Nghiên cứu môi trường nôi cấy và đánh giá một số hoạt tính sinh học từ chủng nấm cordyceps militaris

ả ảnh hưởng của công thức bổ sung dưỡng ch ình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris ánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết củtrên hai môi trường nuôi cấy rắn và

Tôi cũng xin chân th

động viên tôi hoàn thành bài khóa lu

Xin chân thành c

LỜI CẢM ƠN

àn thành khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành t

ương, TS Trần Thị Hồng Hà, Ths Nguyễn

ộ đang công tác tại phòng Sinh học thực nghi

ất Thiên Nhiên, Viện Khoa học và công ngh

ẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tại phTôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công ngh

Hà Nội đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong su

ng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp

ên tôi hoàn thành bài khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2016

y cô trong khoa Công nghệ Sinh học,

tôi trong suốt quá

ã luôn giúp đỡ,

m 2016

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CHỮ VIẾ MỞ ĐẦU

PHẦN 1: TỔNG QUAN T 1.1 Sơ lược lịch sử 1.1.1 Trên thế giớ 1.1.2 Nghiên cứu v 1.2 Giá trị dược liệ 1.2.1 Giá trị d militaris ……….

1.2.2 Đối với hệ 1.2.3 Đối với hệ 1.2.4 Đối với hệ 1.2.5 Đối với hệ 2.1 Đối tượng, địa điể 2.1.1 Đối tượng nghi 2.1.2 Địa điểm nghi 2.1.3 Hóa chất và thi 2.2 Nội dung nghiên c MỤC LỤC

ĐỒ

VIẾT TẮT

NG QUAN TÀI LIỆU

ịch sử nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris ế giới

ứu về nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam

ợc liệu

ị dược liệu của một số chất có trong nấ ………

ới hệ thống miễn dịch

ới hệ hô hấp

ới hệ tuần hoàn tim và não

ới hệ thống nội tiết

địa điểm, hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghi ng nghiên cứu

m nghiên cứu

à thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

ên cứu

ii

iv

vi

vii

viii

1

3

Cordyceps militaris 3

3

5

8

t có trong nấm Cordyceps ……….9

11

12

12

12

ng trong nghiên cứu 13

13

13

13

14

ứu thành phần môi trường nuôi cấy ch

Cordyceps militaris trên môi trường lỏng

ởng của nguồn cacbon tới khả năng hình thành và phát

ứu ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng h

ả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trư

ứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tớ

ủa chủng nấm 2.4.3.3 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của công thức phối trộ

ình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris

ng pháp thu thập và xử lí số liệu

ng pháp tách chiết chủng nấm Cordyceps militaris

à lỏng với dung môi là ethanol và etyl acetat

14 15

ng cấp 1 chủng nấm 15

ấy chủng nấm 15

ình thành và phát 16ình thành và phát triển của 16ởng và phát triển 16 sinh trưởng và phát 17

ể nấm Cordyceps 17ăng hình thành và trên môi trường rắn 17

u sáng tới sự phát triển 18

ối trộn phụ gia đến

Cordyceps militaris 19

20

Cordyceps militaris trên hai

à ethanol và etyl acetat 21

3.3 Nghiên cứu kỹ thu

trên môi trường rắn

ứu ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng h

ả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường của cường độ sáng đến khả năng hình thành và phát

Cordyceps militaris

ả ảnh hưởng của công thức bổ sung dưỡng ch

ình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris

ánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết củtrên hai môi trường nuôi cấy rắn và lỏng

DANH MỤC BẢNG

Cordyceps militaris 22

27

ấp 1 chủng nấm 27

ên môi trường 28

28

ển của sợi nấm 30

ủa sợi nấm 32 34

Cordyceps militaris

34ăng hình thành và trên môi trường rắn 35

ình thành và phát 37ỡng chất đến khả

Cordyceps militaris 39

ết của chủng nấm 41 45

Bảng 2.1: Ảnh hưởng củ

của quả thể nấ

Bảng2.2: Ảnh hưởng củ

của chủng nấm

Bảng 2.3: Ảnh hưởng c

thành và phát tri

Bảng 3.1: Ảnh hưởng c

trưởng của khu

Bảng 3.2: Kết quả ảnh h

phát triển của ch

Bảng 3.3: Kết quả nghi

thành và phát tri

Bảng 3.4:Kết quả ảnh h

triển của quả th

Bảng 3.5: Kết quả ảnh h

phát triển của qu

Bảng 3.6: Kết quả ảnh h

quả thể của chủ

Bảng 3.7: Kết quả ảnh h

hình thành và phát tri

Bảng 3.8: Hoạt tính kháng vi sinh v

Bảng 3.9: Hoạt tính chố

Bảng 3.10: Hoạt tính gây

ởng của loại cơ chất đến khả năng hình thành và phát tri

ể nấm Cordyceps militaris

ng của cường độ chiếu sáng tới sự phát triển v ng nấm Cordyceps militaris

ởng của công thức phối trộn phụ gia đến kh thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris ởng của môi trường nhân giống cấp 2 lên quá trình sinh ủa khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris

nh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng h ủa chủng nấm Cordyceps militaris

nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ tới kh thành và phát triển của chủng nấm Cordyceps militaris nh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành và phát a quả thể nấm Cordyceps militaris

