangiferin 49

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

PHỤ LỤC 58

Bảng 1.1 Hàm lượng các thành phần hóa học có trong lá xoài [2] 3

Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang ở các đỉnh của mangiferin chuẩn và dịch chiết lá xoài 30

Bảng 3.2 Độ hấp thụ quang của dung dịch mangiferin chuẩn 31

Bảng 3.3 Hàm lượng mangiferin trong các cao chiết thô 32

Bảng 3.4 Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của của các cao chiết thô 33

Bảng 3.5 Giá trị IC50 của các cao chiết thô 34

Bảng 3.6 Đường kính kháng khuẩn của các cao chiết thô đối với vi khuẩn E.coli (mm) 34

Bảng 3.7 Đường kính vòng kháng khuẩn của các cao chiết thô đối với vi khuẩn Salmonella (mm) 36

Bảng 3.8 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết thô đối với vi khuẩn Vibrio (mm) 37

Bảng 3.9 Hàm lượng mangiferin trong các cao chiết phân đoạn 41

Bảng 3.10 Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của của các cao phân đoạn và mangiferin tinh sạch 42

Bảng 3.11 Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, mangiferin chuẩn 43

Bảng 3.12 Giá trị IC50 của mangiferin tinh sạch, các cao phân đoạn, mangiferin chuẩn và vitamin C 44

Bảng 3.13 Đường kính vòng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch, các cao phân đoạn, mangiferin chuẩn và kháng sinh ampicillin đối với vi khuẩn E.coli (mm) 45

Bảng 3.14 Đường kính vòng kháng khuẩn của các cao phân đoạn đối với vi khuẩn Salmonella (mm) 46

Bảng 3.16 Đường kính vòng kháng khuẩn của các cao phân đoạn đối với vi khuẩn Vibrio (mm) 48

Hình 1.1 Cây xoài [63] 4

Hình 1.2 Cấu trúc của mangiferin [25] 4

Hình 1.3 Bình sắc ký lớp mỏng [6] 13

Hình 1.4 Sự dịch chuyển của các hợp chất trên sắc ký lớp mỏng [70] 14

Hình 2.1 Bột lá xoài 18

Hình 2.2 Mangiferin chuẩn 18

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20

Hình 2.4 Phương pháp chiết Soxhlet 21

Hình 2.5 Phương pháp chiết siêu âm bể 22

Hình 2.6 Cô quay thu cao thô 22

Hình 2.7 Sơ đồ tinh sạch mangiferin bằng các dung môi 27

Hình 3.1 Màu sắc bản mỏng trước khi chiếu tia UV 29

Hình 3.2 Màu sắc bản mỏng sau khi chiếu tia UV 29

Hình 3.3 Phổ đồ của dung dịch mangiferin chuẩn và dịch chiết lá xoài 30

Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch mangiferin chuẩn trong dung môi ethanol 31

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự do của DPPH của bốn cao chiết thô 33

Hình 3.6 Đường kính kháng khuẩn E.coli của bốn cao chiết thô tại nồng độ 1000 mg/ml 35

Hình 3.7 Đường kính kháng khuẩn Salmonella của bốn cao chiết thô tại nồng độ 1000 mg/ml 36

Hình 3.8 Đường kính kháng khuẩn Vibrio của bốn cao chiết thô tại nồng độ 1000 mg/ml 38

Hình 3.9 Sắc ký bản mỏng mangiferin chuẩn, mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn trước nhuộm màu 39

Hình 3.10 Sắc ký bản mỏng của mangiferin chuẩn, mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn sau khi nhộm màu với FeCl3 40

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự do của DPPH của của mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn 42

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự do của DPPH của mangiferin chuẩn và vitamin C 43

Hình 3.13 Đường kính kháng khuẩn E.coli của mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau 45

Hình 3.14 Đường kính kháng vi khuẩn Salmonella của mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau 47

Hình 3.15 Đường kính kháng vi khuẩn Vibrio của mangiferin tinh sạch và các cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau 48

w/v - Khối lượng/thể tích

UV- VIS - Ultraviolet - visible

HPLC - High performance liquid chromatography BĐTĐ - Bệnh đái tháo đường

OD - Độ hấp thụ quang

IC50 - Inhibitory concentration 50%

DPPH - 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

LB - Môi trường Luria – Bertani

MIC - Minimal Inhibitory Concentration

E.coli - Vi khuẩn Escherichia coli

AA - Arachidonic acid

PMA - Phorbol myristate acetate

MPO - Enzyme myeloperoxidase

NF-kB - Yếu tố nhân kappa B

TCA - Axit tricarboxylic

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Thực trạng hiện nay cho thấy, tỉ lệ người mắc bệnh đái tháo đường (BĐTĐ) đang gia tăng ở các nước phát triển và phải chi trả một lượng lớn ngân sách cho căn bệnh này BĐTĐ thường là nguyên nhân biến chứng của các bệnh hiểm nghèo như: bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận,…Ngày nay, có nhiều thuốc điều trị BĐTĐ nhưng đều có tác dụng phụ như buồn nôn, ói mửa, vàng da, ứ mật, mất bạch cầu hạt, thiếu máu,…[20, 21] Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà khoa học trong và ngoài nước có xu hướng nghiên cứu các loại thực vật có khả năng điều trị BĐTĐ

Cây xoài (Mangifera indica L) được trồng phổ biến và là nguồn thu nhập chính

của nhiều hộ gia đình Tuy nhiên, nguồn thu nhập chính mang lại là từ trái xoài, còn một lượng lớn lá xoài không được sử dụng Vì vậy, nếu có thể tận dụng nguồn lá xoài này

