Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp sắc kí hấp phụ và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp hiện đại và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài.. Với nguồn nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, hàm lượ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Đà Nẵng – Năm 2019

kháng vi khuẩn E.coli (MIC = 50 mg/ml), vi khuẩn Salmonella (MIC = 50 mg/ml) gấp

4 lần so với cao thô và vi khuẩn Vibrio (MIC = 10 mg/ml) cao gấp 2,5 lần so với cao

thô ban đầu (MIC = 25 mg/ml)

Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Mỹ Phương Số thẻ sinh viên: 107140143

Lớp: 14H2B Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ thực phẩm

1 Tên đề tài đồ án:

Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp hiện đại và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

5 Các bản vẽ, đồ thị ( ghi rõ các loại và kích thước bản vẽ ): Không

6 Họ tên người hướng dẫn: Nguyễn Thị Trúc Loan

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 29/12/2019

8 Ngày hoàn thành đồ án: 30/05/2019

Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2019

PGS.TS Đặng Minh Nhật TS Nguyễn Thị Trúc Loan

LỜI CẢM ƠN

Trải qua 5 năm học tại Trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng, em đã được tích lũy những tri thức, kinh nghiệm và những phương pháp nghiên cứu sẽ là những hành trang hỗ trợ cho em trong tương lai Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến những thầy cô đã và đang công tác tại Trường Đại học Bách khoa, các thầy cô trong Khoa Hóa, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm và đặc biệt là TS Nguyễn Thị Trúc Loan đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho bản thân em

Em xin chân thành cảm ơn cô TS Nguyễn Thị Trúc Loan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Nếu không có những lời khuyên

cô cho em trong những giai đoạn khó khăn thì em khó có thể hoàn thành tốt đề tài này Trong thời gian thực hiện đề tài cô đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, luôn định hướng và góp ý sửa chữa về phương pháp, nội dung cũng như các vấn đề liên quan đến đề tài để em hoàn thành một các tốt nhất Đồng thời, em cũng xin gởi lời cảm ơn đến Th.S Đặng Thanh Long (Cán bộ Viện Sinh học - Đại học Huế) đã tạo điều kiện về phòng thí nghiệm, trang thiết bị để em có thể hoàn thành đề tài một cách thuận lợi

Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn gia đình đã hỗ trợ tài chính cũng như động viên, giúp đỡ và là nguồn động lực giúp đỡ em trong những thời điểm khó khăn trong học tập để hoàn thành tốt đề tài được giao Và sự giúp đỡ, hỗ trợ của các bạn trong lớp 14H2B, các bạn thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm trong quãng thời gian học tập và làm thí nghiệm

Bước đầu vào làm nghiên cứu khoa học, không tránh khỏi những bỡ ngỡ và thiếu sót, em rất mong nhận được thông cảm và đóng góp ý kiến quý báu của thầy cô

để đề tài em được hoàn thiện hơn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành giáo viên phản biện và các thầy cô trong Hội đồng Bảo vệ đã dành thời gian để xem xét đánh giá và góp ý Đồ án của em

Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả tính toán trong đồ án tốt nghiệp này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ bởi một học vị nào Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và được phép công bố

Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tìm hiểu về cây xoài và mangiferin 3

1.1.1 Tổng quan về cây xoài 3

1.1.2 Thành phần hóa học và cấu trúc của mangiferin 3

1.1.3 Tính chất của mangiferin 3

1.1.4 Tác dụng dược lí của mangiferin 4

1.2 Phương pháp tinh sạch hiện đại bằng sắc kí hấp phụ 5

1.2.1 Kỹ thuật sắc kí 5

1.2.2 Cơ sở lý thuyết hấp phụ 6

1.2.3 Hạt nhựa macroporous 8

1.2.4 Sắc kí cột hở cổ điển 12

1.2.5 Sắc kí lớp mỏng 12

1.3 Tổng quan về kháng oxy hóa và kháng khuẩn của mangiferin 14

1.3.1 Kháng oxy hóa 14

1.3.2 Kháng khuẩn 15

1.4 Tình hình nghiên cứu về tinh sạch và hoạt tính sinh học của mangiferin thế giới và trong nước 16

1.4.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu 20

2.2.1 Hóa chất sử dụng 20

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm và định tính, định lượng mangiferin trong các cao chiết từ lá xoài 21

2.3.2 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sắc kí cột 22

2.3.3 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp chiết mangiferin bằng các dung môi nước và ethanol 600 22

2.4.2 Định tính và định lượng mangiferin trong cao lá xoài 23

2.4.3 Nghiên cứu tinh sạch mangiferin bằng phương pháp hiện đại sắc kí cột 26

2.4.4 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn 30

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Đường chuẩn của dung dịch mangiferin chuẩn 33

3.1.1 Bước sóng hấp thu cực đại của dung dịch mangiferin chuẩn 33

3.1.2 Bước sóng hấp thu cực đại của dịch chiết lá xoài 33

3.1.3 Đường chuẩn mangiferin 34

3.1.4 Kết quả so sánh hàm lượng mangiferin trong các cao chiết khác nhau 34

3.2 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp hiện đại sắc kí cột 35

3.2.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 35

3.2.2 Kết quả xác định thể tích dịch nạp cột 35

3.2.3 Kết quả khảo sát quá trình giải hấp phụ 36

3.3 Kết quả định danh và xác định độ tinh khiết của mangiferin sau tinh sạch 40

3.3.1 Kết quả định tính mangiferin 40

3.3.2 Kết quả định lượng mangiferin 41

3.4 Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao siêu âm – methanol và mangiferin sau

tinh sạch 42

3.4.1 Kết quả phương trình tương quan tuyến tính giữa % hoạt tính bắt gốc tự do với các nồng độ của cao thô và mangiferin tinh sạch 42

3.4.2 Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao thô và mangiferin tinh sạch 44

3.5 Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao siêu âm – ethanol và mangiferin tinh sạch 44

