Tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm a h5n1 và h5n6 tại một số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh quảng nam năm 2016 2017

- Xác định độc lực của các nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 lưu hành Quảng Nam và sự biến đổi của các nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 nếu có giúp cho việc quản lý dịch bệnh và đánh giá hiệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ TRANG

TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 VÀ H5N6 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM THUỘC TỈNH QUẢNG NAM NĂM 2016- 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan

và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi

đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tô Long Thành và PGS.TS Phạm Ngọc Thạch đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Nội - Chẩn - Dược, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở Ðầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu chung về virus cúm gia cầm 3

2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 3

2.1.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm trên Thế giới 3

2.1.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 5

2.1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 9

2.1.5 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 10

2.1.6 Chẩn đoán bệnh 11

2.2 Một số đặc điểm của virus cúm A 12

2.2.1 Phân loại và danh pháp 13

2.2.2 Ðặc điểm hình thái và cấu trúc của virus cúm A 14

2.2.3 Các loại kháng nguyên 16

2.2.4 Phương thức biến đổi của kháng nguyên HA và NA 18

2.2.5 Ðộc lực của virus cúm gia cầm 20

2.2.6 Sự xuất hiện và lưu hành các nhánh virus A/H5N1, A/H5N6 tại Việt Nam 21

Phần 3 Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Ðịa điểm nghiên cứu 26

3.2 Thời gian nghiên cứu 26

3.3 Đối tượng - vật liệu nghiên cứu 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.4.1 Xác định được tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 26

3.4.2 Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6. 27

3.5.2 Phương pháp giải trình tự gen 29

3.5.3 Phương pháp phân lập virus trên tế bào xơ phôi và trứng gà có phôi 30 3.5.4 Xác định chỉ số EID 50 31

3.5.5 Xác định chỉ số TCID 50 31

3.5.6 Phương pháp Reed- Meunch 31

3.5.7 Phương pháp HA, HI giám định virus 32

Phần 4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại tỉnh Quảng Nam 34

4.2 Chẩn đoán cúm A/H5N1, A/H5N6 35

4.2.1 Chẩn đoán virus cúm týp A 35

4.2.2 Chẩn đoán virus cúm A/H5 37

4.2.3 Chẩn đoán virus cúm A/H5N1, A/H5N6 39

4.2.4 Kết quả xác định sự lưu hành của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 42 4.2.5 Kết quả xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo tháng 44 4.2.6 Xác định nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 47

4.3 Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 55 4.3.1 Phân lập và giám định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 55

4.3.2 Tính thích ứng trên phôi gà (xác định chỉ số EID 50 ) 56

4.3.3 Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (chỉ số TCID 50 ) 58

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 62

Tài liệu tham khảo 63

CEF ( Chicken Embryo Fibroblats)

DEF ( Duck Embryo Fibroblats)

EID 50 ( Embryo Infection Dose 50%)

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay)

FAO (Food and Agriculture Organisation)

HA (Hemaglutinin)

HI (Hemagglutination Inhibition)

HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza )

IVPI (Intravenous Pathogenicity Index)

LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza)

Mẫu1

Mẫu2

OIE (Office International des Epizooties)

rRT-PCR (Realtime Reverse Transcriptase –

Polymerase Chain Reaction)

TCVN

TCID 50 ( Tissue Culture Infection Dose 50%)

WHO (World Health Organisation )

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sự phân bố theo thời gian của virus cúm gia cầm ở Việt Nam.25 Bảng 3.1 Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6 28

Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng Real time RT-PCR 28

Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA 29

Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng RT-PCR 30

Bảng 3.5 Bảng tổng hợp số liệu để tính toán chỉ số EID 50 và TCID 50 32

Bảng 4.1 Kết quả xét nghiệm virus cúm A 35

Bảng 4.2 Kết quả xét nghiệm cúm A/H5 37

Bảng 4.3 Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 40

Bảng 4.4 Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 42

Bảng 4.5 Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà theo tháng 44 Bảng 4.6 Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên vịt theo tháng 46 Bảng 4.7 Danh sách các mẫu gửi giải trình tự gen 48

Bảng 4.8 Danh sách các chủng virus cúm sử dụng làm tham chiếu 49

Bảng 4.9 Kết quả xét nghiệm và phân lập virus 55

Bảng 4.10 Kết quả thời gian gây chết phôi 57

Bảng 4.11 Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/ chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2. 57

Bảng 4.12 Kết quả theo dõi virus gây nhiễm lên tế bào CEF 59

Bảng 4.13 Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus mẫu1, mẫu 2 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sự phân bố của virus cúm A/H5 8

Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm A 14

Hình 2.3 Sự phân bố không gian của các nhánh virus cúm gia cầm từ tháng 7/2016 tới tháng 6/2017 24 Hình 4.1 Bản đồ tỉnh Quảng Nam 34

Hình 4.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A 36

Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5/số mẫu xét nghiệm 38

Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus A/H5/Số mẫu dương tính cúm A 38

Hình 4.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6/số mẫu xét nghiệm 40

Hình 4.6 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6/số mẫu dương tính virus cúm A/H5 41 Hình 4.7 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo loài 43

Hình 4.8 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà theo tháng 45

Hình 4.9 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên vịt theo tháng 47

Hình 4.10 Cây phả hệ của các chủng virus cúm A/H5 52

Hình 4.11 Cây phả hệ của các chủng virus cúm A/H5 nhánh 2.3.2.1c. 53

Hình 4.12 Cây phả hệ của các chủng virus cúm A/H5 nhánh 2.3.4.4b 54

Hình 4.13 Hình ảnh tế bào CEF khi phân lập và chuẩn độ virus 61

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Nguyễn Thị Trang

Tên luận văn: Tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm A/H5N1 và H5N6 tại một số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh Quảng Nam năm 2016 – 2017.

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp

Việt Nam Mục đích nghiên cứu

- Xác định được tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà, vịt tại một số chợ ở Quảng Nam qua đó để có những biện pháp quản lý việc buôn bán gia cầm sống tại các chợ.

- Xác định độc lực của các nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 lưu hành Quảng Nam và sự biến đổi của các nhánh virus cúm A/H5N1, A/H5N6 (nếu có) giúp cho việc quản lý dịch bệnh và đánh giá hiệu quả sử dụng vắc xin tại Quảng Nam.

Phương pháp nghiên cứu

- Xét nghiệm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 bằng phương pháp rRT – PCR từ các mẫu swab thu được.

- Lập cây phả hệ dựa trên kết quả giải trình tự của gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 thu thập được trên địa bàn tỉnh Quảng Nam sử dụng phần mềm Biodit và Mega 7.

- Nuôi cấy, phân lập virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên phôi trứng gà và

tế bào xơ phôi.