để ly trích các hợp chất có khả năng điều trị BĐTĐ sẽ nâng cao giá trị và hình thành chuỗi giá trị liên hoàn của cây xoài

Mangiferin được biết đến trong trong y học do các tác dụng như: kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, kích thích hệ miễn dịch, hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường, bảo vệ dạ dày, chống tia cực tím,…[22] Trong lá xoài có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý, đặc biệt là mangiferin chiếm tỉ lệ cao trong thành phần [1] Theo nghiên cứu của Tang-Bin Zou và các cộng sự, hàm lượng mangiferin trong lá xoài khá cao 58,46 ± 1,27 mg/g [23] Mangiferin có thể được chiết từ lá xoài bằng các phương pháp khác nhau nhưng trong cao chiết tổng thu được còn lẫn rất nhiều tạp chất Vì vậy, việc tinh sạch và nghiên cứu hoạt tính sinh học của mangiferin từ cao chiết lá xoài là cần thiết để thu mangiferin có độ tinh khiết cao và ứng dụng vào các sản phẩm cho người bị bệnh tiểu đường

Từ những thực tế đã nêu trên và góp phần làm gia tăng giá trị kinh tế của cây xoài cũng như tận dụng tối đa nguồn phế liệu lá xoài già bị cắt tỉa sau mỗi mùa vụ, dưới

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Trúc Loan, đề tài “Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin

từ bột lá xoài” được đề xuất thực hiện nhằm khảo sát qui trình phù hợp để tinh sạch

mangiferin và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin thu được sau làm sạch

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng quan về nguyên liệu, phương pháp tinh sạch bằng sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau cũng như phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

- So sánh hàm lượng mangiferin và nghiên cứu hoạt tính sinh học trong các cao chiết thô

- Nghiên cứu tinh sạch cao chiết thô bằng phương pháp sử dụng các dung môi có

độ phân cực khác nhau dựa vào tính phân cực của mangiferin

- Đánh giá lại hoạt tính sinh học của mangiferin sau làm sạch

3 Đối tượng nghiên cứu

Lá xoài keo (Mangifera Indica L) được thu hái tại thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa

Thiên Huế

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp xử lý số liệu excel, xử

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây xoài và mangiferin

1.1.1 Tổng quan về cây xoài

Xoài có tên khoa học là Mangifera Indica L, thuộc chi Mangifera, họ

Anacardiaceae Ban đầu nó được tìm thấy ở chân dãy Himalaya ở đông bắc Ấn Độ,

Miến Điện và Bangladesh và được thuần hóa hàng nghìn năm trước Nó được trồng ở hầu hết các quốc gia nhiệt đới và một số loài cận nhiệt đới [58]

Xoài là cây thân gỗ lớn cao từ 15-20 m, tán cây lớn Cây xoài mọc rất khỏe, rễ cây to, tập trung trong phạm vi cách gốc 2 m Quả xoài thuộc dạng quả hạt khá to, hạt dẹt, bên trong có những thớ sợi Quả xoài sống có màu xanh lá, xanh ngọc hoặc trắng xanh Khi chín có màu vàng, vị chua ngọt, mùi thơm [59]

Lá xoài nguyên, mọc sole, dạng lá đơn, thuôn dài, mặt trên nhẵn bóng, có màu xanh đậm, mặt dưới nhạt màu hơn Lá dài 15-30 cm, rộng 5-7 cm Gân chính cùng với gân phụ nổi rõ ở bề mặt dưới Các kết quả đã công bố cho thấy dịch chiết lá xoài có chứa các một số chất là saponin, phenol, tanin, terpenoid, flavonoid, glycosid, courmarin, alkaloid [1] Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học tốt, có lợi cho sức khỏe của con người Thành phần hóa học của lá xoài được thể hiện trong bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.1 Hàm lượng các thành phần hóa học có trong lá xoài [2]

Trên thế giới hiện nay có 87 nước trồng xoài với diện tích khoảng 1,8 – 2,2 triệu

trồng từ Nam chí Bắc, vùng trồng xoài tập trung từ Bình Định trở vào, và được trồng

nhiều nhất ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long Ngoài ra, xoài còn được trồng ở một

số khu vực miền Trung và Tây Nguyên, các tỉnh Tây Bắc và khu vực đồng bằng Sông Hồng Diện tích trồng xoài của cả nước khoảng 87.000 ha, sản lượng hơn 969.000 tấn/năm Việt Nam đứng thứ 13 về sản xuất xoài trên thế giới nhưng số lượng xuất khẩu thì còn khiêm tốn và nằm ngoài tốp 10 nước xuất khẩu xoài [60]

Hình ảnh cây xoài được thể hiện trong hình 1.1 dưới đây

Hình 1.1 Cây xoài [61]

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của mangiferin

445,35) Có cấu tạo gồm 2 phần: phần đường và phần không đường còn gọi là aglycon Phần aglycon là một polyphenol khung sườn xanthon

Mangiferin được Wiechowski (1923) phân lập từ vỏ xoài và được Iseda (1957) xây dựng cấu trúc Sau đó Ramana và Sechadi (1960) đã điều chỉnh lại cấu trúc Cấu trúc được thừa nhận hiện nay là một glycoside có phần aglycon có bộ khung sườn xanthon với nhóm hydroxyl và một phân tử glucose đính vào C số 2 (hình 1.2) [23]

Hình 1.2 Cấu trúc của mangiferin [23]

1.1.3 Tính chất của mangiferin

Mangiferin là những tinh thể hình phiến dài hoặc ở dạng bột, màu vàng nhạt, mịn, vị hơi đắng, cay, không mùi hoặc thơm nhẹ