3.5.1 Kết quả khả năng kháng khuẩn của cao chiết siêu âm - ethanol 44

3.5.2 Kết quả khả năng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch 45

3.6 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 49

3.7 Đề xuất quy trình công nghệ 49

3.7.1.Quy trình công nghệ 49

3.7.2 Thuyết minh quy trình công nghệ 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 522

PHỤ LỤC 566

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại pha tĩnh và pha động sử dụng trong kĩ thuật sắc kí 5 Bảng 1.2 Phân loại sắc kí theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất 6 Bảng 1.3 Đặc tính vật lí của một số hạt nhựa macroporous 9 Bảng 1.4 Thông số vật lí của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất 10 Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của các cao chiết 35 Bảng 3.2 Dung lượng hấp phụ mangiferin (Qe) và hiệu suất rửa giải hấp phụ (Hghp) 35 Bảng 3.3 Nồng độ mangiferin và khối lượng cắn rửa giải sau mỗi thể tích nước 37 Bảng 3.4 Hàm lượng mangiferin sau khi tinh sạch 42 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa IC50 của cao thô, mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn và vitamin C 44 Bảng 3.6 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao siêu âm – ethanol đối với vi khuẩn

E.coli, Salmonella, Vibrio (mm) 44

Bảng 3.7 Đường kính vòng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn,

kháng sinh ampicillin đối với vi khuẩn E.coli (mm) 46

Bảng 3.8 Đường kính vòng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn,

kháng sinh ampicillin đối với vi khuẩn Salmonella (mm) 47

Bảng 3.9 Đường kính vòng kháng khuẩn của mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn,

kháng sinh ampicillin đối với vi khuẩn Vibrio (mm) 48

Bảng 3.10 Tác động gây độc tế bào ung thư của mangiferin và ellipticine 49

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc của mangiferin 3

Hình 1.2 Than hoạt tính và silicagel 7

Hình 1.3 Cấu tạo của zeolit 8

Hình 1.4 Hạt nhựa macroporous 8

Hình 1.5 Hình thái và cách phân bố chuỗi polymer trong hạt nhựa macroporous 9

Hình 1.6 Bình sắc kí lớp mỏng 12

Hình 1.7 Sự dịch chuyển của các hợp chất trên sắc kí lớp mỏng 13

Hình 2.1 Bột lá xoài 19

Hình 2.2 Hạt nhựa macroporous D101 19

Hình 2.3 Mangiferin chuẩn 19

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21

Hình 2.5 Phương pháp Soxhlet với dung môi ethanol và nước 23

Hình 2.6 Phương pháp siêu âm bể với dung môi ethanol và nước 23

Hình 2.7 Bộ cô quay thu cao thô 26

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát λmax của dung dịch chuẩn mangiferin 33

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát λmax của dịch chiết lá xoài 33

Hình 3.3 Đường chuẩn của dung dịch mangiferin chuẩn xây dựng theo phương pháp đo quang 34

Hình 3.4 Đồ thị sự ảnh hưởng của thể tích dịch nạp cột đến tỉ lệ mangiferin không được hấp phụ 36

Hình 3.5 Đồ thị sự ảnh hưởng của thể tích nước khác nhau đến hàm lượng mangiferin trong cắn 37

Hình 3.6 Đồ thị sự ảnh hưởng của ethanol có nồng độ khác nhau đến tỉ lệ giải 38

hấp phụ mangiferin 38

Hình 3.7 Sắc kí đồ của dung dịch giải hấp phụ ứng với ethanol có nồng độ khác nhau 38

Hình 3.8 Dung dịch giải hấp phụ ứng với ethanol có nồng độ khác nhau 39

Hình 3.9 Đồ thị sự ảnh hưởng của thể tích rửa giải đến nồng độ mangiferin trong dịch giải hấp phụ 40

Hình 3.10 Phản ứng màu đặc trưng của mangiferin 40

Hình 3.11 Sắc kí bản mỏng với 2 thuốc thử hiện màu của mangiferin tinh sạch bằng phương pháp sắc kí hấp phụ 41

Hình 3.12 Sản phẩm mangiferin trước và sau khi tinh sạch 42

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự do của DPPH của cao chiết 43

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự do của DPPH của mangiferin tinh

sạch hiện đại, mangiferin chuẩn và vitamin C 43

Hình 3.15 Đường kính kháng khuẩn của cao siêu âm - ethanol tại các nồng độ 45

Hình 3.16 Đường kính vòng kháng vi khuẩn E.coli của mangiferin tinh sạch, 46

mangiferin chuẩn và đối chứng dương tại các nồng độ 46

Hình 3.17 Đường kính vòng kháng vi khuẩn Salmonella của mangiferrin tinh sạch, mangiferin chuẩn và đối chứng dương tại các nồng độ 47

Hình 3.18 Đường kính vòng kháng vi khuẩn Vibrio của mangiferrin tinh sạch, đối chứng dương và mangiferin chuẩn tại các nồng độ 48

Hình 3.19 Quy trình công nghệ tinh sạch dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài 49

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

v/w - Dung môi/ nguyên liệu

HPLC - High performance liquid chromatography UV-VIS - Ultraviolet – visible

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hiện nay, tổ chức y tế thế giới (WTO) dự báo rằng tỷ lệ người bị bệnh tiểu đường toàn cầu có thể tăng 54% trong vòng 20 năm từ 2010 đến 2030 và Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường hàng đầu thế giới, chiếm khoảng 5,4% dân số Nhưng với sự kết hợp dùng thuốc, chế độ ăn uống và sinh hoạt hợp lí sẽ

có khả năng điều trị căn bệnh Đặc biệt, ở nước ta các bệnh nhân có xu hướng sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thay vì sử dụng các loại thuốc tổng hợp do chúng có độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có

Xoài là một loại cây ăn quả, một loại thuốc quý được trồng phổ biến ở Việt Nam, mangiferin chiết xuất từ lá xoài có nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người, đặc biệt trong việc điều trị phòng chống bệnh tiểu đường Mangiferin có thể được chiết bằng các phương pháp khác nhau nhưng trong cao chiết tổng thu được còn lẫn rất nhiều tạp chất Với nguồn nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, hàm lượng mangiferin có trong lá xoài đặc biệt cao hơn so với các loài cây khác, tinh sạch và nghiên cứu hoạt tính sinh học của cao chiết mangiferin từ lá xoài là cần thiết nhằm thu được mangiferin có độ tinh khiết cao

