Phân lập, định danh và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của vi khuẩn lactic từ kim chi

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất hydratcarbon sử dụng trong kit API CH50 Bảng 1.2 Một số thành phần chính của biofilm Bảng 1.3 Một số vai trò của màng biofilm Bảng 2.1 Các mẫu

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HỮU TRUNG

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN HỮU TRUNG

MÃ SINH VIÊN: 1401644

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN

CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Đinh Thúy Hằng

2 PGS.TS Phùng Thanh Hương

Nơi thực hiện:

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học,

Đại học Quốc gia Hà Nội

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận, em đã luôn nhận

được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các thầy, cô giáo cũng như sự quan tâm chăm sóc từ

gia đình và bạn bè Đó là nguồn động lực giúp em vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành

khóa luận này

Đặc biệt, cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Đinh Thúy Hằng -

cán bộ tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dìu dắt,

hướng dẫn, giúp em hòa nhập với môi trường nghiên cứu khoa học, tạo mọi điều kiện thuận

lợi nhất cho em trong suốt quá trình làm thực nghiệm và viết khóa luận Qua đó em đã biết

cách tiếp cận một nghiên cứu khoa học và có hành trang vững chắc cho con đường sau này

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất , em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS

Phùng Thanh Hương - người thầy tâm huyết đã tận tình giúp đỡ em từ những ngày đầu

làm khoa học Cô đã truyền cảm hứng cho em và khơi gợi niềm đam mê nghiên cứu trong

em Không những vậy, cô luôn theo sát em trong suốt quá trình làm khoa học, kịp thời đưa

ra những lời khuyên bổ ích và những bài học về kĩ năng sống Từ đó, bản thân em đã trưởng

thành và tự tin hơn trong con đường làm nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Hồng Minh, cán bộ phòng Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà

Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện, hướng dẫn em có thể hoàn thành khóa luận của

mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cán bộ trong Viện Vi sinh vật và

Công nghệ Sinh học, gia đình, người thân và các bạn bè luôn ở bên giúp đỡ, động viên em

vượt qua những khó khăn trong học tập suốt những năm vừa qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Đoàn Hữu Trung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) 2

1.1.1 Khái niệm và môi trường sống của LAB 2

1.1.2 Đặc điểm sinh học và di truyền của LAB 2

1.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn của LAB 4

1.1.4 Ứng dụng của LAB trong lĩnh vực y dược 5

1.2 Định danh LAB 6

1.2.1 So sánh trình tự 16S rADN 6

1.2.2 Xác định các đặc tính sinh lý, hóa sinh 7

1.3 Biofilm 8

1.3.1 Khái niệm và cấu trúc 8

1.3.2 Sự hình thành và vai trò của biofilm đối với vi khuẩn 9

1.3.3 Khả năng hình thành biofilm ở các loài vi khuẩn 13

1.3.4 Tác dụng ức chế hình thành biofilm của vi khuẩn có lợi và ứng dụng 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 15

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phân lập LAB từ kim chi 19

2.3.2 Định danh các chủng LAB dựa trên so sánh trình tự 16S rADN 20

2.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 22

2.3.4 Đánh giá khả năng LAB ức chế hình thành biofilm 22

2.3.6 Xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi 25

3.2 Định danh vi khuẩn lactic 28

3.2.1 Kết quả tách ADN tổng số 28

3.2.2 Kết quả khuếch đại 16S rADN, giải trình tự và dựng cây phân loại 30

3.3 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng LAB phân lập 34

3.4 Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm 35

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

AHLs N-acyl-homoserin lactons

API CH Analytical Profile Index Carbohydrat Chỉ số hồ sơ phân tích Carbohydrat ARN Acid ribonucleic

ATP Adenosine triphosphate

BK Bán kính

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS Extracellular polymeric substances Các hợp chất polymer ngoại bào GLP-1 Glucagon-like peptide 1 Peptid có cấu trúc giống glucagon

HACCP Hazard analysis and critical control points Các điểm về kiểm soát tới hạn và

phân tích nguy cơ LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic

LB Lysogeny broth

LPS Lipopolysaccharid

MQ Mili Q

MRS Man, Rogosa, Sharpe

OD Optical density Mật độ quang

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

QS Quorum sensing Cảm biến mật độ tới hạn

SDS Sodium dodecyl sulfate

Taq Thermus aquaticus

UV Ultraviolet Tia cực tím

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất hydratcarbon sử dụng trong kit API CH50

Bảng 1.2 Một số thành phần chính của biofilm

Bảng 1.3 Một số vai trò của màng biofilm

Bảng 2.1 Các mẫu kim chi Hàn Quốc sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic

Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS

Bảng 2.3 Thành phần môi trường LB

Bảng 2.4 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuyếch đại 16S rADN

Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi

Bảng 3.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Bảng 3.3 Kết quả so sánh trình tự 16S rADN của các chủng LAB phân lập với dữ liệu