Tính tan: Là hợp chất có cấu tạo bền vững hầu như không tan trong nước, ít tan

trong ethanol và chloroform, không tan trong các dung môi không phân cực Trong tự nhiên nó tồn tại dưới dạng liên kết với các đường, tan nhiều trong nước nóng, hỗn hợp

Điểm nóng chảy: 269oC - 270oC

Tính chất khi tác dụng với các chất khác:

- Tăng màu vàng với dung dịch kiềm loãng

- Cho màu vàng cam với phản ứng Cyanidin

Dung dịch mangiferin hấp thụ cực đại trên máy UV tại các bước sóng (241, 258,

316 nm) Có thể định tính bằng sắc kí bản mỏng: Với hệ dung môi n-butanol: acid acetic:

1.1.4 Tác dụng dược lí của dịch chiết mangiferin

1.1.4.1 Tác dụng kháng oxi hóa

lipid trong ty thể gan chuột

Sắt là chất xúc tác sinh học cực kì quan trọng trong quá trình chuyển hóa Nhưng khi hiện diện quá mức, nó đóng vai trò chính trong sự hình thành các gốc oxi cực độc, cuối cùng gây tổn thương cho cấu trúc tế bào, đặc biệt là ty thể

Mangiferin được chứng minh có thể ngăn ngừa tổn thương ti thể qua trung gian sắt bằng phương pháp oxi hóa giảm kim loại chuyển tiếp cần thiết để sản xuất ra các gốc superoxide, hydroxyl và hoạt động thải gốc tự do [27] Mangiferin tạo thành phức chất

định hơn Như vậy, mangiferin có khả năng tạo phức sắt như là một cơ chế chính để bảo

➢ Khả năng kháng oxi hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng của dịch trích methanol

lá xoài non

Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi sự phá hủy bởi stress mạng nội chất của dịch trích lá xoài non được thực hiện trên tế bào MIN6 Sự chết của tế bào MIN6 được gây ra do tunicamycin Nồng độ dịch trích lá xoài non có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất tốt nhất là 500 µg/ml

Như vậy, dịch trích lá xoài non có hiệu quả kháng oxy hóa Do đó, nó có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường theo cơ chế kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào β của tụy tạng khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất [4].

1.1.4.2 Tác dụng chống tiểu đường

Bệnh đái tháo đường là bệnh do tổn thương hay suy giảm chức năng của tế bào beta của đảo tụy, gây giảm lượng insulin bài tiết vào máu, và dẫn tới lượng đường huyết cao trong máu Streptozocin là một chất kháng sinh, được sản sinh bởi vi khuẩn

Streptomyces achromogenes, là tác nhân phá hủy các tế bào beta ở tuyến tụy

Streptozocin hoạt động chống lại các khối u, đồng thời gây tổn hại đến các tế bào sản xuất insulin [28, 29, 63]

Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá xoài có tác dụng tương tự Chlorpropamide (thuốc làm giảm lượng đường trong máu bằng cách giải phóng insulin.) trong cùng điều kiện Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết của lá xoài có hoạt tính

hạ đường huyết do sự kích thích các tế bào beta tuyến tụy để giải phóng insulin hoặc do giảm sự hấp thu glucose của đường ruột Như vậy, mangiferin được chứng minh có khả năng điều trị bệnh tiểu đường loại 1 và loại 2 [30, 31]

1.1.4.3 Chống kí sinh trùng

➢ Cryptosporidium parvum là một kí sinh đơn bào, có thể gây ra bệnh về đường hô hấp và tiêu hóa [64] Hoạt tính ức chế của mangiferin trên Cryptosporidium parvum

được đánh giá trong một mô hình chuột sơ sinh và so sánh với kháng sinh Paromomycin

Kết quả thu được cho thấy mangiferin (100 mg/kg) có khả năng kháng Cryptosporidium

parvum, có tác dụng tương tự như Paromomycin ở cùng một liều lượng [32]

➢ Clostridium tetani là vi khuẩn gây ra bệnh uốn ván Dịch chiết lá xoài từ ete và ethanol được chứng minh có khả năng chống Clostridium tetani với nồng độ ức chế tối

thiểu lần lượt là 6,25 và 12,5 mg/ml [33]

1.1.4.4 Chống dị ứng

Dịch chiết lá xoài được chứng minh có khả năng chống dị ứng do sự ức chế sản xuất IgE và sốc phản vệ, ức chế tính thấm của mạch máu do histamine và giải phóng histamine từ tế bào chủ [34]

1.1.4.5 Bảo vệ dạ dày

Helicobacter pylori là vi khuẩn thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa, đặc biệt

có trong dạ dày H pylori có thể truyền từ người này sang người khác khi tiếp xúc với

chất dịch cơ thể của người bị nhiễm bệnh (chẳng hạn như nước bọt) hoặc ăn uống chung

Mangiferin chứng minh giảm khả năng bị ung thư dạ dày do vi khuẩn H pylori gây ra Khi nuôi cấy đồng thời tế bào AGS bị nhiễm H pylori với mangiferin (100 g) kết quả

cho thấy tăng đáng kể vùng ức chế cũng như giảm đáng kể nồng độ ức chế tối thiểu Do

đó chứng minh hoạt động chống H pyloric của mangiferin gần như tương đương với kháng sinh amoxicillin

Bên cạnh đó, các tiểu đơn vị bị viêm như NF-κB p65, interleukin-1β, IL-8 và

TNF-α cũng được ức chế đáng kể Ngoài ra, mangiferin còn có tác dụng bảo vệ dạ dày chống lại tổn thương do ethanol và indomethacin gây ra thông qua các cơ chế hoạt động chống oxy hóa [35]