Từ những thực tế đã nêu ra, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Trúc Loan,

đề tài “Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp hiện đại và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài” được đề xuất thực hiện nhằm khảo sát

quy trình phù hợp để tinh sạch mangiferin và đánh giá hoạt tính sinh học của mangiferin thu được sau khi tinh sạch

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng quan tài liệu về phương pháp tinh sạch hiện đại bằng sắc kí hấp

phụ, cơ chế hấp phụ bằng nhựa macroporous D101 cũng như hoạt tính sinh học của cao chiết mangiferin

- So sánh hàm lượng mangiferin có trong các cao chiết từ nước, ethanol 600 bằng phương pháp chiết Soxhlet và chiết có hỗ trợ siêu âm bể

- Khảo sát các điều kiện tinh sạch cao chiết mangiferin bằng phương pháp hấp phụ nhựa D101

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa của mangiferin tinh sạch, so sánh với cao thô và mangiferin chuẩn

3 Đối tượng nghiên cứu

- Lá xoài keo (Mangifera Indica L.) tại vườn cây xã Hương Chữ, Hương Trà, Thừa

Thiên Huế

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp xử lý số liệu như excel,

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tìm hiểu về cây xoài và mangiferin

1.1.1 Tổng quan về cây xoài

Cây xoài có tên hoa học Mangifera Indica L., thuộc họ Đào lộn hột

Anacardiaceae có nguồn gốc từ Ấn Độ hiện được trồng ở hơn 90 nước trên thế giới Hầu hết các bộ phận của cây xoài đều có thể được sử dụng để trị bệnh [1]

Sản lượng xoài toàn cầu đã tăng gấp hai chỉ trong vòng 10 năm từ 2001 đến

2010 Ở Việt Nam, xoài được trồng nhiều nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long, một số khu vực miền Trung – Tây Nguyên và các tỉnh Tây Bắc Năm 2013, sản lượng xoài cả nước vào khoảng 780 000 tấn (đứng thứ 13 trên thế giới) [42]

Hàm lượng mangiferin trong thực vật có thể kể đến như lá trầm hương 17,16 mg/g [43], cây quéo khoảng 40 – 50 mg/g nhưng nhiều nhất trong lá xoài với hàm lượng mangiferin khoảng 58,46 mg/g [20] cao hơn hẳn các nguyên liệu khác Do đó

có thể chiết tách mangiferin từ lá hoặc thân cây xoài, tuy nhiên để nâng cao giá trị kinh tế, cũng như tận dụng được nguồn nghiên liệu lá bị cắt tỉa ở mỗi mùa vụ nên sử dụng lá xoài để chiết tách

1.1.2 Thành phần hóa học và cấu trúc của mangiferin

Mangiferin là một C-glucoside xanthan có công thức phân tử là C19H18O11

(M = 445,35) được Wiechowski (1923) phân lập từ vỏ cây Mangifera indica L và

được Iseda (1957) xây dựng cấu trúc Sau đó Ramanahan và Sechadi (1960) đã nghiên cứu điều chỉnh lại cấu trúc Cấu trúc được thừa nhận hiện nay là một glycoside có phần aglycon có bộ khung xanthon với 4 nhóm hydroxyl và một phân tử glucose đính vào C số 2 [21]

Hình 1.1 Cấu trúc của mangiferin [44]

1.1.3 Tính chất của mangiferin

Mangiferin là những tinh thể hình phiến dài hoặc là ở dạng bột, màu vàng nhạt, mịn, vị hơi đắng, cay, không mùi hoặc thơm nhẹ Là hợp chất có cấu tạo bền vững hầu như không tan trong nước ở nhiệt độ thường, ít tan trong ethanol và chloroform,

không tan trong các dung môi không phân cực Trong tự nhiên nó tồn tại ở dạng liên kết với các đường, tan nhiều trong nước nóng, hỗn hợp ethanol - H2O, aceton - H2O, dioxan – nước nóng, hòa tan cho dung dịch trong suốt màu vàng sáng [22]

Mangiferin có nhiệt độ nóng chảy ở 269°C - 270°C (với 5 phân tử H2O), làm tăng màu vàng với dung dịch kiềm loãng, cho màu cam với phản ứng Cyanidin, cho màu xanh đen với dung dịch FeCl3, cho màu vàng xanh với HCl đậm đặc - FeCl3 [22]

Dung dịch 0,001% MeOH cho các đỉnh hấp thụ cực đại trên máy UV tại các bước sóng (241, 258, 316, 365nm) Có thể định tính được bằng bản sắc kí bản mỏng: với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H20 (4:1:2,2) cho Rf = 0,77 hay bằng sắc kí lỏng cao áp HPLC [22]

1.1.4 Tác dụng dược lí của mangiferin

1.1.4.1 Tác dụng diệt virus Herpes

Cấy vào phôi nguyên bào Tripsin virus Herpes ở những nồng độ khác nhau (1,0 và 100 TCD50/ml) để xác định được liều diệt virus của mangiferin từ 20÷50 g/ml

Hoạt chất mangiferin và isomangiferin với nồng độ 25-250 g/ml, có tác

dụng ức chế sự phát triển của virus herpes 69,5% [23]

1.1.4.2 Tác dụng trực tiếp diệt Sitommegala virus

Thử nghiệm tác dụng của mangiferin lên Sitommegala virus được cấy ở tế bào người, ta thấy rằng mangiferin với liều 100µg/ml đã hoàn toàn phá hủy sự tái tạo đối với lượng 10.000 TCD50 Sitomegala virus [23]

1.1.4.3 Tác dụng chống đái tháo đường

Ảnh hưởng của dịch chiết từ lá xoài đã được nghiên cứu và kết quả cho thấy

bột lá xoài có thể giúp cho việc điều trị bệnh tiểu đường Chiết xuất của lá xoài có thể

làm hạ đường huyết ở động vật bị tiểu đường thông thường và do streptozotocin (chất kháng sinh có tác dụng phá huỷ tế bào của tuyết tuỵ gây mô hình đái tháo đường loại