nh hưởng của loại cơ chất đến khả năng h ủa quả thể nấm Cordyceps militaris

nh hưởng của cường độ chiếu sáng tới sự phát tri ủa chủng nấm Cordyceps militaris

nh hưởng của công thức phối trộn phụ gia đế hình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps mil t tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiế t tính chống oxy hóa của dịch chiết các chủng nấm t tính gây độc tế bào của cặn chiết các chủng nấm ình thành và phát triển 18

phát triển và ra quả thể 19

đến khả năng hình Cordyceps militaris 19

ên quá trình sinh 27

ăng hình thành và 29

ới khả năng hình Cordyceps militaris 30

ình thành và phát 32

ăng hình thành và 35

ự phát triển và ra 37

ụ gia đến khả năng Cordyceps militaris 39

n chiết 42

ấm 42

ấm 43

Hình 3.3: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris tr

sau 11 ngày nuôi c

Hình 3.4: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris tr

ngày nuôi cấy

Hình 3.5: Quả thể nấm Cordyceps militaris

sau 50 ngày nuôi c

Hình 3.6: Quả thể nấm Cordyceps militaris

ấm Cordyceps militaris ở công thức PT3 sau 40 ngày (A)

và 50 ngày (B) nuôi cấy

y của chủng nấm 22

ờng MT1, MT2 và 28

ng CT1 và CT3 sau 6 30

ng CT1, CT3, CT5 32

Đ2 và NĐ4 sau 7 34

c TN1 (A) và TN5 (B) 37

ờng độ sáng 2000 39

sau 40 ngày (A) 41

ởng của loại cơ chất đến khả năng hình thành và phát

a quả thể nấm Cordyceps militaris

ởng của cường độ chiếu sáng tới sự phát triủng nấm Cordyceps militaris

ởng của công thức phối trộn phụ gia đến kh

thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris

ình thành và phát 29 ình thành và phát triển 31

ình thành và phát triển 33

ình thành và phát 36 phát triển và ra quả 38

đến khả năng hình

Cordyceps militaris 40

EtOAc Ethylacetat ( etyl axetat)

EtOH Ethanol (Etanol)

MIC Minimum inhibitory concentration (N

Ethylacetat ( etyl axetat)

(Etanol) Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chếOptical Density (Mật độ quang)

Scavenging capacity (% khả năng bẫy các gốc tự do)forhodamine B ( Sunforodamin B)

Trichloacetic acid (Axit tricloaxetic)

ật kiểm định

ế tối thiểu)

do)

Nấm Đông trùng h

không chỉ được các nh

tâm đến, vì nấm là loại d

với mọi lứa tuổi, từ trẻ

người già Theo các tài li

bồi bổ hết sức quý giá, có tác d

dục, thận hư, liệt dương, di tinh,

đối với trẻ em còi xương ch

thác kiệt quệ, trữ lượng không

đã có nhiều nước tiến h

này một cách hiệu quả

công nghệ tiên tiến củ

Cordyceps trên môi trư

Copdycepin và Adenosin

Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nh

quy mô công nghiệp từ nh

Ở Việt Nam việc nghi

còn gặp nhiều khó khăn, c

Nam có nhiều loại khác nhau

MỞ ĐẦU

ùng hạ thảo (ĐTHT) là một loại nấm kí sinh tr

c các nhà khoa học nghiên cứu, mà còn được cả

ại dược liệu quý, rất tốt cho sức khỏe con ng

ừ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu ni

à Theo các tài liệu ghi chép về đông dược cổ, ĐTHT là m

c quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh nhưương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, và có tác dương chậm lớn Một số nghiên cứu hiện đạTHT có tác dụng làm tăng cường công nănâng cao hệ miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, ch

ạ Dùng thường xuyên ĐTHT giúp tăng tu quá trình lão hóa, rất tốt cho người già và ngư

i gian dài [10, 7]

ợc lý rất tốt của nấm Đông trùng mà hiện nay nhu c

ất lớn Hiện nay trong tự nhiên nấm Đôngợng không đủ đáp ứng nhu cầu của người sử

ến hành nghiên cứu để tìm ra kỹ thuật nuôi trồ

u quả Ví dụ, Công ty Biofact life (Malaysia)

n của Nhật và các nước khác nuôi cấy thành công ntrên môi trường nhân tạo để tạo ra hai hoạt ch

nosine được tạo ra từ hệ sợi nấm Các nư

ỹ, Nhật Bản, Malaysia đã sản xuất được nấ

ệp từ những năm 1995, thế kỷ XX

ệc nghiên cứu về nấm ĐTHT mới chỉ bắt đầ

ăn, cả về cơ sở vật chất và kiến thức Nấm Đ

i khác nhau được tìm thấy ở các vùng khác nhau Trong s

m kí sinh trên côn trùng,

à và người suy nhược

ện nay nhu cầu sử ông trùng bị khai

ời sử dụng Vì vậy

t nuôi trồng loài nấm , Công ty Biofact life (Malaysia) đã kết hợp

ành công nấm

ạt chất chính là ước như Trung

ợc nấm ĐTHT trên

ỉ ắt đầu, cho nên

ấm ĐTHT ở Việt nhau Trong số

giá thành nuôi trồng, chi phí s

hiện đề tài: “Nghiên c

tính sinh học từ chủng n

Cordyceps được nuôi trồng và nghiên cứu ở Việt Nam v

ấm Cordyceps militaris có giá trị dược liệu cao v

ên ở Việt Nam việc nuôi trồng còn hạn ch

và khó phổ biến đến người tiêu dùng

ào nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợ

ụ thể là chủng nấm Cordyceps militaris với mụ

ng, chi phí sản xuất, nuôi trồng đơn giản, chúng tôi th

Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và đánh giá m

ủng nấm Cordyceps militaris”

