Nghiên cứu chế biến nước uống từ đậu đen

Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của chúng, α-amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các dextrin phân tử... Một số α-amylase tạo maltose: khi sử dụng α-

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Đống Thị Anh Đào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Tp HCM ngày tháng năm 2012

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: DƯƠNG NGỌC TÚ Phái: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 19/09/1979 Nơi sinh: Tp.Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống MSHV: 09110180

I Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN NƯỚC UỐNG TỪ ĐẬU ĐEN

II Nhiệm vụ và nội dung:

 Khảo sát thành phần nguyên liệu

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dịch hóa: enzyme, thời gian, nhiệt

độ và pH

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa: tỷ lệ bột:nước, enzyme, thời gian, nhiệt độ và pH

 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa nguyên liệu

 Khảo sát yếu tố nhiệt độ thanh trùng ảnh hưởng hàm lượng anthocyanin

 Ngày giao nhiệm vụ: 15/01/2011

III Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 15/01/2012

IV Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Đống Thị Anh Đào

Nội dung và đề cương được luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng Chuyên ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS.TS.ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN

em trong thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, tận tình của các thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm trong suốt quá trình học và làm luận văn

Xin chân thành cảm ơn các phòng ban, đồng nghiệp trong cơ quan đã quan tâm giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm luận văn

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và các bạn học viên cao học, sinh viên đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn

Học viên

Dương Ngọc Tú

TÓM TẮT

Đậu đen là ngũ cốc nhiều chất dinh dưỡng nhưng hầu như không có sản phẩm sản xuất công nghiệp từ đậu đen Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định điều kiện tối ưu để sản xuất công nghiệp sản phẩm nước uống từ đậu đen Chúng tôi sử dụng enzyme Termamyl 120L và enzyme AMG 300L để thủy phân tinh bột đậu đen Quá trình thủy phân tinh bột từ đậu đen đã hồ hóa được thực hiện theo hai giai đoạn: giai đoạn dịch hóa được tiến hành với 0,15% (v/w) Termamyl 120L ở pH 6,0; 95oC; 120 phút; giai đoạn đường hóa với 0,11% (v/w) AMG 300L ở pH 4,5;

60 oC; 172 phút Kết thúc quá trình thủy phân, dịch đậu đen có hàm lượng đường khử tăng từ 0,78% đến 33,56%

ABSTRACT

Black bean is nutritious cereal but there’s almost no industrial scale production of products made from this material In this research, we have defined the optimal conditions to produce beverage from black bean We have used enzymes of Termamyl 120L and AMG 300L to hydrolyze starch in black bean There are two stages in starch hydrolyzation which is realized The gelatinizing stage is executed with 0.15%(v/w) Termamyl 120L at pH 5.6, 95oC in 120 minutes; the saccharization stage is executed with 0.11%(w/w) AMG 300L at pH 4.5, 60oC, in

172 minutes At the end of hydrolyzation, black bean solution has reducing sugar increase from 0.78%to 33.56%

MỤC LỤC

Nhiệm vụ luận văn

Lời cảm ơn

Tóm tắt luận văn

Mục lục

Danh mục bảng

Danh mục hình

LỜI MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đậu đen 3

1.1.1 Mô tả cây 3

1.1.2 Phân bố, sinh thái, thu hoạch và chế biến 4

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Công dụng của đậu đen 6

1.1.5 Sản phẩm từ đậu đen 8

1.2 Enzyme α-amylase 8

1.2.1 Giới thiệu chung về enzyme α-amylase 8

1.2.2 Cấu tạo của α-amylase 9

1.2.3 Cơ chất của enzyme α-amylase 11

1.2.4 Cơ chế xúc tác 12

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α-amylase 16

1.2.6 α-amylase từ vi khuẩn Bac.licheniformis 19

1.2.7 Ứng dụng của enzyme α-amylase 20

1.3 Glucoamylase 21

1.4 Anthocyanin 24

1.4.1 Cấu tạo: 24

1.4.2 Tính chất: 24

1.4.3 Chức năng: 26

1.4.4 Ứng dụng: 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu 28

2.1.1 Đậu đen 28

2.1.2 Enzyme: 28

2.1.2.1 α-amylase 28

2.1.2.2 Glucoamylase: 28

2.2 Quy trình công nghệ 29

2.2.1 Sơ đồ quy trình 29

2.2.2 Thuyết minh quy trình 30

2.2.2.1 Nghiền nguyên liệu 30

2.2.2.2 Hồ hóa nguyên liệu 30

2.2.2.3 Dịch hóa nguyên liệu 31

2.2.2.4 Đường hóa nguyên liệu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu: 32

2.3.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 33

2.3.2.1 Khảo sát nguyên liệu: 33

2.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ bột đậu đen: nước 33

2.3.2.3 Khảo sát các yếu tố tác động chính đến quá trình dịch hóa 33

2.3.2.4 Khảo sát các yếu tố tác động chính đến quá trình đường hóa 35

2.3.2.5 Tối ưu hoá quá trình đường hóa 38

2.3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng sản phẩm đến hàm lượng anthocyanin 39

2.3.2.7 Đánh giá chất lượng sản phẩm 40

2 3.2.7 Phân tích mẫu chè đậu đen truyền thống: 40

2.4 Phương pháp phân tích và tính toán 40

2.4.1 Phương pháp phân tích: (trong phần phụ lục) 40

2.4.2 Phương pháp tính toán 40

2.4.3 Phương pháp cảm quan: 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát nguyên liệu: 42

3.2 Khảo sát tỷ lệ bột đậu đen: nước 43

3.3 Khảo sát các yếu tố tác động chính đến quá trình dịch hóa 44

3.3.1 Xác định nồng độ chế phẩm enzyme Termamyl 120L thích hợp để dịch hoá dịch đậu đen 44

3.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp để dịch hoá dịch đậu đen 46

3.3.3 Xác định thời gian thích hợp để dịch hoá dịch đậu đen 47

3.3.4 Xác định pH thích hợp để dịch hoá dịch đậu đen 49

3.4 Khảo sát các yếu tố tác động chính đến quá trình đường hóa 50

3.4.1 Xác định nồng độ chế phẩm enzyme AMG 300L thích hợp để đường hoá dịch đậu đen 50

3.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp để đường hoá dịch đậu đen 52

3.4.3 Xác định thời gian thích hợp để đường hoá dịch đậu đen 54

3.4.4 Xác định pH thích hợp để đường hoá dịch đậu đen 55

3.5 Tối ưu hoá quá trình đường hóa 57

3.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thanh trùng đến hàm lượng anthocynin 62

3.7 Kết quả phân tích sản phẩm nước uống từ đậu đen: 63

3.7.1 Thành phần hoá lý: 63

3.7.2 Các chỉ tiêu vi sinh 64

3.8 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hoá lý của sản phẩm nước uống từ đậu đen và chè đậu đen truyền thống: 65

3.9 Đánh giá chất lượng cảm quan: 66

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 67

4.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LÝ LỊCH HỌC VIÊN

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2: Độ bền acid của α-amylase mốc đen 17

Bảng 1.3: Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau (Miller, Johnson, 2005) 18