1.1.4.6 Kháng viêm

Chứng viêm là hiện tượng xảy ra ở tổ chức tế bào, là phản ứng phòng vệ của cơ thể khi sinh vật bị tấn công từ bên ngoài lên cơ thể thông qua phản xạ của hệ thần kinh [65] Mangiferin được chứng minh giảm chứng phù tai do arachidonic acid (AA) và phorbol myristate acetate (PMA) gây ra Đối với PMA, dịch chiết lá xoài làm giảm hoạt động của enzyme myeloperoxidase (MPO) Ngoài ra, dịch chiết còn ức chế các yếu tố hoại tử khối u [36]

1.1.4.7 Điều hòa miễn dịch

Mangiferin, một polyphenol tự nhiên được biết đến có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và chống vi rút Tuy nhiên, cơ chế của những hiệu ứng này chưa được

trình trên, nên có thể mangiferin điều chỉnh kích hoạt NF-kB Kết quả nghiên cứu cho thấy mangiferin ngăn chặn yếu tố hoại tử khối u do hoạt hóa NF-kB và các gen phụ

hoạt hóa IkB kinase (IKK) và ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa [37]

1.1.4.8 Tác dụng bảo vệ phóng xạ

Tác động bảo vệ của mangiferin chống lại bức xạ đã được chứng tỏ bởi Jagetia

và Venkatesha (2005) và bởi Jagetia và Baliga (2005) [38, 39] Nghiên cứu cho thấy ở các nồng độ khác nhau (0; 0,25; 0,5; 1; 2; 5; 10; 17,5; 25; 50; 75 và 100 mg/kg) của mangiferin khi thử nghiệm trên chuột DBAxC57BL tiếp xúc với tia gama Chuột điều trị bằng các liều mangiferin khác nhau một giờ trước khi chiếu xạ làm giảm các triệu chứng bệnh phóng xạ và trì hoãn sự khởi phát tử vong khi so sánh với các biện pháp kiểm soát chiếu xạ không dùng thuốc Tác dụng bảo vệ phóng xạ của mangiferin tăng theo nồng độ tới 2 mg/kg và sau đó giảm đi

1.1.4.9 Kháng khuẩn, kháng nấm

Với kỹ thuật khuếch tán agar, mangiferin cho thấy hoạt động chống lại các loài

vi khuẩn (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi)

và hai loại nấm (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus) với nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng 18.2- 36.2 mg/ml [40-42]

1.14.10 Chống ung thư

➢ Mangiferin được chứng minh có thể ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bạch cầu K562 [66] Kết quả nghiên cứu cho thấy, các nồng độ khác nhau của mangiferin (25 - 200 µmol/l) đã ức chế sự tăng sinh của các tế bào K562 và gây ra apoptosis trong dòng tế bào K562 thông qua điều chỉnh giảm biểu hiện gen bcr / abl

➢ Mangiferin chống ung thư ruột kết (tế bào F344) gây ra bởi chất ung thư hóa học azoxymethane (AOM) [43] Kết quả nghiên cứu cho thấy 0,1% mangiferin trong chế độ

ăn đã giảm sự tăng sinh tế bào ung thư ở niêm mạc đại tràng

➢ Mangiferin còn được chứng minh có tác dụng chống ung thư phổi [44] Việc điều trị bằng mangiferin ở nồng độ 100 mg/kg trong 18 tuần đã ngăn chặn quá trình oxi hóa lipit, tác dộng vào axit tricarboxylic (TCA) và các phức hợp chuỗi vận chuyển electron

đã góp phần chống lại ung thư phổi ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ

Kết luận: Như vậy, mangiferin là hợp chất có hoạt tính sinh học rất cao, đặc biệt

là khả năng kháng khuẩn và kháng oxi hóa Điều này được chứng tỏ bởi rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước, góp phần khẳng định cơ chế của mangiferin trong việc điều trị

Nếu không kiểm soát, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ

Gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn biến sau:

dưỡng khí,

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do nguy hiểm như: superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy, nguy hiểm nhất là hydroxyl Hydroxyl là gốc rất dễ

phản ứng và gây ra nhiều tổn thương Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách, có thể là sản phẩm của những căng hẳng thần kinh, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, bức xạ mặt trời,…[69]

1.2.1.2 Chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do Cụ thể, chất chống oxi hóa có electron dư thừa để cung cấp cho gốc tự do, làm gốc tự do ổn định hơn, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự do [69]

Trong cơ thể con người có sẵn một vài loại enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều gốc tự do làm hại tế bào như: superoxit dismutase (SOD), phân hóa tố trong nhiều

tế bào (như hồng cầu và gan) hoặc glutathione periodase Tuy nhiên vì số lượng gốc tự

do trong cơ thể quá nhiều nên phải nhờ đến những chất chống oxi hóa từ bên ngoài vào theo dạng thức ăn và nước uống

Mangiferin là một trong những chất kháng oxi hóa lí tưởng dựa trên cơ sở là kiềm hãm các quá trình oxi hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do Khi đưa mangiferin vào

cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh

lí (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa) Chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo ra bởi mangiferin phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào phản ứng oxi hóa tiếp theo Kết quả là hạn chế bệnh lí

do cắt đứt dây chuyền [70]

1.2.1.3 Phương pháp kháng oxi hóa

➢ Kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc

tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay

Những electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517nm và hợp chất này có màu tím Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH

Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của mangiferin còn được xác định dựa vào giá trị

độ hấp thụ ban đầu) [7, 45]