Kết quả chính và kết luận

Kết quả đánh giá tỷ lệ nhiễm virus cúm cho thấy, virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 lưu hành trên cả gà và vịt buôn bán tại một số chợ thuộc địa bàn tỉnh Quảng Nam trong giai đoạn 6 tháng cuối năm 2016 và 6 tháng đầu năm 2017 Tỷ lệ lưu hành virus cúm A là 10,46 %, virus cúm A/H5 là 1,94 %, virus cúm A/H5N1 là 0,28 % và A/H5N6 là 1,2%.Tỷ lệ lưu hành virus cúm H5N6 cao hơn so với H5N1 và tỷ lệ mắc trên vịt cao hơn trên gà Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gia cầm tại các chợ (chợ Điện Bàn, chợ Núi Thành và chợ Phú Ninh) cao nhất vào các tháng 11 và tháng 1 với H5N6, H5N1 là tháng 2, và thấp nhất là vào khoảng từ tháng 7 đến tháng 10

Kết quả phân tích di truyền (cây phả hệ dựa trên trình tự của gen HA của các virus cúm thu thập được từ các chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn tỉnh Quảng Nam) cho

thấy các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh virus 2.3.2.1c, và các chủng virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 b Đây là các nhánh virus đang lưu hành rộng khắp cả nước, đặc biệt là ở các tỉnh Miền Trung Do đó, có thể sử dụng các loại vắc xin Navet-Vifluvac (do Công ty Navetco sản xuất) và vắc xin H5N1 Re-5 (nhập khẩu từ Trung Quốc) theo khuyến cáo của Cục Thú y để phòng bệnh Cúm gia cầm tại Quảng Nam.

Môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển nhân lên của virus CGC là trên môi trường phôi trứng gà và môi trường tế bào xơ phôi gà Như vậy, với kết quả chuẩn

độ của cả 2 virus trên 2 môi trường nuôi dưỡng này là có hiệu giá khá tương đồng với nhau: 10 8 EID 50 /ml và 10 7,9 EID 50 /ml, 10 7,2 TCID 50 /ml và 10 7,4 TCID 50 /ml.

THESIS ABSTRACTMaster candidate: Nguyen Thi Trang

Thesis title: Avian Influenza situation and biological characterizations of A/H5N1 and H5N6 viruses in live bird markets in Quang Nam province, 2016-2017.

Major: Veterinary Medicine Code: 24 15 10 41

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA) Study Objectives

in chickens and ducks in live bird markets in Quang Nam province in order to provide control measures for poultry trading in those live bird markets.

- Determine the virulence and to identify clade variants of avian influenza A/H5N1 and A/H5N6 viruses circulating in Quang Nam province (if any) to support the disease management and evaluate the effectiveness

of vaccine usage in Quang Nam province.

- Culturing and isolating avian influenza A/H5N1 and A/H5N6

viruses using chicken embryos eggs and chicken embryo fibroblats cells Main findings and conclusions

The results showed that A/H5N1 and A/H5N6 viruses circulated in both chickens and ducks which were sold in some markets in Quang Nam province in the last 6 months of 2016 and the first 6 months of 2017 The prevalence of influenza A, A/H5, A/H5N1 and A/H5N6 viruses were 10.46%, 1.94%, 0.28% and 1.2% respectively The prevalence of A/H5N6 virus was higher than A/H5N1 virus, and the incidence in ducks was higher in chickens The prevalence of A/H5N1, A/H5N6 in some markets (such as Dien Ban, Nui Thanh and Phu Ninh markets) was highest in November and January with H5N6 and with H5N1 was in February, and the lowest prevalence was from July to October.

Phylogenetic analysis (phylogenetic tree generated based on sequences of

HA gene of the A/H5N1 and A/H5N6 viruses collected from live bird markets in Quang Nam province) indicated that A/H5N1 viruses belonged to clade 2.3.2.1c, and A/H5N6 viruses belonged to clade 2.3.4.4 These two clades are widely circulating through out the country, especially in the Central provinces Therefore, Navet-Vifluvac vaccine (manufactured by Navetco) and H5N1 Re-5 vaccine (imported from China) can be used in Quang Nam as recommended by the Department of Animal Health The most suitable environment for the development of the avian influenza virus is on the embryo environment and the chicken embryo cellular environment Thus, the titres of both viruses in these two media were titrated

PHẦN 1 MỞ ÐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ÐỀ TÀI

Bệnh Cúm gia cầm (CGC) xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2003, đầu năm 2004 và được ghi nhận là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI) gây nên Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao không những gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi mà còn rất nguy hiểm đối với con người Từ năm 2003 đến 6/2017, thế giới đã ghi nhận các ca bệnh trên người do cúm A/H5N1 ở 16 quốc gia, với tổng số 856 ca bệnh và 452 người chết, riêng Việt Nam có

127 trường hợp mắc bệnh và 64 người chết (WHO, 2017).

Đặc điểm của virus cúm A/H5N1 là biến đổi rất nhanh và đến nay đã có nhiều biến chủng H5N1 được phát hiện tại nhiều nước từ châu Á sang châu

Âu Việt Nam cũng đã phát hiện được nhiều biến chủng virus A/H5N1 khác nhau, được phân loại thành các nhánh (clade) và phân nhánh (subclade) như

1, 1.1, 2.3.4, 2.3.2.1, 3, 5, 7.1, 7.2 (Nguyen et al., 2014) Các kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nước cho thấy có nhiều biến chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 mới đã xuất hiện tại Việt Nam do sự tiến hóa của các chủng virus địa phương hoặc do sự lây nhiễm từ các quốc gia khác thông qua buôn bán gia cầm và các sản phẩm gia cầm hoặc chim di cư… làm giảm, thậm chí vô hiệu hóa hiệu quả của các chiến dịch phòng bệnh bằng vacxin.

Giám sát sự xuất hiện của virus CGC mới là việc làm cần thiết, nhằm phát hiện sự có mặt của các biến chủng virus mới để có thể đưa ra các sách lược phòng chống phù hợp Việc thực hiện các đợt giám sát virus CGC ở các chợ buôn bán gia cầm sống là rất quan trọng bởi chợ buôn bán gia cầm sống tập trung một lượng lớn động vật được bắt nguồn từ nhiều nguồn khác nhau,

từ các vùng địa lý rộng lớn và có thể là môi trường thích hợp cho khả năng tái

tổ hợp, duy trì, nhân lên và lan truyền virus CGC độc lực cao cho gia cầm và con người (Soares et al., 2010; Leung et al., 2007) Đồng thời, ở Việt Nam với phương thức chăn nuôi gia cầm nhỏ lẻ và phân tán, phát hiện virus cúm tại các địa phương thông qua chợ buôn bán gia cầm sống là cách tốt nhất.

Quảng Nam là một trong những tỉnh có quy mô chăn nuôi lớn đặc biệt là chăn nuôi gia cầm Dịch CGC có thể bùng phát và nguy cơ lây sang người là

rất cao, gây thiệt hại cho nền kinh tế của tỉnh Vì vậy, để chủ động trong công tác phòng chống dịch CGC tại địa phương, giảm thiểu các tổn thất cho người nông dân và ngăn chặn dịch bệnh lây sang người, chúng tôi tiền hành đề tài “ Tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm A/H5N1 và H5N6 tại một số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh Quảng Nam năm 2016 – 2017".