Việt Nam và trên

ệu cao và dễ nuôi

ạn chế do vậy giá

ợp nấm ĐTHT

ới mục đích giảm chúng tôi thực

ánh giá một số hoạt

PH 1.1 Sơ lược lịch sử nghi

Theo các tài liệu c

được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên

Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc v

nấm Cordyceps có tới 400 lo

thấy khoảng 60 loài ĐTHT

cứu được 2 loài nấm

dược liệu tốt đối với con ng

1.1.1 Trên thế giới

Từ thời cổ xưa, kho

truyền các câu chuyện th

người ta gọi là ĐTHT Tuy nhiên mãi

mới thực sự được biết đế

Nấm ĐTHT được các nh

hiện từ vùng núi cao nguyên Tây T

tượng ấu trùng của các lo

sinensis (Berk) Sacc k

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ử nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris

Theo Holliday (2004), ĐTHT được phân loại theo hệ thố

ấm (Fungi)

Ascomycota Ascomycotes Hypocreales Clavicipataceae Cordyceps

ệu của báo điện tử [8, 9] nấm ĐTHT chủ yùng núi cao trên 4000m như cao nguyên Tây T

i, Cam Túc và Vân Nam… Theo các nhà khoa h

ới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung QuĐTHT Tuy nhiên cho đến nay, người ta mớ

ấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

ới con người

ưa, khoảng mấy ngàn năm về trước ở Trung Qu

ện thần bí về một loại sinh vật khi là cây,khi là Tuy nhiên mãi đến năm 620 sau Công nguyên,

ết đến

ợc các nhà khoa học Trung Quốc xác định mùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu này thự

a các loài bướm thuộc chi Thitarodess bị nấ

ký sinh Năm 1878, các nhà khoa học đ

ệ thống phân loại

ủ yếu tìm thấy cao nguyên Tây Tạng, Tứ

à Vân Nam… Theo các nhà khoa học thì chi

Trung Quốc đã tìm

i ta mới chỉ nghiên

Cordyceps militaris có giá trị

Trung Quốc đã lan

à cây,khi là con mà

20 sau Công nguyên, ĐTHT

định mới đầu xuất

ực chất là hiện

ị nấm Cordyceps

ọc đã phát hiện ra

nấm này ký sinh trên sâu non (

Công ty Aloha Medicinals c

nhân tạo trong môi trư

Cordyceps sinensis và

ày ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thu

ng dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodess baimaensis Thitarodess armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi

Cordyceps sinensis ký sinh Vào cuối mùa thu các ch

đêm (Noctuidae) tương tác với các bào tử n

ợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng là ch

ển Đến đầu mùa hè năm sau,nấm phát sinh m

ó chúng hình thành chồi, phát triển chui ra khỏi mặ

ầu sâu Do đó nhiều người gọi là nấm ĐTHT

ng trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triể

ỏ [8, 9]

XVIII, những người truyền giáo Châu Âu đã đư

u Vì Pháp là quốc gia có nền Y học phát triểĐến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu, điều tra v

ự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất ra thự cho con người [7]

m 1995 nhiều nước như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nh

n xuất được ĐTHT nhân tạo trên quy mô công nghi

to lớn nhờ dựa vào những đặc tính cơ bản củ

à quốc gia đi tiên phong trong lĩnh vực nuôi tr

ng môi trường nhân tạo, từ sâu bọ, côn trùng đế

à quốc gia có sản lượng ĐTHT đứng đầu thế

ề chất lượng cũng như giá thành và chủng loạloha Medicinals của Mỹ cũng đã nuôi trồng thành công trong môi trường có thành phần tự nhiên trên c

và Cordyceps militaris Bằng việc điều khiể

ài côn trùng thuộc chi

tarodess baimaensis hoặc

ộc chi Thitarodess

ùa thu các chất trên da

ử nấm và tạo ra ùng, coi chúng là chất dinh

m phát sinh mạnh và gây

ỏi mặt đất, nhưng ĐTHT bởi vì mùa

m phát triển ra ngoài cơ

đưa ĐTHT đến

c phát triển và hiện đại

ều tra và thu thập

ành công ĐTHT

ên trên cả 2 loại nấm

u khiển môi trường

nuôi cấy ở nhiệt độ thấ

phần tự nhiên và rất gầ

sống Hơn thế, họ cũng

gạo, lúa mạch, lúa mạch

Công ty Biofact Life (Malaysia) c

công nấm Cordyceps trên môi tr

thực phẩm chức năng

1.1.2 Nghiên cứu về n

Hiện nay nước ta ch

Cordyceps Các công trình nghiên

và Nguyễn Thị Thu (2011), nghi

côn trùng Isaria tenuipes

tồn thiên nhiên Pù Huống, t

Năm 2009, Viện Khoa h

thu mẫu nấm ĐTHT tạ

Tác giả Phạm Quang Thu

định là loài Cordyceps nutans

nhận có phân bố tại Việ

Cũng trong năm 2009, PGS Ph

Lâm nghiệp Việt Nam đ

độ thấp, lượng oxy thấp, họ đã tạo ra môi trư

ất gần với môi trường tự nhiên mà 2 chủng nũng đã nuôi trồng thành công ĐTHT trên nguạch đen [1]