➢ Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt

Phương pháp khử sắt dựa trên nguyên tắc khi có sự hiện diện của chất kháng oxy

hiện ở bước sóng 700 nm Nồng độ chất kháng oxy hóa càng cao thì phức tạo ra càng nhiều dẫn đến giá trị mật độ quang ở bước sóng 700 nm sẽ càng tăng [7]

oxy hóa của chất khảo sát Khả năng kháng oxy hóa của mangiferin dựa trên khả năng

1.2.2.2 Cơ chế tác động lên vi khuẩn

bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

lọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy làm cho một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrmidin, purin loạt qua màng nguyên sinh chất đi ra ngoài

1.2.2.3 Nguyên tắc kháng khuẩn

Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ

chiết được xác định dựa vào sự hình thành vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy tẩm cao chiết

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ dịch chiết thấp nhất mà xuất hiện vòng

vô khuẩn Do đó, nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao

1.3 Phương pháp tinh sạch truyền thống bằng sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau

Bột lá xoài sau khi được chiết thu được cao chiết lá xoài Trong cao này ngoài mangiferin còn rất nhiều hợp chất khác Do đó phải tiến hành tinh sạch để thu mangifeirn

độ tinh khiết cao và ứng dụng vào các sản phẩm thực phẩm

Hiện nay có phương pháp tách chiết các chất ra khỏi một hỗn hợp nhờ sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và đã được các nhà khoa học ứng dụng để các hợp chất quý từ thảo dược [5, 8]

1.3.1 Cơ sở của phương pháp

Nguyên tắc là sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để tách các hợp chất có độ phân cực khác nhau ra khỏi hỗn hợp Dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực Do đó cần lựa chọn các dung môi và quy trình phù hợp để loại bỏ từng chất phù hợp ra khỏi mẫu, điều này phụ thuộc vào đặc tính của các chất có trong mẫu cần khảo sát [4]

1.3.2 Lựa chọn dung môi và các yêu cầu

➢ Khái niệm và phân loại dung môi [67]

Dung môi là một chất lỏng, rắn, hoặc khí dùng để hòa tan một chất tan rắn, lỏng, hoặc khí khác, tạo thành một dung dịch

Dung môi có thể được chia thành hai loại: phân cực và không phân cực Các hằng

số điện môi của dung môi phản ánh sơ bộ tính phân cực của dung môi Hằng số điện môi là khả năng làm giảm cường độ trường điện xung quanh một hạt tích điện nằm trong

đó

Tính phân cực mạnh của nước được lấy làm chuẩn Ở 20 °C, hằng số điện môi của nước là 80,10 Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ hơn 15 thường được coi là dung môi không phân cực (ví dụ như hexan, benzene, diethyl ether,cloroform, ) Các dung môi có hằng số điện môi lớn hơn 15 gọi là dung môi phân cực và được chia thành protic và aprotic:

- Các dung môi aprotic: Có xu hướng mang moment lưỡng cực lớn (tách một phần điện tích dương và một phần điện tích âm trong cùng một phân tử) và hòa tan các dạng mang điện tích dương thông qua lưỡng cực âm, ví dụ như dung môi ethyl acetate, acetone, dimethyl sulfoxide,

- Dung môi protic: hòa tan anion (các chất tan mang điện tích âm) rất mạnh nhờ liên kết hydro, ví dụ như: n- butanol, ethanol, methanol, nước,…

Tùy vào tính phân cực của từng dung môi, chúng khả năng hòa tan các nhóm chức hóa học riêng Khả năng hòa tan của dung môi thường đối với một nhóm chức hóa học, trong khi đó một hợp chất thiên nhiên thường có hai hay nhiều nhóm chức hóa học

có tính phân cực khác biệt nhau Vì vậy cần lựa chọn dung môi phù hợp và không có quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm Căn cứ vào tính phân cực của dung môi và các hợp chất thiên nhiên có thể sử dụng dung môi thích hợp để tách các cao phân đoạn riêng

➢ Yêu cầu dung môi

được hợp chất cần khảo sát

như dietyl eter, cacbon tetraclorua…

tinh, do trong dung môi thường chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất là chất làm dẻo hóa

Ưu điểm: quy trình đơn giản, tiết kiệm được thời gian, có thể sản xuất công nghiệp

dễ dàng

Nhược điểm: sử dụng dung môi hữu cơ lớn có thể gây ảnh hưởng không tốt cho

người thí nghiệm, thiết bị phức tạp, xử lý nhiều tạp chất dẫn đến thu được mangiferin

có độ tinh khiết thấp

Sau khi sử dụng các dung môi để tách các chất khác nhau ra khỏi hỗn hợp, có thể

để định tính các thành phần trong từng phân đoạn dựa vào kĩ thuật sắc ký bản mỏng, sử dụng chất đối chứng là chất chuẩn Đây là kĩ thuật đơn giản, dễ thực hiện và độ chính xác cao, được ứng dụng nhiều trong kĩ thuật phân tích

1.3.3 Định tính bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng

1.3.3.1 Khái niệm

Sắc ký bản mỏng (sắc ký lớp mỏng) là kỹ thuật sắc ký dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi đi qua pha tĩnh là một chất trơ (silicagel, alumina…) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một

một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng để tìm hiểu đặc điểm hợp chất vừa cô lập, tìm hiểu sơ bộ về tính chất (độ tinh khiết, định lượng, tính phân cực) của mẫu cần khảo sát [5, 70]

- Mẫu cần phân tích: Thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5 %, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

- Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Hình 1.4 thể hiện sự dịch chuyển của các hợp chất trên sắc ký lớp mỏng

Hình 1.4 Sự dịch chuyển của các hợp chất trên sắc ký lớp mỏng [68]

- Hiện hình các vết sau khi cho pha động chạy qua: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp vật lý (phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV) hay dùng phương pháp hóa học (bằng cách dùng thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid, vitamin hay carotenoid, )