GenBank

Bảng 3.4 Kết quả đo mật độ quang của 2 chủng kiểm định trên 3 môi trường

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các chi vi khuẩn lactic

Hình 1.2 Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật

Hình 2.1 Thiết kế thí nghiệm

Hình 3.1 Hình ảnh phân lập LAB bằng kỹ thuật ống thạch bán lỏng

Hình 3.2 Hình ảnh tinh sạch LAB bằng kỹ thuật cấy trải trên đĩa thạch MRS

Hình 3.3 Ví dụ hình ảnh hình thái tế bào của một số chủng phân lập được chụp bằng

kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần

Hình 3.4 ADN tổng số của các chủng LAB thuần khiết sau khi tách chiết

Hình 3.5 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của các chủng LAB

Hình 3.6 Cây phân loại của 12 chủng LAB phân lập được dựa trên so sánh trình tự

16S rADN

Hình 3.7 Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn trên S aureus và P aeruginosa

thuộc nhóm ESKAPE của các chủng LAB phân lập

Hình 3.8 Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của các chủng LAB

phân lập trên P.aeruginosa

Hình 3.9 Kết quả đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của các chủng LAB

phân lập trên S.aureus

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kim chi là một sản phẩm truyền thống ở Hàn Quốc được sản xuất bằng cách lên men rau củ cùng với các vi khuẩn có lợi Theo đó, kim chi được coi như một nguồn thực phẩm cung cấp probiotic và góp phần vào việc nâng cao sức khỏe của con người Kim chi có hàm lượng lớn các vitamin, các chất khoáng, chất xơ và một số thành phần khác Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, kim chi có hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, có thể làm giảm cholesterol, nâng cao sức khỏe và tăng cường hệ miễn dịch [51] Bên cạnh đó, hệ vi sinh

vật trong kim chi vô cùng phong phú, bao gồm nhiều loài vi khuẩn có lợi như: Leuconostoc

sp, Lactobacillus sp, Weissella sp và Lactococcus sp Theo đó, vi khuẩn lactic chiếm phần

lớn trong hệ vi sinh vật và chúng góp phần vào các đặc tính của kim chi [35] Nhiều nghiên cứu trước đó đã cho thấy các tác dụng có lợi của vi khuẩn lactic và tiềm năng ứng dụng của chúng trong ngành y dược Nghiên cứu về tác dụng của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi

đã chứng minh được chúng có hoạt tính chống oxi hóa, chống béo phì, chống đái tháo

đường và hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của Helicobacter pylori [35] Nghiên cứu của

Abreu và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng, so với người khỏe mạnh, vi khẩn lactic bao gồm

Lactobacillus sakei suy giảm trong hệ vi sinh vật trong xoang mũi ở người mắc viêm xoang

mạn tính [1] Thêm vào đó, theo kinh nghiệm dân gian tại Hàn Quốc, bằng cách nhỏ trực tiếp dịch kim chi có thể làm giảm các triệu chứng của viêm xoang mạn tính Trong khi đó, hầu như chưa có công bố chính thức nào chứng minh cơ sở khoa học của cách điều trị dân gian này

Với những lí do trên, để góp phần cung cấp thêm thông tin về các tác dụng có lợi của vi khuẩn lactic từ kim chi và tiềm năng ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y dược tại

Việt Nam, đề tài “Phân lập, định danh và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của vi

khuẩn lactic từ kim chi” đã được triển khai với 2 mục tiêu sau:

1 Phân lập và định danh vi khuẩn lactic từ kim chi

2 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh và tác dụng kháng biofilm của vi khuẩn lactic từ kim chi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB)

1.1.1 Khái niệm và môi trường sống của LAB

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn được đặc trưng bởi quá trình sinh ra acid lactic - sản phẩm chuyển hóa cuối cùng khi vi khuẩn này lên men đường glucose Trong nhóm vi khuẩn LAB, các loài lên men đồng hình chỉ tạo ra acid lactic là sản phẩm lên men chính (<85%), trong khi các loài lên men dị hình ngoài acid lactic còn tạo ra CO2, ethanol hoặc acid acetic Ít nhất 50% lượng carbon trong sản phẩm lên men cuối cùng của LAB có nguồn gốc từ acid lactic [40]

LAB sống trong các môi trường giàu dinh dưỡng, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện Môi trường nuôi cấy LAB cần nhiều chất dinh dưỡng như carbohydrat, amino acid, peptid, các acid béo, các dẫn chất của acid nucleic, vitamin và chất khoáng Trong tự nhiên, LAB có mặt trong các hốc tự nhiên của người và động vật, các nguyên liệu đang phân hủy có nguồn gốc thực vật, một số loại rau củ quả (củ cải đường, khoai tây, dưa bắp cải), đồ uống và thức

ăn lên men (nước hoa quả, các sản phẩm từ sữa và cá lên men) Chúng còn là một phần trong hệ vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của người [40]

1.1.2 Đặc điểm sinh học và di truyền của LAB

LAB là vi khuẩn gram dương, tế bào thường không di động, không sinh bào tử và

sinh acid lactic - sản phẩm lên men đường chính LAB hiện tại được xếp vào ngành

Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Latobacillales và được phân loại dựa theo đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, đặc điểm phân tử, cách lên men glucose, khoảng nhiệt độ phát triển [53] [5] Ngoài ra, chúng không mang cytochrom (sắc tố tế bào có bản chất là hemeprotein gắn màng có vai trò tổng hợp ATP) và không có khả năng tổng hợp porphyrin - một thành phần trong nhân hem Thay vào đó, LAB thường sử dụng quá trình phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất hơn là sử dụng chuỗi truyền điện tử hay phosphoryl oxi hóa để tạo ra năng lượng [73]

Nhóm vi khuẩn lactic có 14 chi, bao gồm: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella, trong đó Lactobacillus là chi lớn nhất với hơn 100 loài [72] Chi Bifidobacterium không thuộc họ

Lactobacilliceae nhưng được xếp vào nhóm LAB do khả năng sinh ra acid lactic và acid

acetic trong quá trình lên men đường [44] Mối liên hệ giữa các chi thuộc nhóm LAB được

thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1: Cây phát sinh chủng loại các chi vi khuẩn lactic [40]