1 do thiếu insulin) gây ra với liều lượng 250 mg/kg [23]

1.1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa

Các cơ chế chống oxy hóa có thể có của mangiferin được chuyên biệt với khả năng phức hợp sắt trong ty thể (Andreu và cộng sự, 2005) Các nhóm hydroxyl tự do

và nhóm catechol là rất cần thiết cho hoạt động chống oxy hóa của nó Bên trong xơ

vỡ động mạch với thụ thể LDL cholesterol, nó ngăn ngừa quá trình oxy hóa tự phát NADPH và ức chế các hoạt động oxy hóa trong ty thể mitochondria gan và lympho bào lách (Pardo-Andreu và cộng sự, 2008) Trong một mô hình sự suy giảm trí nhớ cholinergic do scopolamine gây ra ở chuột, mangiferin ức chế acetylcholinesterase cải thiện sự thiếu hụt trí nhớ (Jung và các cộng sự, 2009) [21]

1.1.4.5 Tác dụng gây mê và chống dị ứng

Dịch chiết lá xoài có thành phần vỏ gốc là vimang và mangiferin đã được nghiên cứu ở chuột nhiễm giun tròn Nghiên cứu này được tiến hành để tìm hiểu C- glucosylxanthone phân lập từ chiết xuất của lá xoài có đặc tính chống dị ứng của vimang và mangiferin Các kết quả cho biết đặc tính chống dị ứng của vimang cũng như gợi ý rằng chiết suất tự nhiên này có thể sử dụng trong việc điều trị các bệnh về dị ứng Mangiferin là hợp chất chính của vimang [21]

1.2 Phương pháp tinh sạch hiện đại bằng sắc kí hấp phụ

- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc lỏng Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó nhờ vào tính chất hấp thụ của nó [3]

+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silicagel, nó được nén nạp vào cột (sắc kí cột) hoặc tráng thành một lớp mỏng (sắc kí lớp mỏng)

+ Pha tĩnh là chất lỏng: một chất lỏng được tẩm lên một bề mặt chất mang rắn (sắc kí giấy, sắc kí khí) [3]

- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: áp dụng trong kỹ thuật sắc kí khí

+ Pha động là chất lỏng: được dùng trong kỹ thuật sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột và được gọi là dung môi rửa giải

Bảng 1.1 Các loại pha tĩnh và pha động sử dụng trong kĩ thuật sắc kí [3]

Pha động Pha tĩnh Tên gọi kĩ thuật sắc kí

Bảng 1.2 Phân loại sắc kí theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất [3]

Chất rắn làm pha tĩnh: hạt hình cầu, trên

bề mặt có nhiều lỗ rỗng

1.2.2 Cơ sở lý thuyết hấp phụ

Hấp phụ là sự tập hợp vật chất lên trên bề mặt phân chia pha (như rắn – khí, rắn – lỏng, lỏng – khí) Chất mà ở trên bề mặt của nó có xảy ra sự hấp phụ được gọi là chất hấp phụ, còn chất bị thu hút lên trên bề mặt chất hấp phụ được gọi là chất bị hấp phụ Như vậy, nồng độ chất bị hấp phụ trên bề mặt luôn lớn hơn trong pha thể tích [4]

Quá trình hấp phụ phụ thuộc vào [4]:

- Bản chất của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ

- Phụ thuộc vào nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng thì hấp phụ giảm do hấp phụ là quá trình tỏa nhiệt

- Bề mặt hấp phụ: bề mặt càng lớn thì hấp phụ càng tốt

- Hấp phụ hóa học: các phân tử của chất bị hấp phụ liên kết với chất hấp phụ bề mặt bởi các lực hóa học bền vững, tạo thành những hợp chất hóa học bề mặt Hấp phụ hóa học là bất thuận nghịch và có tính đặc thù riêng, hấp phụ chỉ diễn ra khi chất bị hấp phụ có khả năng tạo liên kết hóa học với chất hấp phụ [24]

Hiện nay các nhựa trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong thực tế, chúng là các hợp chất cao phân tử được đính với các nhóm cacnonxyl hay các nhóm sulfo Các nhựa trao đổi ion sau khi sử dụng có thể hoàn nguyên trở lại bằng cách xử lí với axit

và bazo, các ionit công nghiệp có độ bền lí hóa rất cao [24]

1.2.2.2 Các chất hấp phụ

Một trong những đặc điểm quan trọng của chất hấp phụ đó là độ xốp Độ xốp thể tích biểu diễn bằng tỉ số giữa tổng thể tích lỗ hổng với tổng thể tích hệ phân tán (khối chất hấp phụ) Khái niệm này được sử dụng rộng rãi và dùng để đánh giá đặc

tính của chất hấp phụ, có thể phân các chất hấp phụ thành hai loại:

- Các chất hấp phụ không xốp: kết cấu chặt nhưng vẫn hình thành các lỗ hỏng chính là các khe mà hạt nguyên tử sắp xếp sát lại với nhau Các chất tiêu biểu là muội graphit, muội trắng (SiO2 có độ phân giải cao) [4]

- Các chất hấp phụ xốp: cấu trúc bao gồm các hạt với lỗ xốp bên trong hay mạng không gian chứa lỗ hổng nhỏ Ví dụ tiêu biểu là silicagell, almogen, alumosilicat, than hoạt tính, thủy tinh xốp, zeolit tự nhiên và tổng hợp… [4] (hình 1.2, hình 1.3)

Hình 1.2 Than hoạt tính và silicagel [45]

Hình 1.3 Cấu tạo của zeolit [4]

1.2.3 Hạt nhựa macroporous

1.2.3.1 Định nghĩa và phân loại

Nhựa macroporous hay nhựa hấp phụ macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng có cấu trúc xốp với các lỗ xốp lớn (đường kính lỗ xốp >50Å), có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt lớn Có thể cho phân tử lớn đi qua, hấp phụ nhờ lực liên kết hydro hoặc tạo phức [25] (hình 1.4)

Hình 1.4 Hạt nhựa macroporous [46]