- Sắc ký bản mỏng sử dụng để xác định đặc điểm của một hợp chất hay nhiều hợp

một cách tương đối và độ phân cực của các hợp chất trong hỗn hợp Đối với một hợp

dung môi xác định, bởi bản sắc ký trong một lô sản xuất nhất định

𝑅𝑓 = 𝑎𝑏Trong đó:

b: đoạn đường di chuyển của dung môi

- Loại bản mỏng silicagel hoặc alumina của hãng nào

- Hoạt độ của bản lúc sử dụng tùy vào thời gian cất giữ

- Độ dày của bản

- Thành phần của dung môi dung ly

- Kỹ thuật ly giải: đi lên hay đi xuống

- Lượng mẫu chấm lên bản mỏng

1.3.3.3 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng

- Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ để phân tích

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích

- Tất cả các hợp chất trong mẫu có thể định vị trên tấm sắc ký

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.4.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 2011, Trần Kim Tuyến, khoa Sư phạm Đại học Cần Thơ đã thực hiện ly trích và tinh sạch mangiferin từ lá xoài [8]

Cũng vào năm 2011, Nguyễn Thị Thúy Anh, đã chứng minh trong thân cây xoài chứa mangiferin tới 3%, lá xoài chứa khoảng 1,6% mangiferin Chất này trong lá xoài

là chất chống viêm, nó còn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương rất mạnh, bảo vệ răng miệng, chống bựa răng và các mảng phủ quanh chân răng Nghiên cứu này chứng tỏ rằng mangiferin có khả năng kháng khuẩn sâu răng rất tốt [9]

Năm 2016, Nguyễn Ngọc Thanh và nhóm nghiên cứu tại viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã thực hiện nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập hoạt chất mangiferin

từ lá cây Dó bầu Aquilaria crassna Pierre và bào chế sản phẩm ứng dụng trong sản xuất

thực phẩm chức năng” Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của mangiferin cho

thể hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm ở nồng độ

128 µg/ml [10]

Năm 2016, Lương Thị Mỹ Ngân và cộng sự đã sử dụng các dung môi hexan, ethyl acetate để tách cao thô ethanol từ cây Dâm bụt thành các cao phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng [11]

Năm 2018, Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang thực hiện nghiên cứu

“Khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng cả dịch trích methanol lá xoài

non (Mangifera indica L.)” Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương

pháp trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), khử sắt (RP) và 2,

27,64 ± 0,88; 12,11 ± 1,15 và 45,7± 0,50 µg/mL Kết quả chứng minh, lá xoài non có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường theo cơ chế kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào β của tụy tạng khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất [4]

Nguyễn Thị Ái Lan cũng chứng minh hiệu quả hạ glucose huyết của cao chiết lá

xoài non (Mangifera indica L) trên chuột bệnh đái tháo đường [12]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Mangiferin đã được Garter (1992) và Wiechowski (1923) phân lập, Iseda (1957)

và Ramanahan, Seshari (1960) đã nghiên cứu cấu trúc hoàn chỉnh của mangiferin

Guha (1996) và Wang (2011) đã chứng minh mangiferin thể hiện hoạt động ức chế tốt đối với sự sao chép của HIV-1, dựa trên tính nhạy cảm với proteaza [48, 49]

Năm 2001, Yoshimi chứng minh mangiferin có tác dụng chống ung thư ruột kết (tế bào F344) gây ra bởi chất ung thư hóa học sssazoxymethane (AOM) [50] Đến năm

2008, Rajendran kết luận mangiferin có tác dụng chống ung thư phổi [51] Và vào năm

2017, có tác dụng chống ung thư dạ dày (tế bào AGS) đã được Zhang và Yue chứng minh [52]

Năm 2005, Stoilova I và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của mangiferin Kết quả cho thấy mangiferin có hoạt tính chống lại bảy loài vi

khuẩn: Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

citreus, Escherichia coli, Salmonella agona, Klebsiella pneumoniae, một nấm men: Saccharomyces cerevisiae và bốn loại nấm: Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei, Aspergillus flavus và Aspergillus fumigatus [53]

Năm 2007, Carvalho và cộng sự đã chứng minh mangiferin giảm khả năng bị ung

thư dạ dày do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra Ngoài ra, mangiferin còn có tác dụng

bảo vệ dạ dày chống lại tổn thương dạ dày do ethanol và indomethacin gây ra thông qua các cơ chế hoạt động chống oxy hóa [54]

Năm 2008, Stoilova I và cộng sự tiếp tục nghiên cứu các đặc tính chống oxy hóa của mangiferin trong axit linoleic/ hệ nhũ tương nước bởi các chất phản ứng acid thiobarbituric và bằng cách ức chế sự hình thành liên hợp của các điện cực Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng mangiferin có thể là một tác nhân chống oxy hóa đầy hứa hẹn [55]

Năm 2010, Li Xuejian, Du Zhengcai, Đặng Gia Cương sáng chế tiết lộ phương pháp điều chế mangiferin, phương pháp đặc trưng sử dụng dung dịch kiềm, quy trình bao gồm cá bước sau: ngâm bột mangiferin trong dung dịch kiềm đun nóng trong 30-50 phút, lọc thu được dung dịch sau đó thêm tiếp dung dịch kiềm đun nóng trong 10-30 phút thu được dịch chiết sau hai lần lọc, thêm dung dịch axit vào để kết tủa, lọc loại bỏ tạp chất và thu được mangiferin có độ tinh khiết cao 95% Phương pháp này có một quy trình đơn giản và phù hợp cho sản xuất công nghiệp [72]