Hệ gen của LAB có tỷ lệ G+C < 55 mol% trong ADN và có kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb [79] Bên cạnh đó, nhiều loài LAB mang plasmid và các plasmid đa dạng về cả kích thước lẫn thành phần gen (gene content) Nhiều plasmid mang gen có tiềm năng giúp cho

tế bào vi khuẩn thích nghi được với môi trường vì các gen này mã hóa cho bacteriocin, acid amin, hệ vận chuyển đường và hệ thống giới hạn – cải biến (restriction-modification system) giúp chống lại các ADN ngoại lai nhờ các enzym cắt giới hạn [79] [59]

1.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn của LAB

Nhiều loài LAB có thể ức chế vi khuẩn thông qua khả năng cạnh tranh của tế bào, giảm pH môi trường, sản xuất ra các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn, bao gồm các acid hữu cơ và các peptid kháng khuẩn - được gọi chung là bacteriocin Các acid hữu cơ như acid lactic được tạo ra bởi LAB có thể ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn, đặc

biệt là các vi khuẩn gây bệnh gram âm như Escherichia coli, Salmonella enterica Các acid

hữu cơ do LAB tạo ra có khả năng thấm vào màng tế bào chất làm giảm pH nội bào và tiêu diệu tế bào vi khuẩn Trong khi đó, LAB có thể tồn tại trong môi trường pH bằng 4 hoặc thậm chí pH bằng 2 do chúng có khả năng điều hòa tế bào chất và pH nội bào đến gần pH trung tính trong suốt quá trình tăng trưởng hoặc bảo quản trong môi trường pH thấp [32] Ngoài ra, một số loài LAB có khả năng sản sinh ra bacteriocin (có bản chất là peptid), có thể kháng lại các vi khuẩn ngay cả ở nồng độ nano mol và pico mol Bacteriocin từ LAB tạo ra các hốc trên màng tế bào đích và xuyên thủng màng tế bào, từ đó gây ra sự thoát ion, ATP và các chất cần thiết cho các chức năng chuyên biệt và chuyển hóa tế bào [39][42]

Theo đó, LAB và bacteriocin sakacin P đã được đề xuất sử dụng để ức chế Listeria monocytogenes [39]

Nghiên cứu của Sikorska và cộng sự (2013) đã khẳng định vai trò của LAB trong

phòng và điều trị nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng kháng meticilin Các chủng Lactobacillus như L plantarum, L paracasei, L acidophilus và Bifidobacterium được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và S.aureus kháng meticilin

chứng minh được rằng LAB có khả năng ức chế một sự sinh trưởng của một số chủng vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh tế bào trực tiếp hoặc tiết ra acid hữu cơ, bacteriocin [65]

1.1.4 Ứng dụng của LAB trong lĩnh vực y dược

1.1.4.1 Probiotic

LAB là một nhóm probiotic quan trọng được dùng trong điều trị các rối loạn về tiêu hóa và chức năng dinh dưỡng như không có khả năng dung nạp lactose, dị ứng thức ăn, tiêu chảy cấp có nhiễm khuẩn, viêm khớp dạng thấp và ung thư đại tràng [21]

Các sản phẩm sữa lên men như sữa chua, sữa chua uống và phô mai là các dạng thực phẩm giúp đưa LAB vào cơ thể dễ dàng nhất Đối với công nghiệp dược, các chủng LAB

có mặt trong các sản phẩm ở dạng tế bào sống nhờ các kỹ thuật vi bao làm tăng tỷ lệ sống sót của LAB qua các bước của quy trình sản xuất cũng như các điều kiện khắc nghiệt (pH thấp, nồng độ muối mật và các enzym tiêu hóa cao) trong hệ tiêu hóa của vật chủ Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy việc sử dụng vi nang polymer như một hệ vận chuyển LAB mang lại nhiều ứng dụng trong ngành dược [21]

1.1.4.2 Điều trị béo phì, hạ cholesterol

Trong nghiên cứu của Kadoka và cộng sự (2010), các yếu tố môi trường trong đường

ruột có liên quan đến bệnh béo phì ở người Việc sử dụng Lactobacillus gasseri SBT2055

có thể làm giảm mỡ bụng, trọng lượng cơ thể, BMI và vòng hông Các sản phẩm probiotic

có chứa LAB có thể được sử dụng để cải thiện chức năng bảo vệ đường ruột của cơ thể, từ

đó phòng tránh được các tình trạng viêm và nhiễm khuẩn [38] Theo nghiên cứu của Ouweh

và cộng sự (2000), LAB có thể làm giảm khả năng tiết lipopolysaccharid (LPS) từ các tế bào biểu mô ruột cũng như giảm khả năng sản xuất ra cytokin tiền viêm ở các mô mỡ, điều hòa chuyển hóa lipid, từ đó làm giảm liều statin cần thiết (thuốc ức chế tổng hợp cholesterol)

và giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương Ngoài ra, một số loài LAB như L paracasei, L sakei có thể điều hòa enzym chuyển hóa năng lượng dẫn đến làm giảm lượng

cholesterol, triglyecerid trong máu, tiết ra một số enzym như glycosid hydrolase để phân cắt các polysaccharid từ thức ăn hằng ngày và tăng cường đáp ứng miễn dịch [49] [70]

1.1.4.3 Chống đái tháo đường typ 2

Tác dụng chống đái tháo đường của LAB đã được một số nhóm tác giả công bố Nghiên

cứu của Yun và cộng sự (2009) khảo sát tác dụng của Lactobacillus gasseri BNR17 lên

nồng độ glucose trong máu và trọng lượng cơ thể ở chuột mắc bệnh đái tháo đường typ 2