Nhựa macroporous có cấu trúc không đồng nhất bao gồm vùng gel chứa chuỗi polymer dày đặc có liên kết chéo và một lượng nhỏ dung môi, do đó hạt nhựa có cấu trúc lỗ xốp (hình 1.5) Ngày nay, các loại nhựa thường được sản xuất từ các polymer gốc styrendivinylbenzen hoặc arylic Trong hỗn hợp monomer được thêm một lượng nhất định một dung môi trơ, không polymer hóa như các hợp chất toluene, n-heptan, iso-octan Trong quá trình trùng hợp, các phân tử dung môi xâm nhập vào không gian cấu trúc của hỗn hợp monomer và cuối cùng được loại bỏ bằng cách bay hơi khi hoàn thành quá trình trùng hợp, làm tăng các lỗ xốp trong suốt quá trình tạo hạt Hàm lượng cao của divinylbenzen tạo ra một cấu trúc tương đối cứng nhắc và ổn định có thể chịu

được các điều kiện khắc nghiệt như áp suất thẩm thấu cao, quá trình oxy hóa và ứng suất cơ học Tuy nhiên, cấu trúc này cũng làm giảm độ rỗng của hạt [26]

Hình 1.5 Hình thái và cách phân bố chuỗi polymer trong hạt nhựa macroporous [26] Diện tích bề mặt, đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt là ba thông số quan trọng để đánh giá tính chất một loại nhựa hấp phụ macroporous Diện tích bề mặt bên trong của nhựa thường từ 100 đến 1000 m2/g, với đường kính lỗ xốp từ 0,3 đến 1,2

mm Độ phân cực của nhựa có thể thay đổi tùy theo sự lựa chọn monomer sử dụng trong quá trình tổng hợp hoặc bằng cách xử lí hóa học bổ sung sau quá trình tổng hợp Dựa trên mức độ phân cực và các đặc tính vật lí khác, nhựa macroporous có thể chia thành các loại sau (bảng 1.3) [5]

Bảng 1.3 Đặc tính vật lí của một số hạt nhựa macroporous [5]

Độ phân

cực

Loại hạt nhựa

Cấu trúc Kích thước

(mm)

Diện tích mặt (m 2 /g)

Theo IUPAC, hạt nhựa macroporous có các lỗ xốp trong khoảng 50 nm đến 1

μm Tuy nhiên gần đây, do nhận được nhiều sự chú ý nên các vật liệu có kích thước lỗ xốp từ 1 μm đến 100 μm và lớn hơn nữa cũng được sản xuất Có thể gọi đó là các polymer supermacroporous [7]

1.2.3.2 Tổng quan về hạt nhựa macroporpous D101

Nhựa macroporous D101 (hạt nhựa D101) là hạt nhựa được tạo ra bằng phương pháp trương nở tạo hạt SDBV (poly (styrene – divinylbenzen)) Nhựa SDBV được tạo ra bằng phương pháp trùng hợp 2 monome là styrene và divinylbenzen Trong đó divylbenzen là nhân tố tạo nên liên kết ngang [6]

Các thông số vật lí của hạt nhựa D101 được thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Thông số vật lí của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất [6]

Trọng lượng riêng bão hòa 1,00 – 1,07 g/ml

Trọng lượng biểu kiến bão hòa 0,67 – 0,73 g/ml

Phương pháp tinh sạch bằng nhựa macroporous có nhiều ưu điểm như: làm tăng đáng kể nồng độ của các thành phần hoạt chất, độ tinh khiết của sản phẩm tăng, không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, khả năng tái sử dụng lại và ổn định tốt [5]

1.2.3.3 Đặc tính hạt nhựa macroporous

Ba đặc tính quan trọng cho khả năng hấp phụ của các hạt nhựa: tổng diện tích

bề mặt (trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt Diện tích bề mặt trong thường khoảng 100 đến 1000 m2/g, đường kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 Å,

đường kính lỗ xốp gấp khoảng 10-20 lần kích thước phân tử chất tan thì sự phân tách

là tốt Liu et al (2011) cũng đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng, hạt nhựa có đường kính lỗ xốp càng lớn thì độ tinh khiết của ReA càng cao [27]

Độ phân cực thì rải đều từ không phân cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tùy theo monomer sử dụng trong hoặc xử lý sau quá trình polymer hóa Độ phân cực của các loại nhựa có thể thay đổi do việc lựa chọn các monomer sử dụng trong quá trình tổng hợp hoặc xử lý hóa học bổ sung sau trùng hợp Sự hấp phụ của một loại nhựa macroporous phụ thuộc vào cấu trúc hình học của nó và có thể kiểm soát bằng việc thay đổi các thành phần trong hỗn hợp phản ứng trùng hợp Kết quả là các chất hóa học khác nhau trên bề mặt hấp phụ [27]

Đường kính lỗ xốp và diện tích bề mặt được quyết định bởi cấu trúc của hạt nhựa, cấu trúc được kiểm soát dựa vào thành phần các chất hóa học sử dụng trong hỗn hợp đem đi polymer hóa (ngoài các monomer thì để tạo ra các lỗ xốp còn thêm các chất gọi là porogen trộn lẫn với hỗn hợp monomer, không hòa tan được polymer, có khả năng bay hơi ở nhiệt độ nhất định sau khi kết thúc polymer hóa để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polymer) [6]

1.2.3.4 Cơ chế hấp phụ

Việc hấp phụ hoạt chất thiên nhiên lên nhựa macroporous đặc biệt hấp dẫn do các yếu tố như thuận tiện, chi phí vận hành, giảm tiêu thụ dung môi và dư lượng hóa chất thấp trong sản phẩm cuối cùng Tùy thuộc vào bản chất của các monomer tham gia vào phản ứng trùng hợp mà chúng có cơ chế hấp phụ khác nhau Cơ chế hấp phụ của mangiferin và hạt nhựa D101 được cho rằng do sự tạo thành liên kết Van der Waals [28]

Ngoài ra, đối với mangiferin, người ta còn đưa ra một lập luận về sự phù hợp của việc hấp phụ mangiferin lên hạt nhựa D101 như sau: hạt nhựa D101 có đường kính lỗ xốp khoảng 9 – 10 nm, trong khi mangiferin có đường kính khoảng 2 nm Như vậy, do có đường kính lỗ xốp gấp khoảng 4,5 - 5 lần nên hạt nhựa D101 khá thích hợp trong việc hấp phụ mangiferin [29]