Cũng vào năm 2010, Yan Lixin, Zhang Wei, Gao Xiaohui đưa ra phương pháp điều chế mangiferin bằng các dung môi: sử dụng dung dịch hỗn hợp của nước và rượu

để chiết xuất, dung dịch được lọc, cô đặc dung dịch lọc rồi chiết dung dịch cô đặc bằng dung môi hữu cơ, sau đó kết tinh lại với dung dịch acetone, thu được mangiferin Sử dụng phương pháp này có thể rút ngắn thời gian, tốc độ truyền được cải thiện [73] Năm 2010, Dineshkumar cùng cộng sự đã nghiên cứu về tiềm năng đái tháo đường và hạ đường huyết của mangiferin (Xanthone Glucoside) trên streptozotocin - gây ra chuột mô hình tiểu đường loại 1 và loại 2 [56]

Kết luận: Mangiferin là hợp chất có hoạt tính sinh học chính ở trong lá xoài (Mangifera

Indica L) có tác dụng chống viêm, chống oxi hóa, chống bệnh tiểu đường, điều hòa hệ

miễn dịch và chống ung thư…Ở nước ta hiện nay, người dân trồng cây xoài chủ yếu để lấy quả nhằm xuất khẩu ra các thị trường Mỹ, Úc, Nhật,… còn những bộ phận khác của cây xoài, nhất là phần lá chứa một lượng lớn các chất có hoạt tính sinh học cao nhưng vẫn chưa được nghiên cứu và sử dụng Do đó, việc sử dụng lá xoài để trích ly mangiferin

sẽ cho hiệu suất thu hồi cao, đồng thời tận dụng được nguồn lá bị cắt tỉa sau mỗi mùa

vụ mang lại giá trị kinh tế cao cho cây xoài Trong khi đó, dịch chiết từ lá xoài ngoài mangiferin còn có nhiều chất khác Chính vì vậy cần tiến hành làm sạch mangiferin để

có thể ứng dụng vào các sản phẩn hỗ trợ cho người bị bệnh tiểu đường Hiện nay, có phương pháp làm sạch bằng cách sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau để tách mangiferin từ dịch lá xoài dựa trên tính phân cực của mangiferin Ở Việt Nam hiện nay hầu như không có nghiên cứu nào nghiên cứu hoạt tính sinh học của mangiferin được

làm sạch bằng phương pháp này Do đó, đề tài “Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp truyền thống và đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài” được đề xuất để thực hiện nhằm đáp ứng kịp nhu cầu hiện nay của người tiêu dùng

về các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Lá xoài

Lá xoài keo được thu hái tại thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa thiên Huế Lá xoài sau

đó nghiền mịn thành bột và rây để đạt kích thước đồng đều hơn Tiến hành bao gói trong các túi zip để tránh hút ẩm và bảo quản ở nhiệt độ thường

Hình 2.1 Bột lá xoài

Thời gian thu nhận mẫu: từ tháng 1 năm 2019

Địa điểm tiến hành: Phòng phân tích, Viện Công Nghệ Sinh học, Đại học Huế

2.1.2 Mangiferin chuẩn

Mangiferin chuẩn 98,6% được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương như hình 2.2

Hình 2.2 Mangiferin chuẩn

- Môi trường Luria – Bertani (LB) có thành phần: pepton, agar, nấm men, NaCl

- Môi trường pepton kiềm có thành phần: pepton, agar, NaCl

2.2.3 Thiết bị

Một số thiết bị sử dụng trong đề tài bao gồm:

- Thiết bị siêu âm dạng bể

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Chiết mangiferin từ lá xoài bằng các phương pháp và dung môi khác nhau

- Chiết mangiferin bằng hai phương pháp: siêu âm bể (phương pháp hiện đại), Soxhlet (phương pháp truyền thống)

- Dung môi sử dụng: ethanol và nước

- Cô quay dịch chiết để thu cao tổng

2.4.2 Định tính và định lượng mangiferin trong các cao chiết lá xoài

- Định tính mangiferin bằng sắc ký lớp mỏng

- Định lượng mangiferin bằng phương pháp quang phổ UV-VIS

2.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết lá xoài

- Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các cao chiết

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn các cao chiết

- Lựa chọn cao chiết tối ưu về hàm lượng mangiferin và hoạt tính sinh học để tinh sạch

2.4.4 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Lựa chọn dung môi có độ phân cực khác nhau

- Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian

- Định tính và định lượng mangiferin tinh sạch thu được

2.4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin sau tinh sạch

- Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của mangiferin tinh sạch, của các cao phân đoạn thu được trong quá trình tinh sạch, mangiferin chuẩn và vitamin C

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch, các cao phân đoạn thu được trong quá trình tinh sạch, mangiferin chuẩn và đối chứng dương kháng sinh ampicillin

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp chiết mangiferin bằng dung môi nước và ethanol 60°

2.5.1.1 Chiết mangiferin bằng phương pháp Soxhlet

➢ Dung môi nước

Điều kiện tốt nhất của phương pháp chiết Soxhlet trong dung môi nước là: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) là 1/30 và thời gian chiết là 8 giờ

Quá trình chiết tiến hành ở tỉ lệ w/v là 1/15, thời gian chiết 4 giờ và dung môi ethanol

600 (hình 2.4)

Hình 2.4 Phương pháp chiết Soxhlet

2.5.1.2 Chiết mangiferin bằng phương pháp siêu âm bể

➢ Dung môi nước

Điều kiện tốt nhất của phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm trong dung môi nước

là: tỉ lệ w/v là 1/10, nồng độ ethanol 600, nhiệt độ siêu âm 60oC và thời gian siêu âm 4 phút