Công việc này được tiến hành trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của viruscúm A/H5N1 trên đàn gia cầm

ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao”,

có mã số ĐTĐL.CN-10/15 do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ÐỀ TÀI

- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 tại các chợ buôn bán gia cầm sống ở tỉnh Quảng Nam.

- Xác định nhánh của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam.

- Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam.

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ÐỀ TÀI

- Xác định được tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên

gà, vịt tại một số chợ ở Quảng Nam qua đó để có những biện pháp quản lý việc buôn bán gia cầm sống tại các chợ.

- Phân lập được virus CGC độc lực cao phục vụ cho công tác chẩn đoán và lưu giữ giống virus Điều này giúp cho việc có thông tin chủ động trong việc phát hiện sớm những nguy cơ dịch CGC có thể xảy ra, chủ động nâng cao công tác phòng và chống bệnh CGC.

- Thông qua giải trình tự gen các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 phân lập được để xác định các clade của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 lưu hành tại tỉnh Quảng Nam và sự biến đổi của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 (nếu có) giúp cho việc quản lý dịch bệnh và đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin tại Quảng Nam.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS CÚM GIA CẦM

2.1.1 Khái niệm bệnh Cúm gia cầm

Bệnh CGC là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm do virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra.

CGC lần đầu tiên được phát hiện ở Italia vào năm 1878 với tên gọi là dịch hạch gà (Fowl plague) (Stubb et al., 1965) Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 1955 mới xác định được chính xác nguyên nhân gây bệnh CGC là vi rút cúm type A (A/H7N1 và A/H7N7) gây chết nhiều gà

và gà tây và các loài động vật khác (Beard et al., 1998).

Virus CGC chủ yếu gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các loại chim Những loài chim di cư mang mầm bệnh và thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng do chúng có sức đề kháng tự nhiên Loài thủy cầm mang mầm bệnh là nguồn tàng trữ

và lây nhiễm cho các loài gia cầm khác (Tô Long Thành, 2006) 2.1.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới

2.1.2.1 Dịch cúm gia cầm thể độc lực cao

Kể từ khi bệnh CGC thể độc lực cao lần đầu tiên được xác nhận tại Scotland vào năm 1959, đã có hơn 28 đợt bùng phát dịch xảy ra trên toàn thế giới, trong đó có 8 đợt dịch lớn gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng (Lupiani and Reddy, 2009):

(Mỹ) làm chết, tiêu hủy 17 triệu gà và gà tây với tổn thất kinh tế trực tiếp là

62 triệu đô la và tổn thất gián tiếp ước tính hơn 250 triệu đô la.

- Năm 1994, dịch CGC do virus cúm A/H5N2 gây ra tại

Mexico, do virus H5N2 đột biến từ độc lực thấp sang độc lực cao.

- Năm 1999, dịch CGC do virus A/H7N1 xảy ra tại Italia Trong đợt dịch này, hơn 14 triệu gia cầm đã bị giết để ngăn chặn dịch lây lan.

- Năm 2002, tại Chi-lê xảy ra dịch CGC do virus A/H7N3 gây ra Tổn thất kinh tế trong đợt dịch này ước tính khoảng 31 triệu đô la.

- Năm 2003, dịch CGC do virus A/H7N7 xảy ra tại Hà Lan sau đó dịch lan sang Bỉ và Đức Đợt dịch đã làm 30 triệu gia cầm ở Hà Lan (1/4 đàn gia cầm của Hà Lan), 2,7 triệu gia cầm ở Bỉ, 400 nghìn gia cầm ở Đức bị tiêu hủy Tổn thất kinh tế ước tính khoảng 750 triệu bảng Anh.

- Năm 2004, tại Canada xảy ra dịch CGC do virus A/H7N3 gây

ra Tổn thất kinh tế ước tính khoảng 300 triệu đô la.

lưu hành ở mức độ thấp ở Đông Á từ 1996 đến 2003 Từ cuối năm 2003 đến

2012, dịch CGC A/H5N1 bùng phát ở nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và liên tục tái bùng phát hàng năm ở nhiều nước trên thế giới Đến nay đã có nhiều nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch CGC A/H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hong Kong, Việt Nam Tính đến năm 2012

đã có tổng số 250 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu huỷ bắt buộc tại 63 quốc gia và vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm (Swayne, 2012).

- Trong năm 2014: Chủng virus cúm gia cầm H5N6 lần đầu tiên nổ

ra tại Trung Quốc vào 4-2014 Làm một bệnh nhân 49 tuổi ở tỉnh Tứ Xuyên - Trung Quốc tử vong, đây cũng là bệnh nhân đầu tiên và duy nhất trên thế giới nhiễm cúm A/H5N6 được ghi nhận vào thời điểm này 2.1.2.2 Dịch cúm gia cầm thể độc lực thấp

Bệnh cúm do virus CGC thể độc lực thấp (LPAI) được xác định từ giữa thế kỷ 20 Chủng virus độc lực thấp đầu tiên được phát hiện là chủng Dinter phân lập được ở gà năm 1949, và được xác định là virus cúm A/H10N7 năm 1960 LPAI cũng được phân lập từ vịt có triệu chứng đường

hô hấp trong khoảng từ 1953 – 1963 tại Canada, Cộng hòa Séc và Slovakia, Anh, Ukraine Virus CGC độc lực thấp gây bệnh đường hô hấp và giảm đẻ

ở gà tây tại Canada và Mỹ trong những năm đầu 1960 Virus CGC độc lực thấp nằm trong subtype H5 cũng đã được phát hiện ở Canada 1966 và ở Mỹ năm 1968 Năm 1971 virus cúm A/H7N3 cũng được phân lập ở Oregon từ đàn gà tây có triệu chứng bệnh đường hô hấp nhẹ Từ 1971, nhiều chủng virus CGC độc lực thấp thuộc subtype H5 và H7 cũng đã được phân lập.

Các đợt bùng phát bệnh do virus cúm độc lực thấp A/H9N2 cũng

đã được thông báo ở Đức, Italy, Ireland, Nam Phi, Mỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đông Nam Á, Trung Á, Iran và Pakistan và A/H9N2 được xem là bệnh địa phương ở khắp Châu Á (Lupiani and Reddy, 2009) 2.1.2.3 Dịch cúm gia cầm ở người

Ở người, virus cúm đã gây ra 8 đại dịch trong thế kỉ XVII, 5 đại dịch trong thế kỉ XX Đại dịch cúm lần đầu tiên được xác nhận đã xảy ra vào những năm 1510 và 1580 Kể từ đó đến năm 2003, trên toàn thế giới đã có những đợt dịch lớn (Kamps et al., 2006) sau:

khoảng 20

- 40 triệu người trên toàn thế giới Các số liệu có sức thuyết phục sau này cho thấy đại dịch này do virus cúm type A/H1N1 gây ra.

từ Hong Kong năm 1957, sau đó lan sang Đài Loan, Philippines, Singapore, Việt Nam Ấn Độ, Anh,… Số người chết ước tính khoảng 1- 2 triệu người.