Công ty Biofact Life (Malaysia) cũng đã nghiên cứu và nuô

trên môi trường nhân tạo phục vụ công nghi

nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam

ớc ta chưa có nhiều công trình nghiên c Các công trình nghiên cứu về Đông trùng Hạ thảo đ

mang tính chất điều tra, phát hiện sự phân bố và thu th

ệt Nam

m 2009, GS Phạm Thị Thùy – Viện Bảo vệ Thực vật cũ

Cordyceps nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh B militaris ở Vũ Quảng (Hà Tĩnh) [6]

c Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thúy, Trầ Thu (2011), nghiên cứu đặc điểm sinh học của n

Isaria tenuipes (Peck) Samson ở vườn quốc gia Pù Mát và khu b

ống, tỉnh Nghệ An

ện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hTHT tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động

m Quang Thu đã phát hiện được loài nấm ĐTHT

Cordyceps nutans Đây là loài nấm đầu tiên được mô t

i Việt Nam [3]

ăm 2009, PGS Phạm Quang Thu thuộc Việ

t Nam đưa ra công bố phát hiện thêm 2 chủng

môi trường có thành ủng nấm trên sinh THT trên nguồn cơ chất

à nuôi trồng thành công nghiệp sản xuất

ình nghiên cứu về nấm

ảo đã được công

à thu thập chúng

ật cũng tìm được ương (Ninh Bình)

Thúy, Trần Văn Cảnh

c của nấm ký sinh

ù Mát và khu bảo

ến hành điều tra ộng – Bắc Giang

và được giám

ợc mô tả và ghi

ộc Viện Khoa học ủng Cordyceps là

Cordyceps gunni tại V

militaris tại Vườn quốc gia Ho

Năm 2009, Phạm Th

gia Cúc Phương, tỉnh Ninh B

Cordyceps militaris, đây là loài

[2, 3] Loài nấm này phân b

so với mực nước biển.Ký ch

nhiệt đới thường xanh, có

Trong chương trình nghiên c

Quốc cấp nhà nước về nghi

ại Vườn quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc) v

ốc gia Hoàng Liên (Lào Cai) [3]

ạm Thị Thùy đã thu thập nấm Cordyceps tỉnh Ninh Bình Tác giả đã xác định được lo, đây là loài đầu tiên được phát hiện và mô t

ày phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1900m

c biển.Ký chủ của loài này là nhộng thuộc b

ài 2 – 6,5 cm, hình chùy, phần thân và cuố

ều rộng đến 0,6 cm Màu sắc của phần cuống n

n khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, ph

ậm và có nhiều mụn nhỏ.Quả thể dạng chai đ

m sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sả510µm x 3,5 - 5µm, phần mũ gắn trên túi qu

ực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm vờng thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở nhữ

ng xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m

ình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam v

c về nghiên cứu nấm ĐTHTCordyceps militaris

ện bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triể

ực phẩm chức năng cho người Kết quả đã nghiên c

ấm ĐTHT đó là:

Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo

Cordyceps militaris ở Vũ Quảng, Hà Tĩnh

ạt, phần sinh sản

ng chai được cắm rất

n sinh sản Túi bào tử

ên túi quả thể có kích

Tác giả cũng đã xác

Cordyceps militaris ở Vi

vitamin và một số nguy

Một số nghiên cứu v

cũng được công bố Nă

nghiên cứu thực nghiệm Lâm nghi

Hiện nay trước xu h

thị trường trong nước mộ

đang tiến hành đảy mạnh nghi

dạng quả thể Đã có nhi

thể khác nhau điển hình nh

tằm của TS Nguyễn M

hiện nghiên cứu nuôi trồ

gạo và các chất bổ sung, xong hi

nuôi trồng quả thể thành công t

trong nuôi trồng tạo quả

về chi tiết công nghệ nuôi tr

ã xác định được một số giá trị dược liệu củ

ở Việt Nam gồm chất Cordycepin, HEAA, m nguyên tố vi lượng [5]

ứu về nuôi trồng và sản xuất Đông trùng

ố Năm 2008, TS Nguyễn Mậu Tuấn thuộ

c nghiệm Lâm nghiệp Lâm Đồng đã nghiên cứ

Paecilomyces tenuipes trên gia thể nhộng tằm (B

ên quy mô thử nghiệm

m 2009, GS Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hi

ĐTHT lần đầu tiên được tìm thấy ở Việt Nam

Isaria cerambycidae Loài ĐTHT này được tìm th

ũng chính là những gợi ý giúp Giáo sư và củng ĐTHT này trên môi trường nuôi cấy tự nhi

ủa chúng Ngoài ra, ông cũng là người phát hiTHT ký sinh trên châu chấu

c xu hướng và nhu cầu tiêu thụ ĐTHT ngày càng cao c

ớc một số công ty và một số nhà khoa học trong nạnh nghiên cứu và sản xuất ĐTHT cả dạng sinh khnhiều nghiên cứu thực hiên nuôi trồng ĐTHT trình như trên xén tóc của GS Đái Duy Ban, tr