Bảng 1.4: Mối liên quan giữa pHopt và topt của glucoamylase thu nhận từ Rhizopus delemar 22

Bảng 1.5:Mối liên quan giữa pHopt với thời gian tác dụng của glucoamylase thu nhận từ Endomycopsis 22

Bảng 1.6: Một số tính chất khác nhau của glucoamylase thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau 22

Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch trực giao cấp 2, hai yếu tố, phương án quay 39

Bảng 3.1: Thành phần hóa lý của đậu đen 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường khử 45

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch hoá đến hàm lượng đường khử 46

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian dịch hoá đến hàm lượng đường khử 48

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH dịch hoá đến hàm lượng đường khử 49

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme AMG 300L đến quá trình đường hoá 51

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hoá 53

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình đường hoá 54

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến quá trình đường hoá 56

Bảng 4.11: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp 2, 2 yếu tố 57

Bảng 3.13 Bảng phân tích phương sai của mô hình hồi quy 60

Bảng 3.14 Kết quả phân tích sự ảnh hưởng nhiệt độ thanh trùng đến hàm lượng anthocyanin 63

Bảng 3.15: Kết quả phân tích thành phần hoá lý nước uống từ đậu đen: 63

Bảng 4.16 Kết quả phân tích vi sinh của sản phẩm nước uống từ đậu đen 64

Bảng 3.17 Kết quả phân tích hoá lý của nước uống đậu đen và chè đậu đen 65

Bảng 3.18 Kết quả phân tích thị hiếu người tiêu dùng 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây và hạt đậu đen 3

Hình 1.2 Cây, hoa, quả đậu đen 4

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của anthocyanin 24

Hình 1.4 Biến đổi cấu trúc của anthocyanin theo các giá trị pH khác nhau 26

Hình 3.1: Tương quan giữa tỷ lệ bột đậu đen: nước và hàm lượng đường khử 44

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường khử 45

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch hoá đến hàm lượng đường khử 47

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian dịch hoá đến hàm lượng đường khử 48

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH dịch hoá đến hàm lượng đường khử 50

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme AMG 300L đến quá trình đường hoá 51

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hoá 53

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình đường hoá 55

Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến quá trình đường hoá 56

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng 3D trong thí nghiệm tối ưu hoá quá trình đường hoá 61

Hình 3.11 Hình chiếu bề mặt đáp ứng trên mặt phẳng 2D 62

Hình 3.12: Sản phẩm nước uống từ đậu đen 66

LỜI MỞ ĐẦU

Mở đầu

Ngành công nghệ thực phẩm ở nước ta đã và đang trên đà phát triển, nhu cầu đa dạng hoá nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất ngày càng tăng cao Do đó việc tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để tạo ra những sản phẩm công nghiệp có chất lượng ổn định được quan tâm hàng đầu

Đậu đen được trồng nhiều ở nước ta là nguồn thực phẩm có nhiều protein, carbohydrate, vitamin và khoáng chất Để sử dụng hữu hiệu nguồn nguyên liệu đậu đen và đa dạng hóa các sản phẩm thức uống trên thị trường, việc chế biến thức uống cung cấp năng lượng, chứa nhiều vitamin, protein là rất cần thiết Chúng tôi đã thực hiện luận văn với đề tài:

“Nghiên cứu chế biến nước uống từ đậu đen”

Mục tiêu nghiên cứu

Mục đích của luận văn là tạo ra sản phẩm thức uống mới chưa có trên thị trường, tiện dụng, đầy đủ dinh dưỡng và giàu giá trị chức năng từ các nguyên liệu thực vật Và nước ta là một nước nông nghiệp với các tiềm năng phong phú về lương thực thực phẩm do đó cũng không ngoài mục đích làm tăng giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của các nguyên liệu truyền thống

Nguyên liệu đậu đen được chọn là vì đậu đen giàu tinh bột, giàu đạm thực vật, không chứa cholesterol, có thể cung cấp năng lượng cao cho cơ thể Ngoài hàm lượng cao về vitamin và khoáng chất, màu đen ở vỏ ngoài là do các hợp chất anthocyanin tạo nên mà đậu nành không có được Với mục tiêu tạo ra sản phẩm thức uống không cồn đạt chất lượng, mùi vị hài hòa mà người tiêu dùng có thể chấp nhận được, đề tài được tiến hành với các thí nghiệm sau:

- Khảo sát thành phần nguyên liệu

- Khảo sát tỷ lệ bột đậu đen: nước

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dịch hóa nguyên liệu: nồng độ

enzyme, thời gian, nhiệt độ và pH

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa nguyên liệu: nồng độ enzyme, thời gian, nhiệt độ và pH

- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa nguyên liệu

- Khảo sát yếu tố nhiệt độ thanh trùng ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đậu đen [1, 10,13]

Tên khoa học: Vigna cylindrica skeels (Dolichos catjang Burn.f.)

Tên đồng nghĩa: Vigna catjang (Burm.f.) Walp

V unguiculata (L.) Walp

V.sinensis (L) Savi et Hassk

Thuộc nhóm: Cánh bướm (Papilionaceae)

1.1.1 Mô tả cây

Đậu đen là một loại cỏ mọc đứng, sống hàng năm, toàn thân không có lông Lá kép mọc so le gồm 3 lá chét hình bầu dục hoặc hình trứng, đầu nhọn, gốc có tuyến nhỏ, có lá kèm nhỏ, lá chét ở giữa dài và to hơn lá chét ở hai bên

Hình 1.1: Cây và hạt đậu đen [10]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá, thành chùm 20-30cm; đài hình chuông có 5 răng bằng nhau; tràng hoa màu tím nhạt, nhị 10 xếp thành 2 bó

Quả giáp dài tròn, dài 7-13 cm, có đài tồn tại, trong chứa từ 7 đến 10 hạt màu đen, to hơn hạt đậu xanh Đậu đen là 1 trong 100 loại đậu thông thường đa dạng khác nhau với kích thước, hình oval, màu đen huyền, trơn bóng và có đường nối màu trắng, lớp vỏ bọc bên ngoài dày và chắc chắn hơn so với những loại đậu khác Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 7-9

Hình 1.2 Cây, hoa, quả đậu đen [13]

1.1.2 Phân bố, sinh thái, thu hoạch và chế biến

Đậu đen có khoảng 20 loài ở Việt Nam, mỗi loài có vài giống khác nhau Đậu đen

có nguồn gốc Châu Phi và sớm được đưa vào cây trồng từ thời cổ đại Hiện nay cây được trồng rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Châu Á, đậu đen trồng nhiều nhất ở Ấn Độ, Srilanca, Mianma, Trung Quốc và tất cả các nước trong vùng Đông Nam

Á Cây cũng được trồng nhiều ở 16 nước thuộc Châu Phi, nhiều nước ở vùng Caribê, Nam Mỹ và Australia Ở Việt Nam, đậu đen được coi là cây trồng lâu đời, dường như tỉnh nào cũng có Song nơi trồng lớn nhất là các tỉnh miền Trung sau đến các tỉnh ở đồng bằng

và trung du Bắc Bộ

Đậu đen thuộc loại cây ngắn ngày, ưa sáng, thích nghi với điều kiện nóng và ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ khoảng 20oC đến 35oC Giới hạn về lượng mưa hàng năm rộng Tuy nhiên, cây trồng ở Ấn Độ, Châu Phi và các nước Đông Nam Á thường không vào mùa mưa Đậu đen trồng ở Việt Nam chủ yếu cung cấp cho thị trường trong nước