- Cúm Hồng Kông do virus cúm type A/H3N2, xảy ra năm 1968 làm khoảng 700 nghìn người chết.

- Cúm Nga - “Russia flu” do virus cúm type A/H1N1 xảy ra năm 1977 Dịch xảy ra bắt đầu từ Nga sau đó lan ra toàn thế giới.

A/H5N1, trong số đó 452 trường hợp đã tử vong chiếm 52,8% (WHO, 2017).

2.1.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Bệnh CGC xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 (Bùi Quang Anh, 2005; BCĐQG, 2005) do virus CGC A/H5N1 độc lực cao (HPAI) gây ra Sau đó, bệnh liên tục tái phát hàng năm và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là vụ Đông – Xuân Theo Cục Thú

y, tính tới năm 2010 thì có 6 đợt dịch (epidemic) CGC A/H5N1 xảy ra:

2.574 xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu con; thuỷ cầm: 13,5 triệu con) Trong năm 2003 có 3 người tử vong do virus cúm A/H5N1.

- Đợt 2: Từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành phố Thời gian cao điểm nhất là tháng 7, sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.078 con (gà: 55.999 con, vịt: 8.132 con) Trong năm

2004, có 29 người mắc bệnh và 20 người chết do nhiễm virus A/H5N1.

182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầm bị tiêu huỷ là 470.495 con gà, 825.689 con vịt, ngan Trong năm 2005, có 61 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1

ở người, trong đó có 19 ca tử vong.

- Đợt 4: Từ tháng 10/2005 đến 01/2006: Dịch xảy ở cả 3 miền với

24 tỉnh, thành phố tái phát Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.972.763 con trong đó gà là 1.338.523 con; thuỷ cầm và loài khác là 2.135.081 con.

- Đợt 5: Bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 2007 Dịch không tập trung mà rải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và có thể chia nhiều đợt:

Từ 12/2006 đến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận, huyện thuộc 11 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 103.092 con, trong đó có 13.622 con gà; 89.472 con ngan, vịt.

Từ 5/2007 đến 8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con (21.525 con gà; 264.549 con vịt và 8.775 con ngan) Sau khi bị khống chế trong vòng 1 tháng, đến tháng 10/2007, dịch lại tái phát ở 15 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn thuộc 6 tỉnh, thành phố Năm 2007, có 8 người bị nhiễm virus cúm A/H5N1, trong đó có 5 người tử vong.

- Đợt 6: Từ đầu năm 2008, dịch xảy ra rải rác tại 57 xã, phường của 40 huyện, thị thuộc 21 tỉnh Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 60.090 con, trong đó có 23.498 con gà, 36.592 con thuỷ cầm Năm 2008, có

6 người nhiễm virus cúm A/H5N1 trong đó có 5 người tử vong.

- Năm 2009, dịch CGC đã xảy ra ở 71 xã, phường, thị trấn của 35 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành phố với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy trên 105.601 con Năm 2009, có 5 người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 (Tống Xuân Độ, 2009).

- Năm 2010, dịch CGC đã xảy ra ở ít nhất 63 xã, phường của 37 huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố, làm hơn 76.000 con gia cầm mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy, trong đó chủ yếu là vịt (chiếm hơn 70%) Trong năm 2010, có 7 ca mắc A/H5N1 ở người và có 2 ca tử vong.

- Năm 2011, cả nước xảy ra 92 ổ dịch tại 71 xã của 40 huyện thuộc

21 tỉnh làm 99.780 con gia cầm mắc bệnh (37.558 con gà; 61.171 con vịt

và 1.051 con ngan), tiêu huỷ 132.667 con gia cầm các loại.

- Năm 2012, cả nước xảy ra 374 ổ dịch, phân bố chủ yếu ở Miền Bắc và Bắc Trung Bộ Trong 3 tháng đầu năm, dịch CGC đã xảy ra ở 59 xã/ phường của 42 huyện /quận thuộc 14 tỉnh/ thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 66.373 con, trong

đó gồm 8.711 gà, 56.550 vịt, 1.112 ngan.

- Năm 2013, dịch CGC A/H5N1 đã xảy ra tại 50 xã, phường của

23 huyện, quận thuộc 7 tỉnh, làm 59.829 con gia cầm mắc bệnh, số gia cầm chết và tiêu hủy là 79.522 con.

- Năm 2014, dịch CGC A/H5N1 đã xảy ra tại 158 xã, phường của

93 huyện, quận thuộc 33 tỉnh Tổng số gia cầm mắc bệnh là 212.600 con, trong đó gà là 84.972 con, vịt là 136.426 con Trong năm 2014 có

6 xã của 6 huyện thuộc 6 tỉnh có ổ dịch cúm A/H5N6, tổng số gia cầm mắc bệnh và phải tiêu hủy do mắc cúm A/H5N6 là 17.188 con.

- Năm 2015, dịch CGC A/H5N1 đã xảy ra tại 39 xã, phường của

21 huyện, quận thuộc 21 tỉnh, làm 32.828 con gia cầm mắc bệnh.

- Trong 6 tháng đầu năm 2016 trên địa bàn cả nước đã ghi nhận 8 ổ dịch cúm gia cầm H5N1 và H5N6 Trong đó có 6 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 6 xã thuộc 6 huyện của 5 tỉnh Quảng Ngãi, Kon Tum, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Nghệ An và có 2 ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại 2 xã thuộc 2 huyện của thành phố Cần Thơ.

Số gia cầm chết và buộc phải tiêu hủy là 10.945 con.

Từ năm 2004 đến 2009, các ổ dịch CGC xuất hiện chủ yếu ở các tỉnh Miền Bắc và các tỉnh Miền Nam Từ 2010 đến 2014, các ổ dịch có tính chất phân tán xảy ra ở nhiều tỉnh trong cả nước bao gồm cả các tính Miền Bắc, Miền Trung và Miền Nam (Hình 2.1).

Hình 2.1 Sự phân bố của virus cúm A/H5

Nguồn: FAO (2016)

2.1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm

2.1.4.1 Phân bố dịch bệnh

Sự phân bố và lưu hành virus CGC xảy ra trong phạm vi toàn cầu do sự di trú của các dã cầm, do đó rất khó dự đoán khi nào virus xuất hiện, gây thành dịch cho đàn gia cầm nuôi và việc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các loài dã cầm với loài gia cầm nuôi có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi gia cầm (Cục Thú y, 2004).