ễn Mậu Tuấn Ở trong nước GS Phạm Quang Thu th

u nuôi trồng ĐTHT dạng sinh khối trong đó sử d sung, xong hiện tại vẫn chưa thấy có công bành công từ nguồn cơ chất này Việc sử dụng c

o quả thể ở nước ngoài mặc dù đã được đề cậ

ệ nuôi trồng vẫn còn đang được giữ bí m

ủa nấm ĐTHT , HEAA, một số

ái Duy Ban, trên nhộng

ởtrong nước nếu nuôi trồ

ra triển vọng cho việc tri

Năm 2010 công ty D

thành công cơ chất tổng h

nhộng tằm và bổ sung th

Thảo Thiên Phúc đã sử

khối ĐTHT chủng Cordyceps sin

trên thị trường Việt Nam

liệu trên chứa nhiều các ch

phần của cơ chất tổng h

Hơn nữa các nguyên li

quanh năm do đó hoàn toàn có th

Như vậy nghiên cứ

toàn cần thiết, đáp ứng nhu c

Nam

1.2 Giá trị dược liệu

Năm 1993, ĐTHT

quốc tế Một nữ vận độ

u nuôi trồng quả thể ĐTHT trên cơ chất gạo thành công s

ệc triển khai nuôi cấy quy mô công nghiệp

m 2010 công ty Dược Thảo Thiên Phúc đã nghiên cứu v

ổng hợp trên cơ sở nguyên liệu là gạo lứt, n sung thêm lượng nhỏ chất vi lượng Công ty cổ

ử dụng cơ chất tổng hợp này để phục vụ s

Cordyceps sinensis – sản phẩm hiện đang bán khá ch

ệt Nam Điểm đặc biệt là trong thành phần củ

u các chất dinh dưỡng và các nguyên tố vi lưổng hợp tỏ ra khá phù hợp cho sự phát triể

ên liệu trên hiện trong nước sẵn có, dồi dào có th

ó hoàn toàn có thể chủ động thích hợp cho việc tri

ự nỗ lực trong việc nghiên cứu điều chỉnh m

m, ánh sáng một cách thích hợp nhóm nghiên c

ên Phúc đã tạo ra được quả thể ĐTHT nhân tạ

p trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm

ột số kết quả về việc nghiên cứu nấm ĐTHT

ệc nghiên cứu nấm này cần thiết được tiếp t

ấm Cordyceps để làm nguyên liệu thực phẩ

ứu nấm ĐTHT Cordyceps militaris ở Việt Nam lứng nhu cầu đòi hỏi là bảo vệ sức khỏe con ng

c liệu

THT đã làm cả thế giới kinh ngạc qua sự ki

ận động viên người Trung Quốc đã liên tục phá k

ần của các nguyên ượng nên thành phát triển của ĐTHT

Việt Nam là hoàn

e con người ở Việt

c qua sự kiện thể thao

ục phá kỷ lục thế

giớ nội dung chạy cự ly 1000m, 3000m

vận động viên này một ph

Tập đoàn Dược phẩ

lầy cao nguyên có độ cao tr

xuất được các hoạt chất

nang Tasly Hoàng trùng th

này đã cho Trung Quốc có th

1.2.1 Giá trị dược liệu c

Các phân tích hóa h

chứa 17 loại acid amin khác nhau Ngo

nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na…

virus, ngăn ngừa ung th

- Adenosine: có vai trò quan tr

lượng của cơ thể, giúpc

hồi năng lực cơ b

cường khả năng vậ

- Nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy

nhóm các hợp chấ

ự ly 1000m, 3000m và 10000m Thành công c

ột phần nhờ vào dùng ĐTHT trong bữa ăn h

ợc phẩm Tasly đã nhân giống ĐTHT đầu tiên

ộ cao trên 4000m Nhờ đó, Tasly đã phân l

t chất sinh học có giá trị dược liệu của ĐTHT, tnang Tasly Hoàng trùng thảo với hàm lượng Polysaccharide cao H

ốc có thương hiệu ĐTHT đã xuất khẩu đi toàn c

c liệu của một số chất có trong nấm Cordyceps

Các phân tích hóa học cho thấy, trong sinh khối (biomass) c

i acid amin khác nhau Ngoài ra còn có D-mannitol, lipid và nhi

ng (Al, Si, K, Na…) Quan trọng hơn là trong sinh kh

u chất mang hoạt tính sinh học cao đang được các nh

n khám phá ra nhờ các tiến bộ của ngành hóa học các h

cordyceptic acid, cordycepin, adenosine và nhóm ho

Ethyl-Adenosine-Analogs) [1]

: là một dạng D-manitol, chất này có tác d

n, giảm đường huyết và kháng lại vi khuẩn nũng như người mắc bệnh tiểu đường

: là một dạng analoge của Adenosine (3’-deoxyandenosine)

ày có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống sự xâm nhi

ừa ung thư và rất tốt cho những người mắc bệ: có vai trò quan trọng trong quá trình chuy

ể, giúpcải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim m

ơ bắp, ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thăng vận chuyển oxi trong máu…

ất HEAA (Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs)