Dung môi giải hấp phụ thường sử dụng là ethanol ở các nồng độ khác nhau [29] Như vậy hạt nhựa macroporous D101 là polymer styrene divinylbenzen không phân cực do đó tạo liên kết Van der Waals với mangiferin nên có khả năng hấp phụ mangiferin Ngoài ra giá thành của hạt nhựa D101 thấp hơn 4 – 5 lần so với một số loại nhựa (H103, HPD200A) nên lựa chọn nhựa D101 để tinh sạch mangiferin [7]

1.2.4 Sắc kí cột hở cổ điển

Sắc kí cột hở cổ điện là phương pháp sắc kí cột được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp cô lập hợp chất thiên nhiên với những ưu điểm như: dụng cụ rẻ tiền, thao tác đơn giản, dễ kiếm, có thể triển khai với số lượng mẫu lớn [9]

Sắc kí cột hở cổ điển là loại sắc kí sử dụng ống hình trụ được đặt thẳng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống như buret để định phân trong phòng thí nghiệm Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ, mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh Pha động là dung môi luôn được rót vào đầu cột Nhờ trọng lực dung môi luôn di chuyển từ trên đầu cột xuống dưới đáy cột, xuyên qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột [9]

Nhờ thiết bị thu nhận mẫu tự động có thể hoạt động trong một thời gian dài mà người ta có thể triển khai sắc kĩ cột để tự dộng qua đêm một cách thuận tiện và ít tốn công [9]

Nhựa macroporous được nhồi vào cột phù hợp với điều kiện cần xét Cách pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ trọng lực, tốc độ chảy được điều chỉnh bằng khóa

1.2.5 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng là kỹ thuật sắc kí dựa vào hiện tượng hấp thu pha động là dung môi đi qua pha tĩnh rắn (silicagel, alumina…) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm…

Người ta sử dụng sắc kí lớp mỏng để tìm hiểu đặc điểm hợp chất vừa cô lập, tìm hiểu sơ bộ về tính chất (độ tinh khiết, định lượng, tính phân cực) của mẫu cần khảo sát, chuẩn bị và theo dõi quá trình sắc kí cột [10]

Hình 1.6 Bình sắc kí lớp mỏng [10]

Hình 1.7 Sự dịch chuyển của các hợp chất trên sắc kí lớp mỏng [10]

Sắc kí bản mỏng cũng có thể sử dụng xác định đặc điểm của một hợp chất hay nhiều hợp chất trong một hỗn hợp Dựa vào độ đậm nhạt của vết và giá trị Rf, có thể định lượng một cách tương đối và độ phân cực của các hợp chất trong hỗn hợp Đối với một hợp chất tinh khiết có một vết trên sắc kí lớp mỏng, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi xác định, bởi bản sắc kí trong một lô sản xuất nhất định [10]

Giá trị Rf được tính toán như sau:

𝑅𝑓 = 𝑎𝑏Trong đó:

a: đoạn đường di chuyển của hợp chất,

b: đoạn đường di chuyển của dung môi

Giá trị Rf của một chất < 1 và phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

- Loại bản mỏng silicagel hoặc alumina của hãng nào

- Hoạt độ của bản lúc sử dụng tùy vào thời gian cất giữ

- Độ dày của bản

- Thành phần của dung môi dung ly

- Kỹ thuật ly giải: đi lên hay đi xuống

- Lượng mẫu chấm lên bản mỏng

Ưu điểm của sắc kí lớp mỏng:

- Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ để phân tích

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích

- Tất cả các hợp chất trong mẫu có thể định vị trên tấm sắc kí [47]

Như vậy sử dụng phương pháp sắc kí bản mỏng để định tính mangiferin có mặt trong các dịch chiết và so sánh mangiferin sau khi tinh sạch với mangiferin chuẩn Từ

đó đưa ra nhận xét về độ tinh khiết của mangiferin

1.3 Tổng quan về kháng oxy hóa và kháng khuẩn của mangiferin

Gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn biến sau:

- Oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí

- Tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng

- Gốc tự do oxy hóa làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do nguy hiểm như superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy, nguy hiểm nhất là hydroxyl nó là gốc rất phản ứng

và gây ra nhiều tổn thương Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách, có thể là sản phẩm của những căng thẳng thần kinh, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, bức xạ mặt trời,…[48]

1.3.1.2 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do Cụ thể hơn, chất chống oxy hóa có electron dư thừa để cung cấp cho gốc tự do, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự do [48]

Trong cơ thể con người có sẵn một vài loại enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều gốc tự do làm hại tế bào như: superoxit dismutase, phân hóa tố trong nhiều

tế bào (như hồng cầu và gan) hoặc glutathione periodase Tuy nhiên vì số lượng gốc

tự do trong cơ thể quá nhiều nên phải nhờ đến những chất chống oxy hóa từ bên ngoài vào theo dạng thức ăn và nước uống

Mangiferin là một trong những chất lí tưởng có tác dụng kháng oxy hóa dựa trên cơ sở kiềm hãm quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Khi đưa mangiferin vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lí (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa), chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo ra bởi mangiferin phản ứng với các

gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào phản ứng oxy hóa tiếp theo Kết quả là hạn chế bệnh lí do cắt đứt dây chuyền [49]

1.3.1.3 Phương pháp kháng oxy hóa

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH picrylhydrazyl)

(1,1-diphenyl-2-DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc

tự do và các nhóm cho hydroxy, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa ngày nay Những electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517nm và hợp chất này có màu tím [11]

Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của mangiferin còn được xác định dựa vào giá trị IC50 (là lượng chất chống oxi hóa cần thiết để giảm độ hấp thụ của DPPH xuống 50% độ hấp thụ ban đầu) và so sánh với vitamin C

Cơ chế phản ứng của gốc tự do và chất chống oxy hóa:

DPPH + AH  DPPH-H +A

Tỉ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được xác định theo công thức sau:

% 𝑏ắ𝑡 𝑔ố𝑐 𝑡ự 𝑑𝑜 𝐷𝑃𝑃𝐻 (%) =𝑂𝐷𝑐− 𝑂𝐷𝑚× 100

𝑂𝐷𝑐Trong đó:

ODc: giá trị mật độ quang OD của mẫu trắng,

ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử

Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ đó xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt được 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng chống oxy hóa giữa các mẫu Mẫu nào có giá trị IC50 càng thấp thì có khả năng chống oxy hóa càng cao [30]

1.3.2 Kháng khuẩn

Chất kháng khuẩn là chất có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt lên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi khuẩn [49]

Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh

đồ khuyếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer (1966) Khả năng kháng khuẩn của cao chiết được xác định dựa vào sự hình thành vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy tẩm cao chiết [30]

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ dịch chiết thấp nhất mà xuất hiện vòng vô khuẩn Do đó, nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao

Trong nghiên cứu này khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá xoài,

mangiferin tinh sạch đối với vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella, Vibrio Những

chủng vi khuẩn được chọn là các dòng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về tính kháng khuẩn, 3 chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh nghiêm trọng về đường tiêu hóa trên người và các loài động vật

1.4 Tình hình nghiên cứu về tinh sạch và hoạt tính sinh học của mangiferin thế giới và trong nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu thế giới

Năm 1960, Ramanathan JD, Seshadri TR đã nghiên cứu cấu trúc hoàn chỉnh của mangiferin, trước đó được phân lập bởi Garter và Wiechowski [24]

Năm 2005, Stoilova I và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của mangiferin Kết quả cho thấy mangiferin có hoạt tính chống lại bảy

loài vi khuẩn: Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Salmonella agona, Klebsiella pneumoniae, một nấm men: Saccharomyces cerevisiae và bốn loại nấm: Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei, Aspergillus flavus và Aspergillus fumigatus [31]

Năm 2007, sáng chế liên quan đến phương pháp chiết mangiferin từ lá xoài hoặc lá hạnh nhân bằng cách sử dụng hỗn hợp nước hoặc rượu - nước ở nhiệt độ cao

và áp suất cao được đưa ra bởi Zoubuzhen, Long Zeyun [50]

Năm 2008, Stoilova I và cộng sự tiếp tục nghiên cứu các đặc tính chống oxy hóa của mangiferin trong axit linoleic/ hệ nhũ tương nước bởi các chất phản ứng acid thiobarbituric và bằng cách ức chế sự hình thành liên hợp của các điện cực Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng mangiferin có thể là một tác nhân chống oxy hóa đầy hứa hẹn [51]

Năm 2009, Lưu Đông Phong, Zhang Yi và cộng sự đưa ra phương pháp điều chế mangiferin áp dụng ngâm trong 2 giờ và chiết dung dịch bằng nước vôi bão hòa điều chỉnh pH = 7 bằng axit clohydric, hấp thụ nhựa macroporous AB-8, rửa giải từng bước bằng 30l nước và 25l dung dịch ethanol 60%, kết tinh dưới áp suất thấp và kết tinh lại bằng cách điều chỉnh độ axit nhờ vào ethanol Phương pháp này thu được mangiferin có độ tinh khiết 96% [52]

Năm 2012, Luo F, Lv Q, Zhao Y, Hu G, Huang G, Zhang J, Chen K lần đầu tiên tinh chế hiệu quả mangiferin từ vỏ quả xoài bằng cách kết hợp sắc kí nhựa macroporous HPD100 với phương pháp HSCCC được tối ưu hóa Mangiferin tinh

khiết được xác định bởi cả HPLC và LC-MS Phương pháp sử dụng nhựa HPD100 với tốc độ hấp phụ 2ml/phút, rửa tạp bằng nước và ethanol 5% sau đó rửa giải bằng ethanol 30% thu được 74,3 mg mangiferin có độ tinh khiết 99,13%[32]

Năm 2014, Lương Yaoguang, Dương Tử, Zhang Tianyou đưa ra phương pháp tách và tinh chế mangiferin từ lá cây aquiaria sinensis Phương pháp này giải quyết được các vấn đề về độ tinh khiết thấp, năng suất thấp nhờ vào sự kết hợp giữ sắc kí cột thông thường và sắc kí ngược dòng tốc độ cao Cột sắc kí sử dụng hệ dung môi chloroform - methanol (75:25) với tốc độ rửa giải 5ml/phút thu được mangiferin có độ tinh khiết 98% [53]

Cũng trong năm 2014, Luhua Xiang và cộng sự thực hiện phương pháp xử lí nguyên liệu rồi chiết cao áp, chiết hai pha nước, khử muối và kết tinh lại thu được mangiferin Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng mangiferin cao, quy trình đơn giản, chi phí sản xuất thấp [54]

Năm 2016, Sihui Nian, Ehu Liu, Yong Fan, Raphael N Alolga, Huijun Li, Ping

Li đã đưa ra phương pháp để tinh chế và làm sạch hiệu quả bốn chất: neomangiferin, mangiferin, timosaponin B-II và timosaponin A-III bằng cách sử dụng phương pháp hấp phụ nhựa macroporous và polyamide Phương pháp được kết hợp giữa PRC (polyamide resins chromatography) và MRC (macroporous resins chromatography), chỉ sử dụng dung môi nước và ethanol nhằm hạn chế các dung môi nguy hiểm và độc hại [33]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết suất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên như flavonoid, glycoside, saponin, mangiferin…Một số nghiên cứu được đưa ra như ứng dụng nhựa macroporous trong tinh chế naringin ở trong cùi bưởi hay làm giàu catechin trong trà xanh…

Năm 1991, Phạm Xuân Sinh đã nghiên cứu và tìm ra quy trình chiết tách, làm sạch mangiferin bằng phương pháp chiết tách truyền thống sử dụng dung môi methanol [14]