Kết quả theo dõi sau 6 tuần cho thấy, sử dụng BNR17 với liều 1010 cfu làm giảm chỉ số HbA1c so với nhóm đối chứng Mặc dù sự khác biệt chưa thực sự có ý nghĩa thống kê và tác dụng trên giảm dần sau 12 tuần, nhóm nghiên cứu vẫn kiên định với tiềm năng ứng

dụng Lactobacillus gasseri BNR17 trong điều trị đái tháo đường typ 2 [80] Trong một nghiên cứu khác, Honda và cộng sự (2012) cho thấy Lactobacillus rhamnosus GG làm giảm

đáng kể nồng độ glucose trong máu sau ăn ở chuột KK-Ay được cho ăn nhiều sucrose và

tinh bột Ngoài ra, một số loài LAB như L sakei và L plantarum có khả năng kích thích

tiết ra các hormon incretin (GLP-1) làm giảm glucose máu, tăng bài tiết insulin, ức chế enzyme dipeptididyl peptidase IV và tăng cường đáp ứng miễn dịch [21]

Là một nhóm vi khuẩn với nhiều loài có đặc tính sinh lý tương đồng, việc định danh khoa học cho một vi khuẩn lactic mới phân lập đôi khi cần được tiến hành từ nhiều hướng tiếp cận khác nhau Các bước cơ bản như giải trình tự 16S rADN và thực hiện các phản ứng sinh hóa cho phép định danh khoa học tới mức độ chi Trong khi đó, để định danh tới loài trong nhiều trường hợp cần so sánh các trình tự gen mã hóa cho các đặc tính riêng biệt và phân tích các đặc điểm sinh lý như khả năng chống chịu trong điều kiện pH thấp hay nồng

độ muối và muối mật cao, khả năng tạo ra các chất kháng khuẩn…[44]

1.2.1 So sánh trình tự 16S rADN

Trình tự 16S rADN được lựa chọn làm chỉ thị phân tử để đánh giá mối liên quan phylogeny giữa các loài Prokaryot do (i) tính phổ quát (phân tử 16S rARN có mặt ở mọi loài Prokaryot), (ii) tính bảo thủ về chức năng (tham gia quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào) và về cấu trúc (có tốc độ tiến hóa chậm) và (iii) xuất hiện rất sớm trong lịch

sử tiến hóa (gắn với chức năng sinh tổng hợp protein của tế bào), do vậy có thể lưu giữ được các biến đổi trong lịch sử tiến hóa [78] Ngoài ra, trình tự gen mã hóa cho 16S rARN

có độ dài xấp xỉ 1500 bp, đủ lớn để lưu giữ các biến đổi tiến hóa, đồng thời rất phù hợp cho các thao tác tin sinh học

Trên ngân hàng dữ liệu GenBank đã có hơn 20 triệu trình tự gen, trong đó có hơn

90000 trình tự gen 16S rARN, cho phép việc so sánh để tìm ra các loài gần gũi với độ tương đồng cao trong trình tự này ngày càng trở nên chính xác Theo quy ước hiện nay, hai loài sinh vật nhân sơ (Prokaryotes) có trình tự 16S rADN tương đồng từ 97% trở lên được coi

là giống nhau Tuy nhiên, chỉ dựa trên so sánh trình tự 16S rADN thì loài mới có thể được khẳng định tên chi tương tự như loài gần gũi nhất, còn tên loài mới dừng ở ký hiệu sp Để xác định một cách chính xác tên loài, cần bổ sung thông tin từ các phân tích sinh hóa, sinh

lý so sánh với loài gần gũi đã xác định được dựa trên so sánh trình tự 16S rADN [69]

1.2.2 Xác định các đặc tính sinh lý, hóa sinh

API CH 50 (BioMereux, Pháp) là một loại kit dùng để xác định nhanh phổ cơ chất hydratcarbon có thể được LAB sử dụng để lên men sinh acid lactic (Bảng 1.1) Phổ cơ chất này mang tính đặc thù đối với các loài LAB khác nhau, do vậy khi kết hợp với kết quả so sánh trình tự 16S rADN cho phép tiến gần hơn đến xác định tên loài [44]

Bảng 1.1: Các hợp chất hydratcarbon sử dụng trong kit API CH 50 [53]

1 Glycerol 17 Inositol 34 Melezitoza

2 Erythritol 18 Mannitol 35 D-Raffinoza

3 D-Arabinoza 19 Sorbitol 36 Tinh bột

4 L-Arabinoza 20 α-Methyl-d-mannosit 37 Glycogen

5 Riboza 21 α-Methyl-d-glucosit 38 Xylitol

6 D-Xyloza 22 N-Acetylglucosamin 39 Gentiobioza

7 L-Xyloza 23 Amygdalin 40 D-Turanoza

8 Adonitol 24 Arbutin 41 D-Lyxoza

9 β-Methy-xylosit 25 Esculine 42 D-Tagatoza

10 D-Galactoza 26 Salicin 43 D-Fucoza

11 D-Glucoza 27 Cellobioza 44 L-Fucoza

12 D-Fructoza 28 Maltoza 45 D-Arabitol

13 D-Mannoza 29 Lactoza 46 L-Arabitol

14 L-Sorboza 30 Melibioza 47 Gluconat

15 Rhamnoza 31 Sucroza 48 2-Ketogluconat

16 Dulcitol 32 Trehaloza 49 5-Ketogluconat

33 Inulin

Các đặc tính như khả năng chịu pH thấp, nồng độ muối hoặc muối mật cao cũng thường được phân tích để xác định vị trí phân loại cũng như tiềm năng ứng dụng của chủng LAB [27], trong khi đó khả năng sinh các chất kháng khuẩn như acid lactic và bacteriocin lại là đặc tính riêng của từng chủng LAB [20]