ợp chất có hoạt tính sinh học rất mạnh, đang đ

m Thành công của người nữ

ăn hàng ngày

ên ở vùng đầm

ã phân lập và chiết THT, tạo nên viên cao Hướng đi toàn cầu

Cordyceps militaris

i (biomass) của ĐTHT mannitol, lipid và nhiều

n là trong sinh khối

ên và tim mạch, phục

ào ung thư, tăng

Analogs): đây là đang được các nhà

khoa học đặc biệt quan t

c biệt quan tâm do khả năng hỗ trợ hệ miễn dị

m của một số retrovirus như virus HIV…

òn chứa nhiều loại vitamin Ví dụ trong 100g

; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C, , vitamin K, cũng như một loạt các loại đ

di và oligosaccharides) Hơn nữa,rất nhiều loại polysaccharides v

ọc (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi,Se, Al, Si, Ni, Sr, ũng được tìm thấy trong loài nấm này

ông trùng hạ thảo thiên nhiên là 94,6mg/g, có tác d

ch, chống ung thư, điều trị các bệnh về tim ph

ổi già cũng như cải thiện khả năng giải độ phức tạp đáng ngạc nhiên, độc nhất vô nhị m

ứ một sinh vật nào trên trái đất [1]

ạt các hợp chất nêu trên, có rất nhiều hợp chấ

ệt có tác dụng rất tốt đối với sức khỏe con ng

ứu y học và dược học đã chứng minh được n

ng tác dụng sau:

ại tác dụng xấu của các tân dược đối với thậ

c tính của Cephalosporin A

ệ thận trong trường hợp tổn thương do thiếu máu

ại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh v

ào tiểu quản ở thận

ạ huyết áp ở người cao huyết áp

ại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim

tác dụng tăng cường hoạ

động của đại thực bào,

Ngoài ra, tăng cường mộ

nồng độ kháng thể IgM, IgG trong huy

bào

ờng năng lực thực bào của các tế bào miễn dịờng tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng th

ở các nhánh khí quản

ậm quá trình lão hóa của cơ thể

ế bệnh tật của tuổi già

khả năng chống ung thư của cơ thể

ại tình trạng thiếu oxy của cơ thể

ờng tác dụng lưu thông máu trong cơ thể

ế tác hại của tia gamma đối với cơ thể

ờng tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh

ờng việc điều tiết nồng độ đường trong máu

cholesterol trong máu và chống xơ vữa độ

ến tác dụng của các nội tiết tố (hoocmon)

ờng chức năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh d

ế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao

Kháng viêm và tiêu viêm

ụng cường dương và chống liệt dương ụng trên thì nấm ĐTHT còn trực tiếp ảnh họng trong cơ thể

ống miễn dịch

ứu thực nghiệm Trung Quốc đã chứng minh

ng hoạt động miễn dịch bằng cách nâng cao , điều tiết các phản ứng đáp lại của tế b

ng một cách chọn lọc hoạt tính của các tế bào

ể IgM, IgG trong huyết thanh, chống lại sự l

1.2.3 Đối với hệ hô hấ

ày làm sáng tỏ quan điểm của cổ nhân xa xưa cho r

ng “bảo phế, ích thận” và “dĩ lao khái” [10]

ần hoàn tim và não

ụng làm giãn mạch, tăng lưu lượng tuần ho

ng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch Ngoỉnh hàm lượng Lipid máu, giảm Cholesterol, ành mạch…

ống nội tiết

ả Chen L.T, Cao H.F Huang W.F (2009) cho biđối với tuyến trên vỏ thượng thận làm tăng t

ày tiết ra Nấm có tác dụng như hormone

ản xuất tinh trùng, cải thiện chất lượng tinh d

ục [10]

i các thử nghiệm lâm sang đã được tiến hành, các nhà khoa

ng khám phá ra khả năng kỳ diệu của ĐTHT trong việc ph

, chống sự tăng sinh của các tế bào khối u, ăng cường giải độc gan, rất tốt trong quá trình c