Đậu đen được nhân dân miền Bắc trồng để lấy hạt nấu chè đậu đen hoặc thổi xôi Hạt cũng hay được dùng trong việc điều chế thuốc Đậu đen thường được sử dụng

khi đã sấy khô, sấy khô đậu là cách thức bảo quản đậu và nếu sấy khô hoàn toàn thì có

thể dự trữ trong một năm

1.1.3 Thành phần hóa học [15, 19, 20, 29, 34, 36]

Đậu đỗ là thực phẩm truyền thống chính yếu của nhiều nước Châu Mỹ La tinh

và được chú ý như thành phần thực phẩm chức năng và thực phẩm tăng cường sức

khoẻ Đậu đỗ không chỉ chứa lượng lớn protein mà còn chứa các acid amin thiết yếu,

carbohydrate, vitamin và khoáng chất

Hầu hết ở các nước Trung Mỹ, đậu đen các loại cung cấp 20-30% protein trong

khẩu phần Hàm lượng các acid amin thiết yếu trong đậu đen được nhiều nhà nghiên

cứu quan tâm từ rất lâu

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trong đậu đen [15, 34]

Thành phần

dinh dưỡng trong 100g Đơn vị lượng Hàm Thành phần dinh dưỡng trong 100g Đơn vị lượng Hàm

Một số nghiên cứu cho thấy đậu chứa rất nhiều chất có hoạt tính sinh học có tác

dụng chuyển hoá trong cơ thể con người khi được tiêu thụ lượng lớn, có thể phòng

được các bệnh tim mạch, đái tháo đường đang tăng cao ở các nước phát triển và các

nước đang phát triển Đậu chứa một lượng lớn chất dinh dưỡng và chất không bổ

dưỡng có hoạt chất phenol có tính năng bảo vệ tim, chống sự tổn hại DNA, chống nguy cơ ung thư

Đậu đen là thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, cung cấp một lượng lớn protein và năng lượng Đậu đen cũng chứa nhiều vitamin, isoflavon, saponin, carotenoid và anthocyanin, có nhiều hoạt tính sinh học Vỏ đậu đen chứa nhiều chất xơ, những thành phần năng lượng thấp Mặc dù vỏ đậu đen chiếm tỷ lệ nhỏ trong cả hạt (7-13%) nhưng rất giàu chất xơ tiêu hoá, khoáng chất như canxi, hợp chất phenol có hoạt tính chống oxy hoá cao Gần đây, có nhiều nghiên cứu xác định chất polyphenol trong các

vỏ đậu chứa nhiều chất có lợi cho sức khoẻ như flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học

và hoạt tính sinh lý

1.1.4 Công dụng của đậu đen [8]

Đậu đen là thực phẩm có sẵn có thể dùng quanh năm, kể cả loại đóng hộp, phơi khô hoặc vừa thu hoạch Đây là nguồn thực phẩm ngon miệng và có lợi cho sức khỏe Ngoài công dụng làm thực phẩm (nấu chè, thổi xôi) đậu đen được dùng trong đông y để chế thuốc như nấu với hà thủ ô làm cho vị thuốc có màu đen Theo đông y những vị thuốc chế biến với đậu đen có tác dụng bổ thận Khi kết hợp với các loại thực phẩm khác, nhất là thực phẩm ngũ cốc như: gạo nâu, gạo lức… sẽ tạo

ra nguồn protein chất lượng cao

Dưới đây là một số lợi thế chính chữa bệnh từ đậu đen:

Có tác dụng khử độc sulfat

Do có chứa khoáng chất vi lượng molypden nên có tác dụng rất tốt trong việc khử độc sulfat cho cơ thể Một bát đậu đen có chứa tới 172% nhu cầu khoáng chất molypden cần thiết cho cơ thể mỗi ngày

Thực phẩm giàu chất xơ

Chất xơ trong thực phẩm rất có ích cho quá trình chuyển hóa glucose ở bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường, bằng chứng sau khi ăn xong không hề xuất hiện tình trạng tăng đường huyết Sự có mặt của chất xơ còn làm giảm cholesterol, nó liên kết với acid mật - thành phần làm tăng cholesterol Do không được cơ thể hấp thụ nên khi đào thải ra ngoài, chất xơ mang theo cả acid mật và kết quả hàm

lượng cholesterol của cơ thể giảm theo Ngoài ra, do có chứa các chất xơ không hòa tan nên đậu đen có tác dụng giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh táo bón, rối loạn tiêu hóa và các chứng bệnh khó chịu có liên quan

Giàu chất chống oxy hóa

Đậu đen là nguồn giàu chất chống oxy hoá có lợi cho sức khoẻ như những loại trái cây thông thường: nho, táo, việt quất… Đậu có chứa hỗn hợp chống oxy hóa rất được chú ý, vỏ của những hạt đậu có màu chứa những flavonoid cấp cao, do vậy hoạt động chống oxy hoá cao hơn

Những cây họ đậu không những có lợi cho sự chống oxy hoá mà còn là loại thực phẩm rất giàu protein, cacbonhydrate, folate, canxi và chất xơ Đậu đen là loại đậu đứng đầu có nhiều chức năng chống oxy hoá hơn bất cứ loại đậu nào như đậu đỏ, vàng hay trắng… Mặc dù chỉ những loại đậu khô được nghiên cứu nhưng những loại đậu đông lạnh và đóng hộp cũng được cho rằng có những chất chống oxy hoá tương tự

Giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch

Một nghiên cứu được thực hiện ở 16.000 đàn ông trung niên thuộc 7 quốc gia trong vòng 25 năm, do các nhà khoa học quốc tế thực hiện cho thấy những người ăn nhiều cá, đậu đen, rau xanh, ngũ cốc và sử dụng rượu vang điều độ là nhóm người giảm được tới 82% nguy cơ mắc bệnh tim mạch, so với nhóm người

ăn ít nhóm thực phẩm nói trên, đặc biệt là thực phẩm họ đậu, lý do là đậu đen có chứa nhiều chất xơ Lợi thế của đậu đen là cung cấp chất xơ, folate và magie giúp làm giảm hormocystein, một loại acid amino hay còn gọi là sản phẩm trung gian không có lợi cho quá trình chuyển hóa và một khi hormocystein tăng thì rủi ro mắc bệnh tim, đột quỵ là rất lớn

Tăng cường năng lượng cho cơ thể và ổn định lượng đường huyết

Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng ổn định lượng đường trong máu Trường hợp cơ thể kháng insulin mắc bệnh đái tháo đường thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuối cùng ổn định lượng đường huyết