2.1.4.2 Ðộng vật cảm nhiễm

Gà, ngan, vịt, chim cút mọi lứa tuổi đều mắc cúm nhưng bệnh thường

ở gia cầm 4-6 tuần tuổi Gia cầm dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao nhất ở nơi bệnh phát ra lần đầu, ở gia cầm sắp đẻ hoặc thời kỳ đẻ cao nhất Gia cầm có khả năng sản xuất càng cao thì càng mẫn cảm với virus Gia cầm mái dễ bị nhiễm virus cúm hơn con trống (Suarez and Mary, 2008).

Virus CGC có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú khác như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi và cả con người Nhiều nghiên cứu mới đây cho thấy loài mèo, vốn được coi là không cảm nhiễm với virus cúm, cũng mắc bệnh và chết (Beard et al., 1991) 2.1.4.3 Vật mang virus

Virus cúm đã phân lập được ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt đuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu Tần suất và số lượng virus phân lập được ở thủy cầm, đặc biệt vịt trời đều cao hơn các loài khác (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004).

Vịt từ khi bị nhiễm đến khi bắt đầu thải virus trong vòng 30 ngày Virus được duy trì trong đàn vịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyền cho các con non theo đường tiêu hóa do virus bài thải theo phân, gây ô nhiễm ao,

hồ (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004).

Kết quả điều tra thủy cầm ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60 % chim non bị nhiễm virus do tập hợp đàn trước khi di trú Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân type virus cúm A diễn ra ở chim hoang dã, virus không gây độc đối với vật chủ, được nhân lên ở đường ruột của chim khiến cho các loài này mang virus và là nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm (Alexander, 2000).

hoặc những dụng cụ chăn nuôi, phân, thức ăn, nước uống, quần áo, giầy dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, côn trùng có mang mầm bệnh.

Virus cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi Phần lớn các ổ dịch CGC do sự lây lan thứ cấp thông qua con người (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004).

- Trên người

Đối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày trung

3 ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho, sổ mũi nhức đầu, khó thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỉ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người (Claas et al., 1998; Hui, 2008) Trong trường hợp không xảy ra những biến chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong vòng một tuần Tuy nhiên, nếu bị biến chứng viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai thì bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong (Bauer et al., 2006; Gambotto et al., 2008).

2.1.5.2 Bệnh tích

Theo Lê Văn Năm (2004) mức độ biến đổi bệnh tích của bệnh CGC đa dạng phụ thuộc vào độc lực virus, quá trình diễn biến của bệnh Một số biến đổi của bệnh CGC như: Mào và tích thâm tím, phù nề, xuất huyết dưới da và rìa tích Xuất huyết dưới da ống chân thành vệt, nốt Khí quản viêm xuất huyết, chứa nhiều đờm Túi khí phù nề, thành túi khí dầy và có nhiều fibrin bám dính Phổi viêm cata, xuất huyết đến viêm fibrin làm phổi dính vào lồng ngực Viêm xuất huyết đường ruột, đặc biệt vùng hậu môn, van hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng Bao tim tích nước vàng, xuất huyết màng bao tim,

mỡ vành tim, cơ tim Lách biến màu lốm đốm vàng, rắn chắc hơn bình thường Tụy khô, xuất huyết Viêm xuất huyết buồng trứng, ống dẫn trứng, nhiều trường hợp trứng non dập vỡ, xoang bụng tích nước vàng lợn cợn Xuất huyết màng treo ruột, màng bao dạ dày tuyến, dạ dày cơ, màng xương lồng ngực có thể coi là đặc điểm riêng của bệnh CGC.

Các biến đổi đặc trưng về tổ chức học bao gồm phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập bạch cầu đơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào, tích, gan, thận, mắt và thần kinh Ngoài tế bào bạch cầu đơn nhân còn có tế bào đặc trưng cho phản ứng viêm, hoại tử 2.1.6 Chẩn đoán bệnh

2.1.6.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học

Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ như bệnh lây lan nhanh, nhiều loại gia cầm, gia cầm ở mọi lựa tuổi đều mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% Bệnh thường xảy ra ở những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vacxin cúm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp.

2.1.6.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích

Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình của bệnh (mục 2.1.5.1 và mục 2.1.5.2) để chẩn đoán bệnh Trong trường hợp gia cầm chết cấp tính thì biểu hiện bệnh tích thường không điển hình 2.1.6.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Chẩn đoán virus học: Nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà

có phôi ấp 8-10 ngày hoặc trên môi trường tế bào xơ phôi Giám định virus trong dịch nuôi cấy bằng các phản ứng HA, HI.

Chẩn đoán và giám định virus bằng kỹ thuật Real time RT-PCR (rRT PCR) Hiện nay kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi và thường quy ở Việt Nam, cũng như nhiều nước trên thế giới.

Chẩn đoán huyết thanh học sử dụng phản ứng HA, phản ứng HI, phản ứng EELISA để phát hiện kháng thể.

và làm giảm mức độ bài thải virus ra mội trường.

Kiểm soát vận chuyển gia cầm và sản phẩm gia cầm để giảm thiểu sự lây lan dịch bệnh từ vùng dịch sang vùng không có dịch.

Kiểm soát giết mổ: Xây dựng các lò giết mổ gia cầm tập trung để kiểm soát nguồn gốc và tình hình dịch bệnh của gia cầm giết mổ, áp dụng dây chuyền giết mổ tự động và đóng gói sản phẩm khi đưa ra tiêu thụ.

Giám sát chủ động bệnh CGC nhằm phát hiện sớm ổ dịch và sự lưu hành của vi rút cúm để cảnh báo sớm nguy cơ phát sinh dịch bệnh, nguy cơ mất vệ sinh an toàn thực phẩm, nguy cơ virus cúm xâm nhập vào Việt Nam.

Vệ sinh, tiêu độc, khử trùng định kỳ tại cơ sở chăn nuôi, các chợ buôn bán gia cầm sống để diệt trừ mầm bệnh ở ngoài môi trường Phát hiện và chẩn đoán nhanh các ổ dịch, thực hiện các biện pháp phòng chống dịch theo hướng dẫn của cơ quan thú y Truyên truyền, vận động người dân không buôn bán gia cầm sống tại các chợ và khu vực đông dân cư, khai báo với cán bộ thú

y khi thấy gia cầm có biểu biện bệnh.

2.2 MỘT SỐ ÐẶC ÐIỂM CỦA VIRUS CÚM A

Họ Orthomyxoviridae bao gồm 4 nhóm virus, đó là: Nhóm virus cúm A

(Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C);

và nhóm Thogoto virus Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA, ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogoto virus là Glycoprotein (GP) (Ito et al., 1998; Murphy and Webster, 1996) Nhóm virus cúm A có phổ vật chủ rất rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác nhau.

2.2.1 Phân loại và danh pháp

2.2.1.1 Phân loại

Virus cúm được phân loại thành các týp dựa trên phản ứng huyết thanh học với các nội protein NP và M1 Các virus CGC đều thuộc virus cúm A (týp A), virus cúm B, C gây bệnh chủ yếu ở ngườivà cả hai đều không phân lập được từ gia cầm.