ư đặc biệt tốt với những người bị bệnh tiể

ành, các nhà khoa THT trong việc phòng chống

ối u, điều tiết hệ ình cấy ghép cơ

nh tiểu đường, tim

PHẦN 2: NỘI DUNG

2.1 Đối tượng, địa điể

2.1.1 Đối tượng nghiên c

Chủng nấm Cordyceps militaris

nghiệm Viện hóa học các H

2.1.2 Địa điểm nghiên c

Nghiên cứu được th

men, peptone), nước cố

HPO4, MgSO4.7H2O, vitamin B

b Các dụng cụ thiết bị đ

Ống nghiệm, bình tam giác, c

phễu thủy tinh, pipet, que c

Hệ thống đèn chi

trường, tủ cấy, tủ lạnh, cân

Hệ thống bình nuôi c

Các thiết bị nêu trên

cấp bởi các công ty chuy

uy tín trong nước và qu

ỘI DUNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C

ểm, hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên c

ng nghiên cứu

Cordyceps militaris được lưu giữ từ phòng sinh h

ọc các Hợp chất Thiên nhiên

m nghiên cứu

ợc thực hiện tại Phòng Sinh học Thực nghiệm

ên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công ngh

ết bị sử dụng trong nghiên cứu

ợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

n Carbon (gạo, đường glucose), nguồn Nitơ (nhộng t

ớc cốt dừa, nước chiết khoai tây, nước chiết ngô, , vitamin B1,…

t bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

ình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, b

y tinh, pipet, que cấy, đèn cồn…

èn chiếu sáng, máy điều hòa, nồi hấp và khạnh, cân điện tử…

ình nuôi cấy, giàn khuôn, khay đựng chuyên dụ

êu trên đều đảm bảo tiêu chuẩn, hoạt động tốt v

i các công ty chuyên cung cấp đồ dùng và thiết bị phòng thí nghi

2.2 Nội dung nghiên c

Nghiên cứu các yế

sợi và quả thể nấm, tìm môi tr

rắn và lỏng

Xác định hoạt tính sinh h

i dung nghiên cứu

đặc điểm của hệ sợi chủng nấm Cordyceps militaris

nh môi trường phù hợp dùng để nhân giống cấp 2 ch

ành phần môi trường nuôi cấy tối ưu trên môi tr

ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng hình thành và phát

Cordyceps militaris trên môi trường rắn

ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, thời gian v

ển quả thể của Cordyceps militaristrên hai môi tr

ên men trên môi trường tối ưu đã nghiên cứu là rắn v

đánh giá hoạt tính sinh học (Hoạt tính kháng vi sinh v

ào, hoạt tính chống oxy hóa), của chủng nấ

àm lượng adenosine và cordycepin của chủng n

ứu rắn và lên men lỏng

c tiêu nghiên cứu

u suất hình thành quả thể trên môi trường rắn v

u các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát tri

ìm môi trường nuôi cấy tối ưu trên hai lo

t tính sinh học của chủng trên môi trường rắn v

Cordyceps militaristrên đĩa

ấp 2 chủng nấm

u trên môi trường

ình thành và phát

i gian và độ ẩm, tới trên hai môi trường

ắn và lỏng

2.4 Phương pháp nghiên c

2.4.1 Xác định môi trư

Cordyceps militaris

Để xác định được môi tr

chủng giống ban đầu, chúng tô

là Czapek-Dox (môi trư

Môi trường Czapek

MgSO4.7H2O: 0.5g; K2

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar):

Khoai tây: 200g; Nước v

Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose Agar): Glucose: 40g; pepton: 10g; Agar: 15g; Nước vừ

Trong 3 môi trường tr

NaOH 1M, các môi trư

Cấy chủngvào 3 môi tr

hình thái, màu sắc và sự

mặt trước và măt sau đ

môi trường và kết luận v

chủng nấm Cordyceps militaris

2.4.2 Nghiên cứu thành ph

militaristrên môi trườ

Song song với việ

tiến hành nghiên cứu nuôi tr

chất rắn thời gian nuôi tr

khevà hiệu suất sinh hoạ

lỏng là lựa chọn hợp lý cho nuôi c

ng pháp nghiên cứu

nh môi trường phù hợp dùng để nhân giống cấp 1

ợc môi trường phù hợp dùng để nhân gi, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 3 loDox (môi trường 1), PDA (môi trường 2) và SDA (môi tr

ng Czapek – Dox: Agar: 15g; Saccaroza: 30g; NaNO

2HPO4: 1g; KCl: 0.5g; Nước vừa đủ: 1000ml.

ng PDA (Potato Dextrose Agar): Agar: 15g; Glucose: 20g;

môi trường đã được chuẩn bị trên đĩa petri

ự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm bằng mắ

t sau đĩa petri So sánh sự sinh trưởng của khu

ận về môi trường phù hợp nhất trong nhân gi

Cordyceps militaris

u thành phần môi trường nuôi cấy chủng nấ ờng lỏng

ới việc nghiên cứu nuôi trồng trên cơ chất rắ

ứu nuôi trồng trên môi trường lỏng Việc nuôi tr

ôi trồng rất dài và đòi hỏi độ ẩm phòng nuôi

t sinh hoạt tính sinh học không cao, nuôi cấy trên môi tr

ợp lý cho nuôi cấy với quy mô công nghiệp v

p 1 chủng nấm

nhân giống cấp 1 từ loại môi trường

à SDA (môi trường 3) Agar: 15g; Saccaroza: 30g; NaNO3: 2g;

ấm Cordyceps

ất rắn, chúng tôi

c nuôi trồng trên cơ òng nuôi rất khắt

ên môi trường

i quy mô công nghiệp và thời gian

ngắn hơn rất nhiều Trên c

môi trường nuôi cấy trệ

và phát triển cũng như ho

hành thay đổi các thành ph

khoáng, tìm ra thành ph

2.4.2.1 Ảnh hưởng củ

triển của chủng nấm Cordyceps

Giống nấmCordyceps militaris

được xác định từ thí nghi

20, 30, 40 g/l trong Theo dõi hình thái, màu

trên các môi trường và

ên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên c

ấy trện dịch thể, các yếu tố ảnh hưởng đến sự

ư hoạt tính sinh học sinh ra từ môi trường cành phần nitơ và nguồn cacbon cũng nhkhoáng, tìm ra thành phần môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng v