Tăng cường sắt và mangan cho cơ thể

Đậu đen có tác dụng rất tích cực trong việc làm tăng năng lượng và hồi phục hàm lượng sắt cho cơ thể và rất hữu ích cho nhóm người bị mất máu bởi chấn thương, hoặc cho phụ nữ giai đoạn hành kinh cũng như cho nhóm người tuổi

vị thành niên đang trong giai đoạn phát triển Mangan, vi lượng có trong đậu đen được xem là yếu tố vô cùng quan trọng giúp cơ thể tạo năng lượng và chống lại quá trình oxy hóa do các gốc tự do gây nên Một bát nhỏ đậu đen có thể cung cấp tới 38% nhu cầu mangan cho cơ thể mỗi ngày

Nguồn bổ sung protein cho cơ thể

Không chỉ ngon miệng, dễ chế biến, đậu đen còn là nguồn thực phẩm thay cho thịt, cá vì nó giàu hàm lượng protein hữu ích, không có chứa hàm lượng calo quá cao hoặc các loại mỡ xấu như các loại thực phẩm gốc động vật và như trên đã đề cập,

nó rất có lợi cho nhóm người ăn kiêng Một bát nhỏ đậu đen cung cấp khoảng 15,2g protein (tương đương 30,5% nhu cầu protein và 74,8% nhu cầu chất xơ cho cơ thể mỗi ngày)

1.1.5 Sản phẩm từ đậu đen [8]

Ở Việt Nam, đậu đen được dùng chế biến nhiều món ăn thông thường và đặc sản

ở dạng nấu ăn ngay như: chè đậu đen, kem cây, cháo, có trong bánh ú, bánh tét, bánh chưng, xôi nếp than hoặc nếp trắng, nhân bánh trung thu, nhân kem cho nhiều loại bánh ngọt, bột ngũ cốc dinh dưỡng

Với người Trung Hoa, việc chế biến đậu đen phục vụ ẩm thực càng phong phú

Họ có những món rất đặc biệt như: tương đậu đen, đậu sị (dạng muối tương khô), đậu đen xào, nấu canh, kho

1.2 Enzyme α-amylase

1.2.1 Giới thiệu chung về enzyme α-amylase [16,18, 25]

Là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α-1,4-glucoside một cách ngẫu nhiên ở

vị trí bất kì nhưng chủ yếu tập trung ở giữa mạch amylose và amylopectin nên nó thuộc loại endo–enzyme Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của chúng, α-amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các dextrin phân tử

nhỏ, maltose và glucose Tuy nhiên, tùy nguồn gốc mà α-amylase từ các vi sinh vật

có thể có sản phẩm thủy phân theo tỷ lệ các thành phần không giống nhau (Forgaty 1990)

Một số α-amylase tạo maltose: khi sử dụng α-amylase từ nấm mốc Asp.oryzae

các sản phẩm chính của quá trình thủy phân thường là maltose và maltotriose ;

α-amylase từ Streptomyces hygroscopicus là một endo–enzyme có thể thủy phân tinh

bột tới 75-85% sản phẩm chứa maltose Enzyme này còn có hoạt tính transglycosylase, maltotriose được chuyển thành maltotetraose sau đó thủy phân thành maltose mà không tạo ra glucose; α-amylase ngoại bào của chủng

Thermonospora có khả năng thủy phân tinh bột cho sản phẩm chính là glucose và

maltose (Forgaty 1990, Neidleman 1991)

1.2.2 Cấu tạo của α-amylase [16, 17, 18, 21, 38]

Cấu tạo của α-amylase gồm 3 tiểu đơn vị, A là tiểu đơn vị lõi được nối với tiểu đơn vị C có cấu trúc 8 đoạn β–sheet, tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β–sheet được lồng vào tiểu đơn vị A Tiểu đơn vị B quyết định hoạt tính enzyme và liên kết enzyme–cơ chất

Nó cũng ảnh hưởng đến isoform và các tính chất đặc biệt của isoform này Ion Ca2+nối giữa đơn vị A và B Tuy nhiên, ở α-amylase của nấm mốc, liên kết này yếu, có số lượng liên kết thấp và có thể bị hạn chế (Brzozowski 1997, 2000, Ferrari 1993, Marco 1996)

Tâm hoạt động:

- Có chứa một số gốc acid amin đặc hiệu Thông thường các nhóm đặc hiệu của

nó là nhân imidazol và nhóm hydroxyl

- α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tính chất của acid yếu và tính chất của glubulin

- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2÷5,7 Phân tử lượng của các α-amylase

từ các nguồn khác nhau rất gần nhau α-amylase của nấm mốc 45000–

50000Da, của malt 59000Da, của B.stearolthermophilus có phân tử lượng là

15600Da (Campbell, Manning 1964) Người ta nhận thấy rằng phân tử lượng

của α-amylase giảm đi (chỉ còn khoảng 14000Da đến 15000Da) còn hàm lượng Ca lại tăng theo nhiệt độ nuôi vi sinh

Thành phần acid amin:

- Thành phần acid amin của α-amylase thay đổi theo nguồn thu nhận, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, nhưng nhìn chung đều giàu tyrosin và tryptophan

- Các acid glutamic và aspartic chiếm 1/4 tổng lượng acid amin cấu thành phân

tử enzyme

- Trong amylase rất ít methinonine và chỉ có khoảng 7-10 gốc cystenie trừ

α-amylase của Bac.subtilis không có các liên kết sulfuahydryl và disulfuahydryl

- Trong thành phần acid amin của α-amylase của Asp.oryzae có chứa ít arginine

và histidine nên cũng chứa ít nhóm amin và hàm lượng nitơ, do đó chúng mang tính acid hơn

α-amylase của Asp.oryzae có chứa thành phần là polysaccharide Polyose

này bao gồm 8 mol manose, 1 mol glucose, 2 mol hexoseamin trên 1 mol enzyme (Akabori và cộng sự, 1955) Vai trò của các polyose này vẫn chưa rõ, song người ta đã biết rằng nó không tham gia vào thành phần trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme

Calcium và vai trò của nó trong phân tử α-amylase [5]:

- α-amylase là một metalloenzyme Các α-amylase đều chứa từ 1–30 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1965)

- Calcium còn bảo đảm độ bền của α-amylase đối với tác động gây biến tính và

sự phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein

- α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Đặc tính này có thể liên quan đến hàm lượng calcium trong phân tử của nó

- α-amylase của vi khuẩn ưa nhiệt có chứa calcium nhiều hơn của α-amylase từ nấm mốc nên nó bền nhiệt hơn

- Ion Ca2+ làm ổn định α-amylase của malt, của vi sinh vật (trong đó có cả 3 loại

α-amylase từ Asp.flavus, Asp.awamori, Asp.oryzae) α-amylase từ

Asp.awamori và từ Asp.oryzae được ổn định bởi Al3+, ion sắt ức chế hoạt động

của α-amylase từ Asp.awamori và từ Asp.oryzae

Tất cả các α-amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng (Cu2+, Hg2+,

Ag+…) Các kim loại như Li+, Na+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Cd2+, Sn2+không gây ảnh hưởng đáng kể đến α-amylase

1.2.3 Cơ chất của enzyme α-amylase [3,11]

Cơ chất của quá trình thủy phân: gồm các polysaccharide chứa các liên kết α–1,4–glucoside và chủ yếu là tinh bột và glycogen (tinh bột động vật)