1.3 Biofilm

1.3.1 Khái niệm và cấu trúc

Biofilm là tập hợp gồm các quần thể vi sinh vật bám dính, phát triển trên một bề mặt các môi trường khác nhau và được bao bọc bởi mạng lưới polymer ngoại bào được sản sinh bởi chính các tế bào vi sinh vật Các tế bào vi sinh vật cư trú trong biofilm được bao bọc trong chất nền có thành phần chính là các polymer sinh học ngoại bào (EPS), gồm polysaccharid, protein, lipid, acid nucleic [22] [4] Trong biofilm, các tế bào vi sinh vật chỉ chiếm dưới 10% trọng lượng khô trong khi EPS chiếm trên 90% Sự hình thành và duy trì

sự ổn định một quần thể vi sinh vật phần lớn phụ thuộc vào sự hình thành và chất lượng của EPS [67] Nồng độ, sự gắn kết, điện tích, khả năng hấp phụ, tính đặc hiệu và tính chất của từng thành phần trong EPS cũng như cấu trúc 3 chiều của chất nền (matrix) quyết định đặc tính của biofilm Cấu trúc của biofilm bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như điều kiện thủy động, nồng độ các chất cấu thành, sự di động của vi sinh vật và tương tác giữa chúng [22] Một số thành phần chính và tính năng của chúng trong biofilm được trình bày tóm tắt tại bảng 1.2

-Heteropolysacchrid: gồm các polysaccharid không đồng nhất, có thể chứa các nhóm thế vô cơ/hữu cơ

Chất nền chủ yếu của biofilm, tạo mạng lưới làm giá thể bám cho tế bào

[75] [8]

khác nhau, ví dụ như alginat

Protein

Nhiều loại khác nhau, có trọng lượng lớn, tương đương hoặc cao hơn trọng lượng của polysaccharid trong biofilm

- Các enzym ngoại bào: giúp chuyển hóa các hợp chất cao phân

tử thành đơn phân/

hoặc làm chức năng bảo vệ, phân hủy các chất không có lợi cho

tế bào

- Các protein vận chuyển

[76] [58]

Lipid

Lypopolysaccharid là một thành phần cao phân tử chính của biofilm

- Đóng vai trò trong đặc tính bám dính của một số loài

- Góp phần tạo tính kỵ nước cho biofilm

- Đóng vai trò trong việc sáp nhập/phân tách của vi sinh vật

- Tạo tính kỵ nước cho toàn bộ cấu trúc

- Có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm

[2]

biofilm

Là môi trường để vận chuyển các chất trong chất nền biofilm

Hình 1.2: Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật [71]

Bước 1: Kết dính Đây là giai đoạn tiếp cận đầu tiên, các vi sinh vật bám dính và

sinh sản nhanh trên bề mặt Một số protein bề mặt (như protein gắn fibronectin, các yếu tố đông máu, các plasmid nhạy cảm với protein) có chức năng nhận biết các phân tử chất nền kết dính và được gắn với các thành phần của chất nền để bắt đầu cho sự kết dính, hình thành biofilm [46] Trong suốt quá trình này, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm như độ phân cực, lực Val Der Waals, tương tác kỵ nước [71]

Bước 2: Tích tụ và trưởng thành Sau khi các tế bào vi sinh vật gắn được trên bề

mặt thì chúng hình thành các vi khuẩn lạc (microcolony) ổn định, tăng sinh và kết dính với nhau Polysaccharid có nhiệm vụ kết dính các tế bào và là yếu tố cần thiết để dẫn đến sự hình thành màng biofilm Trong pha tích lũy này, vi sinh vật nhân lên và hình thành các cụm tế bào xếp thành lớp ở trên bề mặt Khi lớp thứ nhất của biofilm được tạo thành, các

vi khuẩn cùng loài và khác loài tiếp tục tập trung, tạo thành các lớp tiếp theo Các vi khuẩn lạc từ đó phát triển thành các khuẩn lạc lớn hơn (macrocolony) Màng biofilm phát triển từ một lớp mỏng thành một cấu trúc có hình nấm, hình tháp và được bao bọc bởi EPS [19] EPS tạo thành trong giai đoạn này có vai trò gắn kết các tế bào với bề mặt, đồng thời là lớp rào chắn bảo vệ vi sinh vật bên trong dưới các điều kiện khắc nghiệt Các vi sinh vật bên

trong chất nền EPS được sắp xếp thứ tự dựa theo mối liên hệ về chuyển hóa và hô hấp của chúng Ví dụ, các vi khuẩn kỵ khí thường nằm ở lớp dưới biofilm để tránh tiếp xúc với oxy Bên trong chất nền EPS, các tế bào truyền cho nhau các tín hiệu quorum sensing (QS) để kiểm soát mật độ, dẫn đến tiếp cận và tách rời của các tế bào từ màng biofilm [16] [54]