ủa nguồn cacbon tới khả năng hình thành và phát

Cordyceps militaris

Cordyceps militarisđược nuôi trênmôi trường thích h

thí nghiệm trên vàcó các hàm lượng đường khác nhau l Theo dõi hình thái, màu sắc và sự phát triển

và đo sinh khối của chúng trên thành phần tợng đường thích hợp nhất cho sự phát triể

ng nguồn nitơ đến khả năng hình thành và phát tri

Cordyceps militaris

ảnh hưởng của nguồn nitơ chúng tôi căn cứ vpepton có trong thành phần môi trường cơ bản và thay đổi với các giá tr

Theo dõi hình thái, màu sắc và xác định sinh khố

à tìm ra hàm lượng pepton thích hợp nhất cho s

ủa nhiệt độ tới thời gian sinh trưởng và phát tri

Cordyceps militaris

ờng PDA có hàm lượng đường và pepton t thí nghiệm trên, được cấy giống vào nuôi cấy tạ

20, 25, 30, 35ºC Theo dõi hình thái, màu sắc và sự phát tri

ên các môi trường So sánh và tìm ra nhiệt

ển của chủng nấm

ành nghiên cứu thành phần

đến sự sinh trưởng ờng cơ bản, và tiến

ng như các yếu tố ởng và phát triển

ình thành và phát

thích hợp nhất

ng khác nhau là 10, phát triển của sợi nấm

ần tương ứng So phát triển của chủng

à pepton tối ưu được

ấy tại các nhiệt độ

ự phát triển của

ệt độ thích hợp

nghiệm từ 5, 6, 7, 8 Theo dõi hình thái, màu s

trên các môi trường So

chủng nấm

2.4.3.Nghiên cứu kỹ thu

trên môi trường rắn

Trong công nghệ

tạo thành quả thể là giai

Cordyceps militaris phát tri

nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩ

cấy và các phụ gia bổ sung v

Các thí nghiệm nghi

trộn phụ gia đến sự ăn lan c

dụng để thực hiện tiếp các nghi

phối trộn phụ gia đến khả

2.4.3.1 Nghiên cứu ảnh h

phát triển của quả thể

Chúng tôi lựa chọ

(Khang dân); Gạo lứt; G

Các loại gạo này đư

(đường kính 6cm và chi

lượng như nhau,cấy giố

ủa giá trị pH môi trường tới sự sinh trư

Cordyceps militaris

ờng có hàm lượng đường, hàm lượng pepton v nhất làm gốc, chúng tôi làm bước tiếp theo

ợp cho sự phát triển của chủng nấm,dải pH

8 Theo dõi hình thái, màu sắc và sự phát triển c

ng So sánh và tìm ra pH thích hợp nhất cho sự phát tri

thuật nuôi trồng tạo quả thể nấm Cordyceps

ệ nuôi cấy quả thể nấm Cordyceps militaris

à giai đoạn hết sức quan trọng Nhằm giúp hphát triển thành quả thể, ngoài sự tác động c

độ ẩm, ánh sáng) còn chịu sự ảnh hưởng của c

ổ sung vào cơ chất đó

ệm nghiên cứu sự ảnh hường của cơ chất và công th

ự ăn lan của hệ sợi Cordyceps militaris tiếp t

ếp các nghiên cứu sự ảnh hưởng của cơ chất vđến khả năng hình thành và phát triển của quả th

nh hưởng của cơ chất đến khả năng hình thành và

ể nấm Cordyceps militaris trên môi trườ

a chọn các loại cơ chất nuôi trồng chính là: G

; Gạo nếp thơm

được cho vào các bình nuôi trồng bằng th

à chiều cao 10-12cm) Các bình được cho c

ấy giống nấm Cordyceps militaris vào các bìn

sinh trưởng và phát

ng pepton và điều kiện

ếp theo đó là tìm

pH lựa chọn thử phát triển của sợi nấm

t cho sự phát triển của

Cordyceps militaris

Cordyceps militaris giai đoạn

m giúp hệ sợi nấm động của điều kiện

ng của cơ chất nuôi

à: Gạo tẻ trắng

thủy tinh/nhựa cho cơ chất với vào các bình với lượng

tương đương nhau Sau đ

TN4 thơm+50% Cơm g50% Cơm gạo nếp

Tương tự như thí nghi

sẽ được nuôi trong tối Khi s

Sau đó được nuôi trong phòng tối có nhiệt độ

n khi sợi nấm ăn kín bình thì đưa ra nuôi dưới ánh sáng

i gian chiếu sáng 8h/ngày

ảnh hưởng của cơ chất nuôi trồng nấm đến kh

n của quả thể nấm trên giá thể nuôi trồng, các công th trong bảng 2.1 dưới đây

ng của loại cơ chất đến khả năng hình thành và phát

ủa quả thể nấm Cordyceps militaris

ắng

- Thời gian quả thể bắt đầu hình thành (ngày)

- Số lượng quả thể /bình (quả)

- Thời gian thu hoạch được quả thể

- Khối lượng quả thể/ bình (g)

thí nghiệm trên, các bình cơ chất sau khi đư

ối Khi sợi nấm ăn kín cơ chất mới được đặt tr

Độ ẩm phòng nuôi là 85-90% và nhiệt độ

p các loại bóng đèn cho cường độ ánh sáng khác nhau Các lô

ật cùng thời gian chiếu sángđể nghiên cứu s ánh sáng đến khả năng hình thành và phát triển củ Các thí nghiệm được bố trí như bảng 2.2 dư

ứu sự ảnh hưởng

ủa quả thể nấm dưới đây