1.2.3.1 Tinh bột

Tinh bột bao gồm hai cấu tử là amylose và amylopectin, các chất này khác hẳn nhau về tính chất lý học và hóa học Amylose tạo màu xanh với iod và amylopectin

lại tạo màu tím đỏ Chúng cũng khác nhau về tính hòa tan Amylose dễ hòa tan trong

nước ấm và tạo dung dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ tan trong nước nóng và tạo dung dịch có độ nhớt cao Về phân tử lượng cũng có sự khác biệt rõ rệt Amylose có phân tử lượng 3.105–106, còn amylopectin có phân tử lượng từ 5.104–106

Trong tinh bột tỷ lệ amylose và amylopectin thường là 1:4

Về cấu tạo: hai thành phần trên đều có chứa các đơn vị cấu tạo là glucose Trong amylose các gốc glucose được gắn với nhau nhờ liên kết α–1,4–glucoside tạo nên một chuỗi dài gồm 200-1000 gốc glucose Phân tử amylose bao gồm một số chuỗi xếp song song nhau, trong đó các gốc glucose cuộn lại theo hình xoắn ốc Mỗi chuỗi

amylose có một đầu không khử và một đầu khử

Trong phân tử amylopectin, các gốc glucose không những gắn với nhau nhờ liên kết α–1,4–glucoside mà còn nhờ liên kết α–1,6–glucoside Vì thế mà nó có cấu trúc nhánh Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất Người ta còn tìm thấy

trong thành phần của phân tử amylopectin còn có một ít phospho Phospho được gắn

vào nguyên tử cacbon thứ sáu của gốc glucose

1.2.3.2 Glycogen

Là polysaccharide dự trữ của cơ thể người và động vật Vì vậy, người ta coi nó

là polysaccharide đặc trưng của động vật hay “tinh bột động vật”

Ngoài ra, các nguồn khác nhau như nấm mốc, nấm men và ở một vài loại hạt ngô Glycogen có vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucid ở cơ thể động vật và ở nấm men khi lên men rượu Nó hòa tan được trong nước nóng Khi tác dụng với iod

sẽ cho màu đỏ tím hoặc màu đỏ nâu giống màu của amylopectin với iod

Phân tử lượng của glycogen thay đổi trong một khoảng khá lớn và có thể đạt tới 4.106 tương ứng với số gốc glucose khoảng 24000

Glycogen có cấu tạo gần giống với amylopectin của tinh bột nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn Trong phân tử của glycogen cũng có liên kết α–1,4–glucoside và α–1,6–glucoside nhưng liên kết α–1,6–glucoside nhiều hơn ở amylopectin Các đoạn mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn của amylopectin Chiều dài trung bình của các đoạn mạch nhánh chỉ có 12 -14 gốc glucose

1.2.4 Cơ chế xúc tác [16,17,30]

Cơ chế phản ứng thủy phân tinh bột:

Không phụ thuộc nguồn gốc của chất xúc tác, mỗi khi mối liên kết α–1,4–glucoside bị phân cắt thì tại ngay điểm đó lập tức được liên kết với nhóm ion của nước

Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột ở trong môi trường giàu nước bởi enzyme α-amylase, người ta thấy rằng, các chất xúc tác bẻ gãy mối liên kết glucoside giữa cacbon số 1 (C1) với nguyên tử oxy Ở mạch amylose, khi mối liên kết α–1,4–glucoside bị phân cắt thì nhóm hydroxyl (OH-) sẽ liên kết với cacbon số 1 (C1) của gốc glucoside bên trái, còn cation hydro (H+) sẽ liên kết với O- ở nguyên tử C4 ở gốc glucoside bên phải Đối với mạch amylopectin, khi mối liên kết α–1,6–glucoside bị cắt đứt, thì nhóm OH- của nước sẽ liên kết với nguyên tử C1 ở mạch chính, còn H+ sẽ liên kết với O- ở nguyên tử C6 ở mạch nhánh

Một cách tổng quát, nếu tất cả các mối liên kết glucoside của tinh bột bị phân cắt (bao gồm n gốc) thì cần có (n-1) phân tử nước để liên kết với chúng và sẽ tạo ra n phân tử đường glucose Nhưng vì n là đại lượng lớn cho nên hiệu số n và (n-1) có thể xem là không đáng kể Lúc đó phương trình thủy phân tinh bột có thể biểu diễn:

α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột chưa hồ hóa

nhưng với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình nhiều giai đoạn [18,30]:

- Ở giai đoạn đầu-giai đoạn dextrin hóa- chỉ một số liên kết trong phân tử có thể bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột bị giảm nhanh (cả amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

- Ở giai đoạn thứ hai-giai đoạn đường hóa- các dextrin phân tử thấp vừa mới tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không tạo màu với iod Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide

- Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (6-7 gốc glucopyranose một) Sau đó các các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục nên các polyglucose này cứ ngắn dần lại

và bị phân giải chậm đến maltotetraose, maltotriose và maltose

- Qua một thời gian dài dưới tác động của amylase, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose

α Tác dụng của αα amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì αα amylase không phân cắt được liên kết α–1,6–glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin thấp phân tử và isomaltose(8%)

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra dextrin thấp phân tử không cho màu với iod và một ít maltose Vì vậy, người ta thường gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

Sơ đồ biểu diễn cho sự thủy phân như sau:

Tinh bột + H2O → Dextrin + Maltose + Glucose + Glycogen

nhiều ít

Nhận định này đã tồn tại trong thời gian khá dài Tuy nhiên, sau đó người ta tìm thấy rằng trong nấm mốc có α-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dextrin hóa cao vừa tạo một lượng đường lớn glucose và maltose

Pakumuro và cộng sự cho rằng trong số các amylase của vi khuẩn có loại amylase dextrin hóa, có loại α-amylase đường hóa Khi thủy phân tinh bột bằng α-amylase đường hóa thì có tới hơn 60% tinh bột bị phân giải, còn bằng α-amylase

α-dextrin hóa thì mức độ depolymer hóa không vượt quá 30-40% (Robyt, Prench, 1977)

So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa vượt trội hơn là hoạt lực đường hóa Theo số liệu của Lifsitx và Braznitsenco (2000),

khả năng dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ Asp.oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần, còn ở Bac.subtilis thì cao hơn 2 lần

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột không còn nguyên, còn α-amylase của vi khuẩn lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột chưa được hồ hóa lẫn hồ tinh bột (Brovaretx, Popadicts và đồng sự, 1967) Chế phẩm α-

amylase của B.subtilis phân giải hạt tinh bột chưa được hồ hóa 2-2,5 lần nhanh hơn so

với α-amylase của nấm mốc (Lixink, Popadicts, 2001)

Ở các giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn Dextrin do α-amylase của vi khuẩn tạo ra khi phân giải tinh bột có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc

α-amylase của vi khuẩn Bac.subtilis tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có

mạch dài khoảng 6-8 gốc (G6, G7, G8) Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo

α-Fenikxova và Ermosina cho biết rằng các maltopentaose và maltohexaose thủy phân theo sơ đồ sau:

α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn không tấn công liên kết α–1,6–glucoside của amylopectin nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành các dextrin giới hạn phân nhánh Sản phẩm đầu tiên của sự phân giải amylopectin bởi α-amylase vi khuẩn là dextrin có

6 gốc glucose, còn sản phẩm cuối cùng glucose, maltose và các maltodextrin (saccharide có phân nhánh) từ các maltodiose đến maltohexaose Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của α-amylase của nấm mốc chủ yếu là maltose, tiếp đến là maltotriose (Sproster, Uhlig, 1987)

Nếu dùng nồng độ α-amylase vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 85% tinh bột thành đường lên men Với α-amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thành glucose và maltose đến 70-75% Còn với α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể đến 84-87%

70-Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α-amylase vi khuẩn Bac.subtilis ở giai đoạn đầu cao hơn α-amylase Asp.oryzae tới 20% và giảm mạnh khi đạt được 30-32% sự thủy

phân

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α-amylase [18,21,26,30]

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau

pH:

- α-amylase từ nấm mốc có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5÷4,8; pH tối thích của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,7÷5,4) và của vi khuẩn là 5,8÷6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 ÷7,0)

- Theo số liệu của Liphsis (2000), pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường

hóa của chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae giống nhau và nằm trong vùng pH

5,6÷ 6,2 Còn theo số liệu của Fenixova (2001) thì pH tối thích hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0÷7,0

- Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α-amylase của nấm mốc

Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15–30 phút; α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt 50%; trong khi đó hoạt lực của

α-amylase từ nấm mốc hầu như không giảm bao nhiêu (Fenikxcova, Ermoshina, 2005)

- Trong dung dịch amylase của nấm mốc được bảo quản tốt ở pH 5,0÷5,5; amylase dextrin hóa của nấm mốc đen có thể chịu được pH 2,5÷2,8 Ở 0oC và ở

α-pH 2,5 nó chỉ bị vô hoạt sau 1 giờ (Bernfeld, Okazaki, Kitahara, Kusushima, Ermoshina, 2005)

- Ngoài α-amylase không bền trong môi trường acid ra, các loại nấm mốc

Asp.awamori, Asp.Butatea, Asp.usamii còn tạo ra tới 5 – 10% α-amylase bền acid

Trong khi đó nấm mốc Asp.niger 475 lại chỉ tạo ra các α-amylase bền acid Nó

không bị mất hoạt tính ở pH 2,5; nhiệt độ 30oC trong vòng 1 giờ

Bảng 1.2: Độ bền acid của α-amylase mốc đen [30]

Chủng

Hoạt độ dextrin hóa tổng số

(đv/ml)

Hoạt độ dextrin hóa bền acid

(đv/ml)

Hoạt độ dextrin hóa bền acid, so với hoạt độ tổng số (%)

Nhiệt độ:

- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau

cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy với tác động của nhiệt,

nhiệt độ tối thích của nó là 50oC, α-amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt

hơn và hoạt động tối thích 58 – 60 oC Trong sản xuất rượu người ta thường đường

hóa bằng canh trường nấm mốc ở 50 – 52oC, và bằng malt ở 60 – 65oC, α-amylase

của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả Nhiệt độ tối thích của nó là 70- 75 oC

(Liphsis, Bragnitsenko, 1997), α-amylase của Bac.stearothermophilus…vẫn giữ

được hoạt lực trong một thời gian dài ở 85oC và cao hơn nữa (Manning Campbell,

Karpukina, 2001)

- α-amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92oC trong khi đó α-amylase

của nấm mốc bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 2002) Trong dung dịch hồ tinh bột,

α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt nhanh chóng khi nhiệt độ cao hơn 77oC Ở 70oC,

α-amylase của nấm mốc đã bị mất 50% hoạt lực, còn α-amylase của malt hầu như

- Trong dung dịch đệm pH 4,7: α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của

nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22–

29%, hoạt lực đường hóa còn 27–85% Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nó bị

vô hoạt hóa hoàn toàn

- Miller và cộng sự còn nhận thấy rằng α-amylase của vi khuẩn có thể giữ được một phần hoạt lực thậm chí ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn Tính bền nhiệt của α-amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn Trong sản xuất, α-amylase của vi khuẩn được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng ở

nhiệt độ cao Ở Tây Đức đã tuyển chọn được một chủng Bac.subtilis mà

α-amylase của nó không khác gì của vi khuẩn thông thường về đặc tính tác dụng lên tinh bột, song lại có độ bền nhiệt khá cao (Sprister, Uhlig, 2000) Tính chất α-

amylase của chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho Bac.subtilis; pH tối thích

6,0; bị vô hoạt hoàn toàn ở pH 4,0 và bị vô hoạt một nửa ở pH 8,0

- Những khác biệt về tính chất như nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của α-amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn cho việc ứng dụng chúng 1 cách hợp lý và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất

Nồng độ cơ chất:

- Nồng độ cơ chất ảnh hưởng khá mạnh đến khối lượng và chất lượng của sản phẩm thủy phân do sự phân cắt của α-amylase Nhìn chung nếu nồng độ cơ chất khá loãng, lượng đường tạo ra theo cơ chất càng nhiều, đặc biệt là nhóm đường thấp phân tử có khả năng lên men được Tuy nhiên, tương quan đó không phải là tỷ lệ thuận

- Ngoài ra, gần đây, các nhà nghiên cứu đã tìm hiểu và thấy rằng thành phần amylose, amylopectin và cấu trúc tinh bột cũng là những yếu tố ảnh hưởng khá mạnh đến tác dụng thủy phân của enzyme α-amylase Nguồn tinh bột khác nhau cùng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khác nhau

1.2.6 α-amylase từ vi khuẩn Bac.licheniformis [6,17]

Bacillus được xem là giống vi sinh vật quan trọng nhất để sản xuất α-amylase

trong công nghiệp Đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất α-amylase bền nhiệt từ các

chủng Bac.amyloliquefaciens và Bac.licheniformis

α-amylase bền nhiệt từ Bac.licheniformis được nghiên cứu tách trong hệ hai pha

PEG/dextran, sau đó cho chạy qua hệ sắc kí lọc gel và sắc kí trao đổi ion (Ivanova, 1993) Sử dụng gradient pH là một phương pháp thường được sử dụng trong công nghiệp để tinh sạch enzyme Dobransky đã dùng phương pháp này để tinh sạch α-

amylase từ các chủng Bac.subtilis khác nhau Các pick thu được có độ phân tách tốt,

lượng dung dịch enzyme ban đầu có thể đạt tới 1000L, với nồng độ protein 3g/100mL, tinh sạch α-amylase sản xuất bởi chủng gen bằng phương pháp sắc kí

miễn dịch cũng đang được quan tâm (Pandey, 2000)