Bước 3: Phân tách Đây là giai đoạn rất quan trọng đối với vòng đời của màng

biofilm Có nhiều yếu tố dẫn đến quá trình trên như sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, sự cạnh tranh khốc liệt giữa các vi sinh vật hoặc mật độ tế bào quá lớn Việc phân tách có thể xảy

ra ở một vị trí hoặc tất cả các vị trí trong màng biofilm Việc giải phóng các tế bào dạng tự

do dẫn đến sự bắt đầu hình thành màng biofilm mới ở các vị trí khác [54]

1.3.2.2 Vai trò của màng biofilm

Màng biofilm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong tự nhiên, giúp chúng tạo ra các vi môi trường thuận lợi cho quá trình sinh trưởng, tránh khỏi các bất lợi ở điều kiện bên ngoài Với sự có mặt của các polysaccharid và protein, màng biofilm có thể chống lại cơ chế đề kháng đặc hiệu/không đặc hiệu của vật chủ và cho phép vi khuẩn chống lại các chất kháng khuẩn (chất khử trùng, kháng sinh), hoặc các yếu tố bất lợi như oxy đối với các loài kỵ khí [22] Hiện tại có 3 giả thuyết giải thích sự đề kháng của biofilm với kháng sinh Thứ nhất, thành phần màng biofilm có chất nền EPS bao quanh các vi sinh vật, đóng vai trò như một hàng rào ngăn cản sự khuếch tán của kháng sinh vào bên trong lớp màng [34] Thứ 2, bên trong màng biofilm, một số vi khuẩn rơi vào trạng thái tăng trưởng chậm

do thiếu chất dinh dưỡng hoặc tích lũy các chất chuyển hóa có hại, và do đó chúng tồn tại Thứ ba, bên trong màng biofilm có một tiểu quẩn thể vi sinh vật riêng biệt, có kiểu hình đề kháng cao với kháng sinh [43] Do đó, màng biofilm của các vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng xấu đến đời sống và sức khỏe con người Ví dụ, màng biofilm

tạo bởi Pseudomonas aeruginosa gây ra nhiễm khuẩn hô hấp mạn tính ở những bệnh nhân

vị xơ hóa nang (cystic fibrosis patients), Staphylococcus aureus còn tạo màng biofilm bám

vào các thiết bị y tế như máy điều hòa nhịp tim (paramaker) [26] Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác cho thấy sự hình thành màng biofilm ở các vi sinh vật gây bệnh làm giảm khả năng đáp ứng của bệnh nhân với thuốc và cho những kết quả không mong muốn sau khi phẫu thuật Các tế bào vi khuẩn được bao bọc bên trong màng biofilm có thể kháng lại sức

đề kháng của vật chủ như hệ thống miễn dịch và làm tăng khả năng kháng kháng sinh lên tới 1000 lần, gây nên nhiều khó khăn trong việc điều trị bệnh và gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [48]

Màng biofilm còn có thể kháng lại một số lực cơ học và giúp vi sinh vật bên trong chịu được sự thiếu hụt chất dinh dưỡng, sự thay đổi pH, các gốc oxi hóa và các chất khử trùng Bên cạnh đó, màng biofilm còn có chức năng giữ nước, hấp phụ các chất hữu cơ để cung cấp các chất dinh dưỡng và hấp phụ các ion vô cơ để đào thải chất độc từ môi trường [33] Một số vai trò khác của màng biofilm được tóm tắt qua bảng 1.3

Bảng 1.3: Một số vai trò của màng biofilm [28]

tham gia

Hoạt tính enzym

Cho phép thoái hóa các đại phân tử ngoại sinh để thu nhận các chất dinh dưỡng và thoái hóa EPS cấu trúc giúp các tế bào có thể ly giải ra khỏi màng biofilm

Protein

Trao đổi các thông

tin di truyền

Tạo điều kiện cho sự trao đổi thông tin

di truyền giữa các tế bào ADN

Cho và nhận điện tử Cho phép các phản ứng oxi hóa xảy ra

trong chất nền biofilm

Các protein, các hợp chất humic

Giải phóng các thành

phần của tế bào Giải phóng vật chất tế bào

Acid nucleic, enzyme, lipopoly-saccharid, phospholipid

Giảm năng lượng dư

Các polysaccharid và enzym

1.3.3 Khả năng hình thành biofilm ở các loài vi khuẩn

Trong cùng một điều kiện môi trường, khả năng hình thành biofilm giữa các vi khuẩn

có sự khác biệt Các cấu trúc đặc trưng và yếu tố sinh học của tế bào vi khuẩn đều liên quan đến sự hình thành biofilm Sự di động thông qua roi (Flagella mediated mobility) được cho

là có vai trò quan trọng trong việc vượt qua lực cản bề mặt của chất nền và cần thiết cho sự bám dính ban đầu cũng như sự hình thành các khuẩn lạc [67] Sự hình thành biofilm có liên

quan đến roi (flagellum) ở một số loài vi khuẩn như Escherichia coli và Aeromonas hydrophila Ngoài ra, polysaccharid ngoại bào có vai trò quan trọng nhất trong việc tạo nên

khung cấu trúc của biofilm Bên cạnh đó, các phân tử tín hiệu quorum sensing (QS) như acyl-homoserin lacton (AHLs), có bản chất là các acid amin không thiết yếu [43] và các yếu tố sinh học cũng có liên quan đến sự hình thành biofilm của một số vi khuẩn Tóm lại, tầm quan trọng tương đối của các yếu tố liên quan đến khả năng hình thành biofilm của vi khuẩn được sắp xếp như sau: polysaccharid ngoại bào > roi > AHLs > protein ngoại bào > khả năng di động theo nhóm [34]