Các chủng virus cúm A khác nhau có thể phân loại thành các phân týp (subtype) dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (De Wit and Fouchier, 2008) Nhóm virus cúm A có ít nhất 16 subtype HA (từ H1 đến H16) và 9 subtype NA (từ N1 đến N9) (OIE, 2015) Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau.

Đối với subtype A/H5, từ năm 2008, dựa trên cơ sở các trình

tự gien H5 của các virus cúm có nguồn gốc từ virus cúm A/H5N1 A/goose/Guangdong/1/96, virus được phân chia thành 10 nhánh (clade) ban đầu hay nhánh lớp thứ nhất được đánh số từ 0 đến 9, các nhánh này tiếp tục được phân chia thành các nhánh lớp thứ 2, lớp thứ 3,… Việc phân nhánh dựa trên ba tiêu chí (WHO, 2008):

Năm 1980, Tổ chức Y tế thế giới đã đưa ra hệ thống phân loại đặt tên virus cúm như sau: Chủng virus/loài vật chủ phân lập được virus/vị trí địa lý/quy ước chủng của phòng thí nghiệm/năm phân lập/loại subtype của virus.

Ví dụ virus cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008(H5N1) được hiểu là virus cúm nhóm A, được phân lập từ gà (Chicken), nơi phân lập là Việt Nam, quy ước chủng của phòng thí nghiệm là NCVD-

03, thời gian phân lập năm 2008, subtype H5N1.

2.2.2 Ðặc điểm hình thái và cấu trúc của virus cúm A

Các virion virus (hình 2.2) có dạng hình khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 – 120 nm Nhiều khi virus có dạng hình sợi dài đến vài trăm nm Phân tử lượng của hạt virus khoảng 250 triệu Dalton.

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền ARN của virus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép Trên bề mặt virusđược bao phủ bởi 2 loại kháng nguyên có bản chất là glycoprotein có độ dài khoảng 10 -

14 nm và đường kính 4 - 6 nm gồm: Hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) (Cox and Subbarao, 2000) Đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy and Webster, 1996; Uiprasertkul et al., 2007).

Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm A Nguồn: http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/influenza.htm#sect3.2

Hệ gen của virus cúm A là ARN sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất

bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007):

protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã ARN virus và có liên quan tới tính thích nghi nhiệt độ cơ thể vật chủ (Subbarao et al., 1998).

enzyme PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp ARN virus, chịu trách nhiệm gắn mũ ARN (Murphy and Webster, 1996) Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey et al., 2002).

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA PA là một tiểu đơn

vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã ARN trong quá trình tổng hợp ARN của virus (Luong and Palese, 1992).

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A (ở H5N1 là khoảng 1704 - 1710 bp) Đây là gien chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một

số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, đây là vùng quyết định độc lực của virus (Bosch et al., 1981; Gambotto et al., 2008).

- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển ARN giữa nhân và bào tương tế bào chủ (Luong and Palese, 1992; Murphy and Webster, 1996; Rӧmer-Oberdӧrfer et al., 2008).

dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) (Lê Thanh Hòa, 2004) Đây là gien mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus.

đệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạo ra

bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn ARN), cùng với

HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek et al., 2002).

- Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy and Webster, 1996; Sekellick et al., 2000) NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.103

(non-Da (trên thực tế là 25.103 (non-Da) NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.103 Da (trên thực tế là 12.103 Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick et al., 2000; Zhu et al., 2008).

2.2.3 Các loại kháng nguyên

Virus CGC có nhiều loại kháng nguyên như protein nhân (NP), protein đệm (M), protein gây ngưng kết hồng cầu (HA) và protein enzym cắt thụ thể (NA),… Trong đó hai kháng nguyên HA và NA vừa

là cơ sở cho việc định subtype virus cúm type A vừa có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ HA được coi là yếu tố vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus cúm A.

chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981; Wagner et al., 2002).

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng ARN hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân

tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002; Wasilenko et al., 2008).

Vị trí amino acid 226 (aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS

và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong and Palese, 1992) Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có mật độ cao trong đường hô hấp (Bauer et al., 2006; Hui, 2008; Wasilenko et al., 2008) Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Luong and Palese, 1992).

Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm

A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vắc xin phòng cúm hiện nay (Horimoto and Kawaoka, 2001; Matrosovich et al., 1999).

2.2.3.2 Protein NA (neuraminidase)

Protein neurominidase là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA (Baigent and Mc Cauley, 2001; Uiprasertkul et al.,

2007) Có 9 subtype (từ N1 đến N9) đã được phát hiện và chủ yếu ở virus CGC, hai subtype N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Wasilenko et al., 2008) Có khoảng 100 phân

tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid của hạt virus Phân tử

NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci and Kawaoka, 1993).

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Uiprasertkul et al., 2007).

Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường

hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu

mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu.

Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của

NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Aoki et al., 2007; Castrucci and Kawaoka, 1993).

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm

có tác dụng phong tỏa protein NA (Doherty et al., 2006).

2.2.4 Phương thức biến đổi của kháng nguyên HA và NA

Virus cúm thường xuyên thay đổi kháng nguyên glycoprotein bề mặt (HA

và NA) bởi hai phương thức chủ yến là hiện tượng lệch kháng nguyên (antigen drift) và hiện tượng tái tổ hợp các gen kháng nguyên (antigenic shift).

2.2.4.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn HA và NA của virus Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên

mã và sao chép ở nhân tế bào đích Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa ARN dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc ARN sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt-xóa) (Lê Thanh Hòa, 2006) một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử ARN chuỗi đơn mới của virus (Conenello et al., 2007; Murphy and Webster, 1996) Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm).

Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của ARN hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác (Prel et al., 2008; Wagner et al., 2002) Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một subtype virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch.

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA

và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko et al., 2008, Macken et al., 2006; Chen et al., 2008).

2.2.4.2 Hiện tượng tái tổ hợp kháng nguyên

Hiện tượng tái tổ hợp kháng nguyên chỉ có ở virus cúm, và rất ít xảy ra một số virus ARN gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao Hiện tượng này xảy ra khi 2 chủng virus cúm A khác nhau đồng nhiễm vào môt tế bào dẫn đến sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại ARN hệ gen, tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Hilleman, 2002; Macken et al., 2006; Chen et al., 2006).