Các tính chất của α-amylase ngoại bào dường như phản ánh điều kiện pH và

nhiệt độ môi trường sống Bac.flavothermus phát triển trong môi trường pH 6,0 và

nhiệt độ 65oC tổng hợp α-amylase có pHopt và toopt tương ứng là 5,5–6,0 và 60oC Một

số tính chất ngoại bền nhiệt từ Bac.subtilis đã được nghiên cứu, khả năng bền nhiệt

của enzyme phụ thuộc vào hàm lượng Ca2+, enzyme bị vô hoạt mạnh bởi EDTA và N–bromosucinimide Một số tác giả đã nghiên cứu tính chất của α-amylase có nguồn

gốc từ chủng Bac.subtilis (57700Da); chúng bị vô hoạt bởi các kim loại như Hg2+,

Fe3+, Al3+ và được kích hoạt bởi Mn2+,Co2+ đã thu nhận được amylase nội bào của

Bac.subtilis SUH4–2 với tỷ lệ monomer/dimer tương ứng là 3/2 trong đệm phosphate

pH 7,0 Enzyme này được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình đồng hóa cacbon ở cytoplasm Các dạng α-amylase biến tính và sau khi khôi phục hoạt tính của

Bac.subtilis cũng được nghiên cứu nhở sử dụng phát xạ huỳnh quang (Cho, 2000)

1.2.7 Ứng dụng của enzyme α-amylase [11]

Ngày nay các amylase từ vi sinh vật đã thay thế acid trong công nghiệp thủy phân tinh bột, đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia Các enzym có độ tinh sạch cao và những tính chất phù hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược và công nghệ hóa chất tinh khiết

Nhờ thành tựu của công nghệ sinh học, ứng dụng của amylase đang mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác Một số amylase và lipase đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học Có nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng amylase

Hệ phân tích Ciba Corning Express dựa trên dung dịch thuốc thử chứa amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao, α-amylase được sử dụng trong phân tích cyclodextrin

Đa số glucoamylase đều thuộc loại chịu acid, pHopt 3,5÷5, topt = 50 – 60oC, mất hoạt tính ở t > 70oC Hiện nay enzyme này ở vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột và các sản phẩm trung gian Trong sản xuất siro glucose, glucoamylase được sử dụng để đường hóa dịch tinh bột sau quá trình dịch hóa Trong sản xuất cồn, glucoamylase là yếu tố làm tăng hiệu suất vì nó giúp quá trình đường hóa được triệt

để hơn Điều kiện hoạt động của glucoamylase từ các nguồn gốc khác nhau cũng sẽ khác nhau Đa số các glucoamylase có nguồn gốc từ vi sinh vật có pH hoạt động ở

vùng acid, ngoại trừ glucoamylase của S italicus có pH hoạt động ở vùng trung tính

Các glucoamylase của nấm sợi và mô động vật rất bền và có độ ổn định cao trong

môi trường acid Chẳng hạn như glucoamylase được tách từ Rhizopus delemar chỉ

mất 20% hoạt lực sau 9 ngày ở điều kiện pH 2,4 và 5 – 10oC Ngoài ra pH tối thích của glucoamylase còn thay đổi theo nhiệt độ và thời gian tác dụng Phần lớn những sản phẩm thương mại của glucoamylase ở dạng lỏng đã được ổn định với NaCl hay glycerol

Những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp glucoamylase được sử dụng

trong công nghệ là: Asp Awamori, Asp Niger, Asp Usami, Asp Oryzae, Endomyces

sp, Endomycopsis Capularis, Endomycopsis fibuliger, Rhizopus delemar, RhizopusJavanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus peka, Rhizopus tonkinensis

Bảng 1.4: Mối liên quan giữa pHopt và topt của glucoamylase thu nhận từ Rhizopus

delemar [38]

Nhiệt độ pH 50-60 4,7-5

40 4,5 Bảng 1.5:Mối liên quan giữa pHopt với thời gian tác dụng của glucoamylase thu

nhận từ Endomycopsis [38]

Thời gian tác dụng(phút) pH

>30 4,7-5,6 Bảng 1.6: Một số tính chất khác nhau của glucoamylase thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau [38]

độ của tinh bột

Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ thủy phân tinh bột là yếu tố quyết định cường độ và chiều hướng tiến triển của các phản ứng enzyme Trong khoảng có ý nghĩa công nghệ, nếu nhiệt độ thủy phân tăng thì khả năng phản ứng của các phân tử cơ chất cũng tăng do đó mà động năng phản ứng cũng tăng

Mỗi enzyme đều có nhiệt độ và vùng nhiệt độ tối ưu Quá trình đường hoá nguyên liệu trong sản xuất ethanol, nhiệt độ tối ưu của enzyme α-amylase, glucoamylase thường sẽ không trùng lặp với nhiệt độ tối ưu ở môi trường thuần khiết vì tác động tương hỗ giữa các yếu tố khác nhau trong quá trình đường hoá (pH, nồng độ

cơ chất, chất kìm hãm…)

Nghiên cứu của Satish D Shewale và Anihuddha B Pandit cho thấy rằng, nhiệt độ 95oC là nhiệt độ tối thích của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ Bacillus

licheniforms, tức là tại nhiệt độ này hàm lượng đường khử tạo thành từ quá trình

đường hoá tinh bột lúa miến (sorghum) cao nhất

Ảnh hưởng của pH:

pH của dịch tinh bột là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến động lực học của quá trình thủy phân và đường hoá pH cho phản ứng thủy phân tinh bột không trùng hợp với pH tương ứng khi bảo quản, khi bảo quản thường giữ pH cao hơn so với khi đường hoá Aggarwal và cộng sự cũng khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đường hoá trong quá trình thủy phân tinh bột lúa miến và sắn Theo nghiên cứu này,

pH tạo huyền phù nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất đường hoá

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Phản ứng thủy phân tinh bột bởi hệ enzyme α-amylase, glucoamylase nói riêng

và phản ứng xúc tác bởi enzyme nói chung, khi tăng lượng enzyme thì tốc độ thủy phân tinh bột tăng và tỷ lệ thuận với hàm lượng enzyme đưa vào Tuy nhiên, tốc độ thủy phân tinh bột chỉ tăng trong thời gian đầu của quá trình đường hoá, sau đó hầu

như không tăng nữa vì lúc đó nồng độ enzyme đã bão hoà so với cơ chất

1.4 Anthocyanin [22,24, 28, 31,32, 39]

1.4.1 Cấu tạo:

Anthocyanin là những glucoside gốc đường glucose, galactose…kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin) Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.3 Các gốc đường có thể gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường gắn vào vị trí 3, 5, còn vị trí 7 rất ít Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí thứ 3 gọi là monoglycoside, ở vị trí thứ 5,7 gọi là diglycoside

Các alugon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 (Jon Wright, 1998)

Mức độ methyl hóa nhóm OH trong vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng gốc đường đính vào nhiều hay ít Tuy nhiên màu anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường

Nói chung anthocyanin hòa tan tốt trong nước, khi kết hợp với đường làm cho phân tử anthocyanin hòa tan một cách dễ dàng hơn Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy Khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510-540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc anthocyanin, chúng phụ thuộc vào

pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin Thường vùng acid có độ hấp thụ lớn, nồng