Năm 1994, Nguyễn Viết Lựu thông báo kết quả chiết suẩt mangiferin từ lá xoài dùng nước nóng làm dung môi và sự phân giải mangiferin nhờ hoạt tính của enzyme Sản phẩm kỹ thuật đạt 84-89% mangiferin Từ sản phẩm này qua 1 lần tinh chế với dung môi E1OH-H20 cho sản phẩm tinh khiết trên 98% Hiệu suất quá trình này đạt 81% hiệu suất chiết xuất bằng cồn, nhưng độ sạch của sản phẩm kỹ thuật chiết cồn thấp hơn, chỉ bằng 86% độ sạch của sản phẩm kỹ thuật của quy trình này [15]

Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy Anh, đã chứng minh trong thân xoài chứa mangiferin tới 3%, lá xoài chứa khoảng 1,6% mangiferin Chất này trong lá xoài là chất chống viêm, nó còn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương rất mạnh, bảo vệ răng miệng, chống bựa răng và các mảng phủ quanh chân răng Chứng tỏ rằng mangiferirn

có khả năng kháng khuẩn sâu răng rất tốt [12]

Năm 2015, TS Nguyễn Văn Hân bước đầu nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous D101 trong phân lập steviol glycoside, iridoid, mangiferin đưa ra giải pháp sử dụng hấp phụ nhựa để nâng cao hàm lượng tinh khiết của các chất cần tách,

sử dụng dung môi nước và ethanol [56]

Năm 2018, Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang thực hiện nghiên cứu

“Khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng cả dịch trích methanol lá xoài non (Mangifera indica L.)” Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), khử sắt (RP)

và 2, 2'-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+) có giá trị IC50

lần lượt là 27,64 ± 0,88; 12,11 ± 1,15 và 45,7± 0,50 µg/mL Kết quả cho thấy lá xoài non có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường theo cơ chế kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào β của tụy tạng khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất [13]

Ở Việt Nam hiện nay hầu như không có nghiên cứu nào tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sắc kí hấp phụ nhựa macroporous D101 và so sánh hoạt tính sinh

học của cao chiết thô với mangiferin tinh sạch Do đó, đề tài “Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp hiện đại và khảo sát hoạt tính tinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài ” được đề xuất để thực hiện nhằm đáp ứng kịp nhu cầu

hiện nay của người tiêu dùng về các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, đồng thời mở ra các phương pháp nghiên cứu mới phù hợp với điều kiện tại Việt Nam

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lá xoài: sau khi thu hoạch sẽ được rửa sạch, để ráo nước và sấy khô ở khoảng nhiệt độ 50-55 oC Sau đó nghiền mịn thành bột và rây để đạt kích thước đồng đều hơn Tiến hành bao gói trong các túi zip để tránh hút ẩm và bảo quản ở nhiệt độ thường

Địa điểm thu mẫu: vườn xoài La Chữ, Hương Trà, Thừa Thiên Huế

Thời gian thu mẫu: tháng 12 năm 2018, tháng 1 năm 2019

Địa điểm tiến hành: Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế

2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Môi trường LB (pepton, agar, nấm men, NaCl)

- Môi trường pepton kiềm (pepton, agar, NaCl)

- Các giống vi sinh vật: vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella, Vibrio

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

➢ Dụng cụ: Các dụng cụ thủy tinh như cốc, ống đong, bình định mức, micropipet, buret, đũa thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, giấy lọc, eppendorf, giấy bạc, đĩa petri, que trang, bình xịt cồn, đầu côn, đèn cồn, giấy dán nhãn,…

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm và định tính, định lượng mangiferin trong các cao chiết từ lá xoài

2.3.1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Bột lá xoài

Chiết mangiferin từ lá xoài bằng các

phương pháp khác nhau trong dung môi

Mangiferin tinh khiết

Khử màu bằng than hoạt tính

Khảo sát hoạt tính sinh học

mangiferin sau tinh sạch

Kháng oxy hóa

Kháng khuẩn

Nghiên cứu giải hấp phụ:

-Dung môi rửa giải -Thể tích rửa giải

Nghiên cứu hấp phụ mangiferin: -Tỉ lệ chiều cao/đường kính cột -Dung lượng hấp phụ

Xử lí hạt nhựa D101

2.3.1.2 Xác định hàm lượng mangiferin trong cao lá xoài

- Định tính nguyên liệu bằng phản ứng màu đặc trưng của mangiferin và sắc kí lớp mỏng

- Định lượng hàm lượng mangiferin bằng phương pháp quang phổ UV-VIS

- Lựa chọn cao có mangiferin cao nhất để tinh sạch

2.3.1.3 Chiết xuất mangiferin từ lá xoài và khảo sát hàm lượng mangiferin có trong các cao chiết

- Chiết mangiferin từ lá xoài bằng phương pháp siêu âm và phương pháp Soxhlet bằng các dung môi nước và ethanol 600

- Khảo sát và chọn cao chiết có hàm lượng mangiferin cao nhất

2.3.2 Tinh sạch mangiferin bằng phương pháp sắc kí cột

2.3.2.1 Nghiên cứu hoạt hóa hạt nhựa ban đầu

2.3.2.2 Nghiên cứu quá trình hấp phụ mangiferin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous

- Khảo sát tỉ lệ chiều cao, đường kính cột

- Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa

2.3.2.3 Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ từ hạt nhựa macroporous

- Khảo sát dung môi rửa giải

- Khảo sát thể tích rửa giải

2.3.3 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn

2.3.3.1 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa

- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết thô, mangiferin sau tinh sạch và so sánh với vitamin C

2.3.3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết thô, mangiferin tinh sạch và so sánh với mangiferin chuẩn và kháng sinh ampicillin

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết mangiferin bằng các dung môi nước và ethanol 60 0

2.4.1.1 Chiết mangiferin bằng phương pháp Soxhlet

➢ Dung môi nước

Điều kiện tốt nhất của phương pháp chiết Soxhlet trong dung môi nước được khảo sát được là: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 1/30 và thời gian chiết là 8 giờ [17]

➢ Dung môi ethanol 60 0

Theo quá trình thực nghiệm, để đạt độ hấp phụ quang của dịch chiết cao nhất (1,228 Abs) cũng như đảm bảo tính kinh tế, quá trình chiết tiến hành ở tỉ lệ v/w 15/1, thời gian là 4 giờ và nồng độ dung môi 600 [18]