Hình 2.5 Phương pháp chiết siêu âm bể Như vậy, sau khi chiết lá xoài với hai phương pháp lần lượt với hai dung môi khác nhau ta thu được bốn loại dịch chiết: dịch siêu âm - ethanol, dịch siêu âm - nước,

dịch Soxhlet – ethanol và dịch Soxhlet - nước [13, 14]

2.5.2 Phương pháp cô đặc dịch chiết

Dịch chiết sau khi trích ly được thu hồi và tiến hành cô quay để giảm bớt thể tích dung môi Cao này có thể ở dạng khô, dạng dẻo sệt hoặc dạng dầu sệt tùy thuộc vào tính chất của các cấu tử có trong cao

Hàm mục tiêu ở quá trình cô đặc dịch chiết là: Cao cần loại bỏ hết dung môi còn sót lại để tránh phản ứng phụ có thể có Từ bốn loại dịch chiết ta cô quay và thu được bốn loại cao chiết: cao siêu âm - ethanol, cao siêu âm - nước, cao Soxhlet – ethanol và cao Soxhlet - nước Trong các loại cao chiết thô này ngoài mangiferin còn có nhiều loại tạp chất khác Thiết bị cô quay và sản phẩm cao thô đươc thể hiện như hình 2.5

a Bộ cô quay b Cao thô

Hình 2.6 Cô quay thu cao thô

2.5.3 Phương pháp định tính và định lượng mangiferin trong cao chiết thô và cao tinh sạch

2.5.3.1 Phương pháp định tính bằng sắc ký bản mỏng

Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với các điều kiện sau:

- Pha tĩnh bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merk): 1 x 5cm

bước sóng 254nm cho vết màu vàng

- Tiến hành:

+ Dùng bút chì kẽ vạch xuất phát

+ Dùng micropipet nhỏ dịch lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng cần thận, tránh làm lũng bề mặt lớp mỏng

+ Sấy nhẹ để dung môi bay khỏi vết chấm, rồi nhúng vào pha động

+ Tiếp tục sấy để bay dung môi sau khi nhúng

Để định lượng hàm lượng các chất có trong nguyên liệu ta có các phương pháp như phương pháp cân, phương pháp đo quang, phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC Phương pháp cân thì đơn giản nhưng độ chính xác không cao, phương pháp HPLC tuy

có độ chính xác cao hơn nhiều nhưng khá phức tạp và tốn kém Do đó, với mục đích xác định hàm lượng mangiferin có trong dịch chiết một cách tương đối chính xác và không tốn nhiều chi phí, phương pháp đo độ hấp thụ phân tử UV-VIS được đề xuất để sử dụng

chuẩn mangiferin

Nguyên tắc: Để xác định một hợp chất nào đó, ta chuyển nó thành dung dịch màu

có khả năng hấp thụ ánh sáng rồi đo sự hấp thụ ánh sáng của nó, từ đó suy ra hàm lượng chất cần xác định theo định luật Lambert - Beer: D = .l.C Mật độ quang đo được ngoài tính chất tuyến tính với nồng độ dung dịch còn có đặc tính quan trọng là tính cộng tính, tức là giá trị đó là tổng giá trị các mật độ quang của các chất có trong dung dịch [15]

Phương pháp xây dựng đường chuẩn mangiferin được dựa trên nghiên cứu của XIE Yu-qi và cộng sự đã công bố thì mangiferin có khoảng bước sóng hấp thụ khá rộng, nhưng chúng hấp thụ tốt trong khoảng bước sóng 200 – 300 nm Chính vì vậy, tôi sử dụng khoảng bước sóng trên để khảo sát trên dung dịch mangiferin chuẩn và dịch chiết

lá xoài [57]

a) Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của mangiferin chuẩn

Mục đích: Để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của mangiferin chuẩn Từ đó

xây dựng đường chuẩn để định lượng hàm lượng mangiferin có trong dịch chiết lá xoài

Phương pháp tiến hành: Cân 2 mg mangiferin chuẩn hòa tan trong 5 ml dung môi

ethanol 60°, sau đó đem đi quét phổ ở bước sóng từ 200 - 300 nm

b) Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch chiết lá xoài

Mục đích: để xác định dịch chiết lá xoài có hấp thụ cực đại ở bước sóng trùng

với bước sóng mangiferin chuẩn hay không Từ đó khẳng định trong dịch chiết lá xoài

có mangiferin

Phương pháp tiến hành: Dịch chiết lá xoài được quét ở bước sóng từ 200 - 300

nm Nếu bước sóng hấp thụ cực đại trùng với bước sóng hấp thụ cực đại của mangferin chuẩn thì khẳng định rằng trong dịch chiết lá xoài có mangiferin

Mục đích: Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng có thể tính được hàm lượng

mangiferin có trong mẫu dịch chiết

Phương pháp tiến hành: Ta tiến hành xây dựng đường chuẩn trong dung môi là

ethanol 60° Cân 2 mg mangiferin chuẩn hòa tan trong 5ml dung môi ethanol 60° Pha loãng dịch trên theo hệ số 2 và tiến hành đo quang ở các nồng độ và xây dựng đường chuẩn phụ thuộc giữa giá trị mật đọ quang và nồng độ mangiferin

Dựa vào đường chuẩn và công thức 2.1 ta có thể định lượng hàm lượng mangiferin có trong cao chiết thô và mangiferin tinh sạch

- v: thể tích mẫu đo quang (ml)

- n: độ pha loãng

2.5.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết thô và mangiferin tinh sạch

a) Mục đích

Khẳng định sự có mặt của các chất chống oxy hóa cũng như đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ lá xoài và mangiferin tinh sạch được từ cao chiết

b) Trình tự thực hiện