độ anthocyanin đủ lớn thì độ hấp thụ càng mạnh Ngoài ra, các anthocyanin cũng có thể kết hợp với các ion kim loại tạo ra các phức màu khác nhau: chẳng hạn khi anthocyanin kết hợp với muối kali sẽ cho phức màu đỏ máu, còn khi anthocyanin kết hợp muối canxi và magie sẽ cho phức màu xanh ve Tuy nhiên điều đáng quan tâm nhất vẫn là màu sắc anthocyanin thay đổi theo pH của môi trường:

pH không chỉ ảnh hưởng đến màu sắc của anthocyanin mà còn ảnh hưởng đến tính bền của chúng Anthocyanin bền trong môi trường acid hơn trong môi trường trung tính và kiềm Tuy nhiên, màu của anthocyanin luôn thay đổi trong khoảng pH 1÷14

Khi pH < 7 anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 anthocyanin có màu xanh Ở

pH 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4÷5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH 7÷8 lại về dạng bazơ quinonoidal anhydro màu xanh Bản chất ion của anthocyanin cho phép các thay đổi về cấu trúc phân tử theo pH, dẫn đến màu sắc khác nhau ở các giá trị pH khác nhau

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh

Hình 1.4 Biến đổi cấu trúc của anthocyanin theo các giá trị pH khác nhau [39]

1.4.3 Chức năng:

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin được quan tâm là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng chống oxy hóa cao trong tế bào sống nên có tác dụng chống lão hóa cho người thường xuyên sử dụng rau quả có anthocyanin, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, chống tia phóng xạ

1.4.4 Ứng dụng:

Anthocyanin có tác dụng như chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm Những hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí báu của anthocyanin mà các chất màu hoá học trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào đời sống hàng ngày

Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ màu phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong các loại rau, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo huyết rồng…

Các nghiên cứu xác định được hợp chất polyphenol của vỏ đậu đen gồm các flavonoid Các hợp chất phenol chính trong đậu và vỏ của đậu là các flavonoid như caffeic, p-coumaric, ferulic và ester sinapic Trong đậu đen có 3 loại anthocyanin là delphinidin, petunidin and malvidin Các flavonoid trong vỏ đậu đen được chiết tách bằng methanol, aceton, bằng nước được nghiên cứu các đặc tính chống oxy hoá, giảm tổn thương ở gan, tăng chuyển hoá xương ở chuột, kìm hãm được các tế bào ung thư Gần đây có nhiều nghiên cứu cho thấy dịch chiết bằng methanol 80% từ vỏ đậu chiết được nhiều chất chống oxy hoá hơn, kìm hãm tế bào ung thư ruột, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt hiệu quả hơn dịch chiết nguyên cả hạt đậu

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các enzyme được sử dụng để nghiên cứu là α-amylase, glucoamylase có nguồn

từ Novo Nordisk Đan Mạch Enzyme này được chúng tôi mua tại công ty TNHH Nam Giang 133/11 Hồ Văn Huê, Quận Phú Nhuận, Tp.HCM

2.1.2.1 α-amylase

Chế phẩm α-amylase (E.C 3.2.1.1) với tên thương mại là Termamyl 120L có

nguồn gốc từ Bacillus licheniformis, với hoạt độ được tính theo đơn vị của Novo

Nordisk là 120KNU/g Đơn vị KNU (Kilo Novo alpha amylase đơn vị) là số lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 5,26g tinh bột/giờ trong điều kiện pH 5,6 và nhiệt độ 37oC Vì α-amylase thủy phân liên kết 1,4-α-glucoside nên sản phẩm thủy phân tinh bột là dextrin và oligosaccaride tan trong nước

Một số thông số của chế phẩm α-amylase: toopt= 90-95oC, pHopt = 6÷7

2.1.2.2 Glucoamylase:

Chế phẩm công nghiệp glucoamylase có tên thương mại là AMG 300L từ Aspergillus

niger (E.C 3.2.1.3) với hoạt độ được tính theo đơn vị của Novo Nordisk là

300AGU/g Đơn vị AGU (Novo amyloglucosidase)là lượng enzyme cần thiết để thủy phân tinh bột tạo thành 1µmol maltose /phút với điều kiện pH 4,3 và nhiệt độ 25oC Một số thông số của chế phẩm α-amylase: toopt = 60-65oC, pHopt = 4÷5

2.2 Quy trình công nghệ

2.2.1 Sơ đồ quy trình

Chai, nắp

Hồ hoá Dịch hoá

Termamyl 120L

Lựa chọn Nghiền

Đường hoá Phối chế Chiết rót, đóng nắp

2.2.2 Thuyết minh quy trình

2.2.2.1 Nghiền nguyên liệu [14]

Nghiền nhằm mục đích phá vỡ cấu trúc màng tế bào thực vật, tạo điều kiện giải

phóng hạt tinh bột khỏi các mô, làm cho sự xâm nhập của nước vào nguyên liệu nhanh hơn

2.2.2.2 Hồ hóa nguyên liệu [7, 14, 16, 23]

Trong các dạng nguyên liệu giàu tinh bột như gạo, ngô, khoai, sắn, tinh bột luôn tồn tại ở dạng hạt Khi nghiền chỉ có một phần hạt bị phá vỡ, phần còn lại sẽ khó tiếp xúc được với enzyme (amylase) Mặt khác, tinh bột không hòa tan trong nước, do đó khi đường hóa enzyme tác dụng rất chậm Vì vậy mục đích của hồ hóa là làm trương nở các hạt tinh bột và tạo điều kiện cho chúng bị thủy phân bởi xúc tác của enzyme

Bản chất : Khi huyền phù tinh bột được nâng lên đến giá trị nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của nước, nhiệt năng sẽ làm cho các phân tử nước khuếch tán vào bên trong các hạt tinh bột và liên kết với tinh bột Thêm vào đó, nhiệt độ cao sẽ làm phá hủy liên kết hydro, giữa các phân tử tinh bột giúp chúng dễ dàng bị hydrat hóa

Nhóm Hydroxyl phân cực của tinh bột hấp phụ các phân tử nước hình thành liên kết hydro giữa tinh bột và nước, kết quả làm cho hạt tinh bột trương phồng Các hạt tinh bột trương phồng này kết dính với nhau làm cho độ nhớt của huyền phù tinh bột tăng lên nhanh chóng Một số phân tử tinh bột bị hydrat hóa mạnh mẽ sẽ tách khỏi hạt tinh bột để khuếch tán vào nước làm cho hạt tinh bột hòa tan trong nước nóng

Quá trình hồ hóa không xảy ra nhiệt độ nhất định mà dao động trong một khoảng nhiệt độ

Ban đầu hiện tượng hồ hóa xảy ra ở những vùng vô định hình trong hạt tinh bột, tại đó liên kết tinh bột yếu hơn so với những vùng có cấu trúc tinh thể, vì vậy liên kết hydro giữa các phân tử tinh bột ở vùng đó dễ phân hủy, nhiệt độ hồ hóa thấp Sau đó, nhiệt độ tăng dần để cung cấp thêm năng lượng cho sự phá vỡ liên kết ở những vùng có cấu trúc chặt chẽ hơn trong hạt tinh bột tạo nên liên kết mới giữa tinh bột và nước trong vùng này