N-1.3.4 Tác dụng ức chế hình thành biofilm của vi khuẩn có lợi và ứng dụng

Probiotic hay lợi khuẩn là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe của vật chủ khi được sử dụng với một liều lượng hợp lý Các vi khuẩn có lợi còn mang một số đặc tính chuyên biệt như kháng lại môi trường acid và muối mật (trong hệ đường ruột), bám dính tốt trên bề mặt niêm mạc (các hốc tự nhiên) và cạnh tranh được với các yếu tố gây bệnh Chính vì vậy các lợi khuẩn được sử dụng để cân bằng hệ sinh vật trong đường tiêu hóa hay trong các vị trí như khoang miệng, tai mũi họng, âm đạo [68]

Tuy nhiên, trong y tế, các vi sinh vật có khả năng tạo biofilm là một mối nguy hại lớn đến sức khỏe con người do chúng là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh truyền nhiễm như viêm nội tâm mạc, viêm tai giữa, nhiễm trùng tiết niệm và bệnh xơ nang [10] Phần lớn các bệnh có thể gây nguy hại đến tính mạng con người có liên quan đến các nhiễm trùng

do vi khuẩn bám dính trên bề mặt và hình thành biofilm trên các mô, cơ quan, thiết bị y tế

và các thiết bị trong công nghiệp thực phẩm [7] Các trường hợp nhiễm trùng gây ra bởi các vi khuẩn tạo biofilm thường khó điều trị bằng kháng sinh và biofilm làm tăng khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn từ 100 đến 1000 lần so với các tế bào vi khuẩn tự do Nằm

trong cấu trúc biofilm, các tác nhân gây bệnh này có thể không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh và thuốc sát trùng, dẫn đến bệnh khó chữa khỏi [48] Gần đây, các nhà khoa học

đã quan tâm đến hiện tượng ức chế hình thành biofilm của các lợi khuẩn trên các vi khuẩn

gây bệnh, ví dụ các vi khuẩn có lợi như Enterococcus faecium WB2000 và Bifidobacterium adolescentis SPM1005 có khả năng ức chế sinh trường cũng như sự hình thành biofilm của Streptococcus mutans, một loại cầu khuẩn kỵ khí thường gây sâu răng ở người [7] [41]

Thêm vào đó, trong nghiên cứu của Taheura và cộng sự (2016), một số chủng LAB có khả

năng ức chế hình thành biofilm của Bacillus cereus và Streptococcus salivarius, do đó

chúng được đề xuất sử dụng để phòng bệnh sâu răng và có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng phòng các bệnh răng miệng [68] Tương tự, nghiên cứu của

Sciak (2017) còn cho thấy rằng, các lợi khuẩn bao gồm Lactobacillus salivarius có khả năng ức chế hình thành biofilm của Streptococcus mutans và Candida albicans (một loại

nấm gây viêm đường sinh dục và làm suy giảm hệ miễn dịch) dẫn đến ức chế sự hình thành

sợi, quả thể của nấm và làm giảm khả năng gây bệnh do Candida albicans [60]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Thông tin về các mẫu kim chi được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các mẫu kim chi Hàn Quốc sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic

Kim chi truyền thống Hàn Quốc KCTT1 01/2016 Kim chi truyền thống Hàn Quốc KCTT2 07/2018 Cut Cabbage KimChi (Jongga) Hàn Quốc KC cut 07/2018 Kimchi Sauce (Hyomoro) Hàn Quốc KC sauce 07/2018

2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định

Bộ vi sinh vật kiểm định ESKAPE thuộc phòng Vi sinh Y học, Viện Vi sinh vật và Cộng nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội được sử dụng trong quá trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được Bộ VSV kiểm định

ESKAPE bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis

Các chủng vi khuẩn kiểm định được sử dụng trong quá trình thử khả năng ức chế sự

hình thành biofilm bao gồm: Staphylococcus aureus ATCC 12275 (Bộ VSV kiểm định ESKAPE), Pseudomonas aeruginosa VTCC 10657 do Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi sinh

vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

2.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Nghiên cứu và phát triển Công nghệ cao, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa phân tích đạt

tiêu chuẩn quốc tế

 Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc

 Máy đo pH Horiba, Nhật Bản

 Máy ly tâm Eppendoff, Đức

 Máy PCR Eppendorf, Đức

 Máy điện di ngang Nyx Technik, Mỹ

 Máy GelDoc BioRad, Mỹ

 Máy đo quang phổ UV – Vis (GBC Instrument, Úc)

 Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang Zeiss, Đức

 Máy định lượng ADN eppendorf biophotometer plus, Đức

 Máy giải trình tự tự động 3110 Avant Appied Biosystems, Đức

Ngoài ra, một số thiết bị, dụng cụ cần thiết khác được sử dụng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn như: bình serum, bình khí Nitơ, ống nghiệm nút xoáy và màng lọc vi khuẩn

2.1.3.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm sinh học phân tử gồm: glucose, NaCl, MgSO4, KH2PO4, CaCO3, CH3COONa, MnSO4, glycerol, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl, SDS và một số các hóa chất khác sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử Các loại hóa chất có độ tinh khiết cao được mua từ những hãng sản xuất có uy tín như Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Wako

Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có MRS (Bảng 2.2) và LB (Bảng 2.3)

Bảng 2.3: Thành phần của môi trường LB

2.2 Nội dung nghiên cứu

Xuất phát từ mục tiêu, đề tài triển khai 3 nội dung nghiên cứu sau:

 Phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi

 Định danh các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ kim chi

 Thử hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được đối với bộ chủng vi khuẩn kiểm định ESKAPE

 Đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn kiểm định trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

 Đánh giá khả năng kháng biofilm đối với các chủng vi khuẩn kiểm định

Các bước thí nghiệm được mô tả ở hình 2.1

Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập LAB từ kim chi

Lấy 1 ml các mẫu dịch kim chi đổ vào ống nghiệm đựng 9 ml dung dịch NaCl 0,9%

đã khử trùng sẵn, sau đó trộn đều bằng máy vortex và sử dụng để làm nguồn phân lập Phân lập LAB từ các mẫu dịch kim chi được tiến hành theo phương pháp dãy ống thạch bán lỏng [74], tóm tắt gồm các bước như sau:

- Cân 3g thạch (Difco) vào bình Duran, bổ sung 100 ml nước cất, đậy nắp và hòa tan thạch bằng nhiệt để thu được thạch có nồng độ 3% Chia dịch vào các ống nghiệm thủy tinh (3 ml/ống), đậy kín bằng giấy bạc và khử trùng ở 1210C trong 20 phút

- Chuẩn bị các ống nghiệm nút xoáy chứa môi trường MRS dịch thể, khử trùng ở

- Pha loãng dịch kim chi bằng nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) từ 10-1 đến 10-8 và cấy

1 ml dịch pha loãng lần lượt vào các ống môi trường MRS thạch đã chuẩn bị ở trên, trộn đều bằng đảo đầu, để đông thạch ở nhiệt độ phòng

- Ủ các ống phân lập trong tủ ấm 370C ở tư thế đảo ngược đầu, thời gian ủ 24-48 giờ

- Tách khuẩn lạc: Chọn ống thạch ở độ pha loãng có khuẩn lạc mọc riêng rẽ, không quá dày Tách các khuẩn lạc đơn (hình thái khác nhau) bằng mao quản thủy tinh tạo

ra từ đầu pipet Pasteur kéo dài rồi cấy vào ống MRS dịch thể, ủ trong tủ ấm 370C trong vòng 48 giờ

- Lặp lại các bước phân lập như trên để tinh sạch cho đến khi thu được chủng LAB thuần khiết

- Đối với các chủng LAB vi hiếu khí, kỹ thuật tinh sạch trên đĩa thạch được dùng để thay thế cho kỹ thuật tinh sạch trong ống nghiệm Bước tinh sạch được lặp lại 2 lần

2.3.2 Định danh các chủng LAB dựa trên so sánh trình tự 16S rADN

- Thêm 4 µl proteinase K 10 mg/ml, ủ tại 370C trong 30 phút

- Thêm 60 µl SDS 20%, ủ trong bể ổn nhiệt ở 650C trong 2 giờ (đảo đầu mỗi 25 phút

- ADN sau khi tách được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1-1,5% và được

đo OD ở bước sóng 260 nm để xác định nồng độ

Quy trình được lặp lại nhiều lần để thu được sản phẩm tách ADN tổng số tinh sạch

2.3.3.2 Khuếch đại trình tự 16S rADN, giải trình tự và dựng cây phân loại

Đoạn 16S rADN (khoảng 1500 bp) của các chủng vi khuẩn được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) [62] với thành phần và chu trình phản ứng trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4: Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuyếch đại 16S

Thời gian Số chu

PCR-Trình tự gen sau đó được phân tích, so sánh với trình tự 16S rADN của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều [56]

2.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch [25] và sử dụng bộ vi sinh vật kiểm định ESKAPE Các chủng LAB được nuôi trong môi trường MRS trong 48 giờ ở 370C, sau đó ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tế bào Nhỏ 100 µl dịch sau khi ly tâm vào lỗ thạch được đục trên đĩa có vi khuẩn kiểm định rồi ủ ở 300C Sau 24 giờ, quan sát và đánh giá kích thước các vòng kháng khuẩn quanh lỗ thạch Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng

ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô

khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch Quy trình được thực hiện 1 lần

2.3.4 Đánh giá khả năng LAB ức chế hình thành biofilm

2.3.4.1 Xác định môi trường tạo biofilm thích hợp cho các chủng vi khuẩn kiểm định Nguyên tắc

Đánh giá khả năng tạo biofilm của các chủng kiểm định trên các môi trường khác nhau bằng cách so sánh giá trị mật độ quang Môi trường tạo biofilm thích hợp cho chủng kiểm định là môi trường cho giá trí mật độ quang lớn nhất và lớn hơn 0,12 [19]

Cách tiến hành

Các chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi trong ống nghiệm chứa các môi trường dịch thể LB, MRS và MRS ½ (là môi trường có thành phần tương tự môi trường MRS nhưng làm lượng bằng một nửa) để ống nghiệm nghiêng 450 trong tủ lắc với tốc độ 160 vòng/phút ở 370C trong vòng 24 giờ Dịch nuôi cấy được đo độ đục ở bước sóng 600 nm

và được chỉnh đến OD = 1,0 bằng chính môi trường dịch thể Sau đó pha loãng dịch nuôi cấy trên 100 lần [90] bằng chính môi trường dịch thể, trộn đều, rồi hút 175 µl dịch trong mỗi ống nghiệm vào đĩa 96 giếng Đĩa 96 giếng được ủ trong tủ ấm 370C trong 48 giờ

Hút hết dịch trong đĩa 96 giếng và để khô tự nhiên hoặc sấy trong tủ sấy tĩnh ở 600C trong 30 phút để cố định tế bào trong biofilm Sau đó, bổ sung thuốc nhuộm: 175 µl/ 1 giếng và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 45-60 phút