Tái tổ hợp gen đã dẫn đến sự thay đổi trong hệ gen virus mã hóa cho HA và NA đã xảy ra đối với virus H5N1 phân lập từ gà và gà tây tại Hồng Kông Ở vịt hoang dã, hiện tượng đồng nhiễm cũng đã được thông báo trên cơ sở kiểm ra tính kháng nguyên và sinh học phân tử 2.2.5 Ðộc lực của virus cúm gia cầm

Virus CGC được phân vào 2 loại là có độc lực thấp (LPAI) hay có độc lực cao (HPAI) Độc lực của virus được xác định dựa trên khả năng gây bệnh khi tiêm qua tĩnh mạch mạch 0,2 ml nước trứng đã gây nhiễm (pha loãng 1/10) cho gà 4-8 tuần tuổi trong phòng thí nghiệm hay bởi sự xuất hiện của các đặc tính về gen liên quan tới virus có độc lực cao Virus được xác định là có độc lực cao khi gây chết 6-8 con (trong 10 gà gây nhiễm) hay có chỉ số IVPI ≥ 1,2 và các virus cúm độc lực thấp thuộc subtype H5 và H7 có trình tự chuỗi peptid nối HA giống với trình tự ở các virus CGC độc lực cao (OIE, 2015) Cho đến nay, toàn bộ các chủng virus độc lực cao trong tự nhiên đều thuộc subtype H5 hay H7.

Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã

và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7 và H1, H2 và H3) có thể gây nên bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người có lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của chúng (Subbarao and Joseph, 2007; Xu et al., 1999) Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc subtype H5 và H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột hamster, chồn đất (Horimoto and Kawaoka, 1994; De Wit, 2008).

Sau bị khi nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ngoài tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A (Wanasawaeng et al., 2009).

Trên cơ sở tỷ lệ chết, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, virus CGC được chia thành 4 loại: độc lực cao, độc lực trung bình, độc lực yến và không có độc lực:

Nhóm độc lực cao: Do virus H5 và H7 độc lực cao gây ra, thường xảy ra

ở gà, thủy cầm Biểu hiện bệnh nặng, tỷ lệ chết cao, tác động vào hầu hết các khí quan trong cơ thể bao gồm cả hệ thần kinh và hệ tuần hoàn Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%.

Nhóm độc lực trung bình: Do virus CGC LPAI đồng nhiễm với một tác nhân gây bệnh kế phát khác Tỷ lệ chết có thể thay đổi từ 5-97% với tỷ lệ chết cao ở gia cầm nhỏ, gà đang đẻ trứng hay gia cầm đang bị stress Bệnh tích thường xuất hiện ở đường hô hấp, cơ quan sinh sản, thận, lách.

Nhóm độc lực thấp: Do virus CGC LPAI với biểu hiện tỷ lệ chết thấp và triệu chứng nhẹ ở đường hô hấp hay giảm sản lượng trứng Tỷ lệ chết thường thấp hơn 5%.

Nhóm không có độc lực: Do virus CGC LPAI gây ra, nhưng gia cầm không biểu hiện triệu chứng lâm sàng hay gia tăng tỷ lệ chết Thường xảy ra ở các loài chim hoang dã.

2.2.6 Sự xuất hiện và lưu hành các nhánh virus A/H5N1, A/H5N6 tại Việt Nam

Một số công trình nghiên cứu về nguồn gốc của virus cúm A/H5N1 cho thấy liên tục có sự xuất hiện các biến chủng (clade) mới của virus CGC tại Việt Nam (bảng 2.1,hình 2.3) Các nghiên cứu cho thấy, tại Việt Nam có nhiều chủng virus cúm đã lưu hành Các nhánh 0, 1, 2.3.2, 2.3.4,

3, 5, 8 đã được phân lập ở Việt Nam Một số nhánh chỉ tồn tại trong thời gian ngắn: nhánh 3 (2001), nhánh 5 (2002-2003), nhánh 8 (2005), nhánh 0 (2005) (Pfeiffer et al., 2011) Sự xuất hiện các biến chủng mới theo thời gian làm cho tình hình dịch bệnh trở nên phức tạp, làm giảm, thậm chí

vô hiệu hóa hiệu quả của các chiến dịch tiêm phòng.

Virus cúm A/H5N1 có đặc tính là biến chủng rất nhanh và đến nay đã có nhiều biến chủng A/H5N1 đã được phát hiện và phân lập ở nhiều nước khác nhau từ châu Á sang châu Âu Đặc biệt, Việt Nam chúng ta đã cũng đã phát hiện được nhiều chủng virus A/H5N1 khác nhau được phân loại vào các nhánh khác nhau như: 1, 3, 2.3.4, 2.3.2.1…(Cục Thú y, 2012) Bên cạnh đó,

cũng từ năm 2014 đến nay, Việt Nam xuất hiện subtype A/H5N6 của virus cúm type A, gây nên các ổ dịch ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung Virus có nguồn gốc gien HA thuộc về nhánh 2.3.4.4 là phân nhánh của nhánh 2.3.4 đã từng lưu hành trong các năm 2008 – 2012 và gây ra những thiệt hại lơn cho ngành chăn nuôi gia cẩm ở nước ta.

Tất cả các virus cúm subtype A/H5N1 đều thuộc nhánh 2.3.2.1c và chủ yếu lưu hành ở các tỉnh phía nam Tuy nhiên chúng vẫn xuất hiện rải rác ở các tỉnh phía Bắc và Miền Trung Các virus A/H5N6 thuộc về 2 nhánh là 2.3.4.4a (dòng Trung Quốc) và 2.3.4.4b (dòng Lào) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh Phía Bắc và Miền Trung Đặc biệt, nhánh 2.3.4.4b xuất hiện nhiều hơn trong năm

2015 và đầu năm 2016 Các tỉnh phía Nam chưa phát hiện được virus A/H5N6

từ mẫu ổ dịch Và đặc biệt các chủng virus cúm A/H5 được phân lập trong nghiên cứu này cũng thuộc 2 phân nhánh là 2.3.4.4b và 2.3.2.1c.

Kể từ năm 2008, nhiều chủng virus cúm HPAI/H5 với subtype NA không phải N1 như A/H5N2, A/H5N5, A/H5N6, A/H5N8 đã xuất hiện ở Trung Quốc

cũng đã được phát hiện ở nhiều vùng lãnh thổ khác ngoài Trung Quốc như Lào, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu âu, Mỹ, Canada (Lee Kang et al., 2014) Các báo cáo phân tích gia hệ gen HA của những virus HPAI A/H5Nx cũng cho thấy chúng thuộc về nhánh 2.3.4 nhưng không nằm trong các phân nhánh 2.3.4.1, 2.3.4.2 và 2.3.4.3 mà tạo thành những nhánh virus mới trong nhánh

2.3.4 Theo tiêu chí định nghĩa clade của Nhóm Nghiên cứu Tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO (Group 2008), phần lớn những virus cúm HPAI H5Nx phát hiện trong năm 2013-2014 đều được các tác giả nghiên cứu phân loại vào phân nhánh 2.3.4.6 Ngày 12/01/2015, Tổ chức y tế thế giới đã khuyến cáo sử dụng phân nhánh 2.3.4.4 gọi thay cho phân nhánh 2.3.4.6 sau khi nhóm nghiên cứu tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO tiến hành phân tích tất cả những trình tự gen H5 gần đây (WHO 2015).

Virus cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2001 tại các chợ buôn bán gia cầm sống tại Hà Nội (nhánh 0) nhưng chỉ thực sự gây ra dịch bệnh vào cuối năm 2003 (Nguyễn Tiến Dũng và cs., 2004; Trương Văn Dung và cs., 2004) Một số công trình nghiên cứu về nguồn gốc của virus cúm A/H5N1 trong thời gian qua cho thấy liên tục có sự xuất hiện các biến chủng (clade) mới của virus cúm gia cầm tại Việt Nam Từ khi xuất hiện lần đầu

tiên tại Việt Nam năm 2003 cho đến năm 2005, bệnh CGC ở tất cả các tỉnh thành trên cả nước được gây ra chủ yếu do biến chủng virus nhánh 1 (Wan Nguyen và cs., 2008), bên cạnh đó nhánh 2.3.2 cũng được phát hiện năm

2005 Năm 2006, tình hình dịch CGC tạm lắng do các biện pháp làm giảm nguồn bệnh được áp dụng như cấm ấp nở thủy cầm (loài mang trùng virus CGC) và tiêm phòng vắc xin trên phạm vi cả nước cho gia cầm bằng vắc xin Re-1 (nhánh 0) Từ năm 2007 đến giữa năm 2010, có sự khác biệt địa lý

về lưu hành của các biến chủng virus CGC, các nhánh 2.3.4 dòng Phúc Kiến (sau đó phân chia thành các phân nhánh 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3) đã chiếm ưu thế ở các tỉnh phía Bắc, trong khi đó, các nhánh 1 và phân nhánh 1.1 (tiến hóa từ nhánh 1) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam và sau đó tiếp tục tiến hóa thành các nhánh 1.1.1 và 1.1.2 (Nguyen và cs., 2008) Trong thời gian này, vắc xin Re-1 và Re-5 (nhánh 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc

đã được sử dụng, đồng thời một vắc xin trong nước dùng chủng NIBRG-14 (nhánh 1) được thử nghiệm Năm 2008, nhánh 7 được phát hiện trên gia cầm nhập lậu ở Lạng Sơn và một số chợ ở Hà Nội Năm 2010-2011, nhiều biến chủng nhánh mới đã nổi lên, nhánh 2.3.2.1 (Xuất hiện cuối 2009) trở nên thịnh hành vào cuối năm 2010 và tiến hóa thành các nhánh 2.3.2.1a,b (Nguyen và cs., 2012) lưu hành ở các tỉnh phía Bắc, các nhánh 1.1.1 và 1.1.2 tiếp tục lưu hành ở các tỉnh phía Nam Giữa năm 2012 nhánh 2.3.2.1c xuất hiện ở miền Bắc, sau đó nhanh chóng lây lan vào miền Trung và miền Nam Việt Nam, các nhánh 2.3.2.1a và b dần biến mất Năm 2013, chỉ còn nhánh 2.3.2.1c lưu hành trên cả nước và nhánh 1.1.2 vẫn khu trú ở các tỉnh phía Nam Đầu năm 2014, các nhánh 2.3.2.1c và 1.1.2 vẫn là những nhánh chính gây bệnh CGC ở Việt Nam, tuy nhiên sau tháng 2 năm 2014, nhánh 1.1.2 không còn được phát hiện Từ tháng 4 năm 2014, các dịch cúm thuộc nhánh 2.3.4.4 bắt đầu xuất hiện ở miền Bắc (Lạng Sơn) vào tháng 4 năm

2014, sau đó xuất hiện ở một số tỉnh miền Bắc như Lào Cai (tháng 8/2014), Phú Thọ (9/2014), Lạng Sơn (11/2014) Virus đã nhanh chóng phát hiện ở một số tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh (6/2014), Quảng Ngãi (8/2014), Quảng Trị (8/2014) (Thọ và cs., 2016) Và năm 2015-2016, virus cúm A/H5N6 thuộc phân nhánh 2.3.4.4a và 2.3.4.4b vẫn tiếp tục được phát hiện ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung, virus thuộc nhánh 2.3.2.1c vẫn được phân lập và phát hiện ở các tỉnh phía Nam (Cục Thú y, 2016) Bảng 2.1.

Hình 2.3 Sự phân bố không gian của các nhánh virus cúm gia

cầm từ tháng 7/2016 tới tháng 6/2017

Nguồn: Cục thú y (2017)

Bảng 2.1 Sự phân bố theo thời gian của virus cúm gia cầm ở Việt Nam

Năm Nhánh 1, 5 (Wan XF et

2003 al 2008) Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF

2004 et al 2008) Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF

2005 et al 2008) 2006

Nhánh 2.3.4 (Nguyen T et al.

2007 2012)

Nhánh

2008 (Nguyen T et al 2012) Nhánh

2.3.4.2 (Nguyen T et al.

2009 2012)

Nhánh 1.1 (Creanga A et al.

2010 2013) Nhánh

A et al 2013), 2.3.2.1b, 1.1.2 (Nguyen TD et al.

2011 2014) Nhánh

A et al 2013), 2.3.2.1b, 2.3.2.1c (Nguyen TD et

2012 al 2014)

Nhánh 2.3.2.1b,

2013 (Nguyen TD et al 2014)

2014 Nhánh 2.3.4.4 2015- Nhánh 2.3.4.4 2016

Nhánh

2017 2.3.2.1c

PHẦN 3 NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU -

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 ÐỊA ÐIỂM NGHIÊN CỨU

Địa điểm lấy mẫu: Các chợ buôn bán gia cầm sống tại tỉnh Quảng Nam.

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Chẩn đoán Thú y

Trung ương 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ 6 tháng cuối năm 2016 đến 6 tháng đầu năm 2017 (12 tháng) 3.3 ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Mẫu dịch ngoáy hầu họng (swab) của gà và vịt lấy tại các chợ buôn bán gia cầm ở tỉnh Quảng Nam: Mẫu được lấy trong 6 tháng của năm 2016 và 6 tháng của đầu năm 2017 Mỗi tháng lấy 90 mẫu swab hầu họng (30 gà, 60 vịt) tại 3 chợ (thuộc 3 huyện).

Phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm).

Tế bào xơ phôi gà (tế bào xơ phôi được làm từ trứng gà có phôi 8-10 ngày tuổi).

Kít tách chiết ARN: bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat #

74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep.

Mastermix: Sử dụng kít rRT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen)

Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm

A/H5N1, H5N6 Primer và kít để giải trình tự gen

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1 Xác định được tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1,

A/H5N6 Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A trên gà, vịt.

Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5 trên gà, vịt.

Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà, vịt Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo tháng.

Xác định nhánh của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được

thông qua giải trình tự gen HA.

3.4.2 Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm

A/H5N1, A/H5N6

Tính thích ứng trên phôi gà.

Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà.

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6

3.5.1.1 Phương pháp tách chiết ARN

Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #

74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:

- Nhỏ 200 l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 l Qiagen buffer RLT có 1 % -ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.

- Thêm 500 l etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.

tốc độ

10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Nhỏ 500 l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở

10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.