Lên men bán rắn đậu đen bằng nấm mốc aspergillus oryzae và ứng dụng trong sản xuất tương đen (hoisine) giàu protein

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xác định điều kiện nuôi c y n m mốc Aspergillus oryzae trên môi trường đậu đen và ứng dụng vào sản xu t sản phẩm tương đen Hoisine ch t lượng cao giàu protein, kh

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ CÔNG HIỆP

LÊN MEN BÁN RẮN ĐẬU ĐEN BẰNG NẤM

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ CÔNG HIỆP

LÊN MEN BÁN RẮN ĐẬU ĐEN BẰNG NẤM

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Người phản iện 1: PGS TS Ngô Đại Nghiệp

Người phản iện 2: GS TS Đống Thị Anh Đào

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng ch m ảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 08 tháng 6 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN TRƯỞNG VIỆN CNSH&TP

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI:

“Lên men bán rắn đậu đen ằng n m mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng trong sản

xu t tương đen (Hoisine) giàu protein”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xác định điều kiện nuôi c y n m mốc Aspergillus oryzae trên môi trường đậu đen

và ứng dụng vào sản xu t sản phẩm tương đen (Hoisine) ch t lượng cao giàu protein, không sử dụng phẩm màu

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo Quyết định số 592/QĐ-ĐHCN về việc giao đề

tài và cử người hướng dẫn luận văn thạc sĩ của Hiệu trưởng trường Đại học Công nghiệp TP HCM ngày 01 tháng 02 năm 2018

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/8/2018

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Tp, Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, với sự giúp đỡ tận tình của Thầy Cô, gia đình

và bằng sự nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn nghiên cứu Để đạt được kết quả này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến:

Cô Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Mặc dù, Cô r t bận rộn với công việc giảng dạy nhưng Cô vẫn luôn theo dõi, hướng dẫn và chỉ bảo giúp tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm trong luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô của Viện công nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường Những kiến thức được tích lũy từ sự giảng dạy tận tình của quý Thầy Cô đã giúp tôi r t nhiều trong quá trình thực hiện

đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Nosafood đã tạo mọi điều kiện tốt nh t để tôi được hoàn thành tốt các thí nghiệm tại Phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm của công ty

Cuối lời tôi xin kính chúc quý Thầy Cô và Ban lãnh đạo công ty dồi dào sức khỏe

và thành công trong cuộc sống!

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ứng dụng hệ enzyme được tiết ra trong quá trình nuôi c y vi sinh vật để tạo sản phẩm giàu protein là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm Nguồn protein từ ngũ cốc được sử dụng làm cơ ch t cho sự phát triển của vi

sinh vật đặc biệt là chủng n m mốc Aspergillus oryzae Đậu đen là một trong những

ngũ cốc giàu protein và đặc biệt có chứa thành phần anthocyanin là hợp ch t flavonoid có khả năng tạo màu tự nhiên cho sản phẩm Mục tiêu nghiên cứu của đề

tài là sử dụng chủng n m mốc Aspergillus oryzae để lên men đậu đen và sử dụng

dịch lên men để sản xu t tương đen giàu protein Các tỷ lệ giống 0,5, 1,0 và 1,5% (so với nguyên liệu đậu đen), tỷ lệ muối phối trộn 16, 18 và 20% (theo khối lượng)

và thời gian ủ mốc lần lượt là 15, 30 và 45 ngày đã được khảo sát với hàm mục tiêu

là hàm lượng protein hòa tan Hàm lượng protein hòa tan được xác định theo

phương pháp Bradford Kết quả khảo sát cho th y sử dụng n m mốc Aspergillus oryzae 1% so với đậu đen, nồng độ muối sử dụng 18% và sau 30 ngày ủ sẽ thu được

dịch đậu lên men có hàm lượng protein hòa tan là 4,44 ± 0,48 (g/100g) Dịch đậu lên men này được sử dụng để sản xu t tương đen (Hoisine) thành phẩm có hàm lượng protein hòa tan cao 3,38 ± 0,10 (g/100g); sản phẩm tương qua xác định r t giàu acid amin như alanine, acid aspartic, leucine, isoleucine, lysine, prolin, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, valine Kết quả của nghiên cứu này có thể triển khai vào sản xu t để tạo ra sản phẩm tương mới giàu protein, an toàn từ đậu

đen, góp phần đa dạng thị trường tương đen truyền thống của Việt Nam

Từ khóa: Lên men bán rắn, đậu đen, nấm mốc Aspergillus oryzae, protein, tương đen, phương pháp Bradford

ABSTRACT

Application of the enzyme system secreted during microorganisms culture process

to make a high-protein product is a commonly method used in food processing Protein from cereals is used as a substrate for the growth of microorganisms,

especially Aspergillus oryzae Black bean is one of rich-protein grains and contains

anthocyanin ingredient - a flavonoid compound coloring products In this study, we

has fermented black beans by Aspergillus oryzae and used their solution to produce high protein drak soysauce The Aspergillus oryzae concentration were investigated

at 0,5, 1 and 1,5% (% wt.) compared with materials, salt were added in the fermented solution at 16, 18 and 20% (% wt.) and then black beans were fermented

in 15, 30 and 45 days, respectively The soluble protein content during the dermentation was determined by the Bradford method The optimal fermention

conditions of black beans were Aspergillus oryzae - black bean ratio of 1 %, salt

content of 18% and 30 days of fermentation At those conditions, the soluble protein content in the fermented solution and final product was 4,44 ± 0,48 (g/100g) and 3,38 ± 0,10 (g/100g), respectively Hoisine sauce was made from black bean and

fermented by Aspergillus oryzae has high amino acid content such as alanine, acid

aspartic, leucine, isoleucine, lysine, prolin, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, valine The results could be implemented industrial scale to produce a new high protein from black bean sauce and contributed to diversify traditional Vietnamese sauce products

Keywords: semi-solid state fermentation, black beans, Aspergillus oryzae, protein, hoisine sauce, Bradford method

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ b t kỳ một nguồn nào và dưới b t kỳ hình thức nào.Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

Lê Công Hiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt v n đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa của đề tài 3

TỔNG QUAN 4

CHƯƠNG 1 Tổng quan đậu đen 4

1.1 Đặc điểm hình thái đậu đen 4

1.1.1 Đặc điểm sinh thái cây đậu đen 5

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng của đậu đen 5

1.1.3 Tổng quan n m mốc Aspergillus oryzae 6

1.2 Hình thái và đặc điểm sinh hóa 6

1.2.1 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của n m mốc Aspergillus oryzae 8

1.2.2 Tổng quan lên men bán rắn 10

1.3 Khái niệm lên men bán rắn 10

1.3.1 Ưu và nhược điểm của lên men bán rắn 10

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men bán rắn 11

1.3.3 Một số nghiên cứu và ứng dụng 13

1.4 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 CHƯƠNG 2

Phương tiện nghiên cứu 17

lượng protein hòa tan 25

Sản xu t tương đen từ dịch đậu đen lên men 27

Đánh giá tính ch t hóa lý của tương đen thành phẩm từ đậu đen so với 3.5

tương thành phẩm từ đậu nành 46

Đo màu tương thành phẩm và đậu lên men 46

3.5.1 Đo c u trúc TPA (texture profile analysis) 48

3.5.2 Hàm lượng và thành phần các acid amin trong sản phẩm tương đen 3.6 (Hoisine sauce) 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 63

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 68

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây và hạt đậu đen 4

Hình 1.2 Bào tử n m mốc Aspergillus oryzae 7

Hình 1.3 Thành phần thể tích dòng khí đi vào và ra trong lên men án rắn 12

Hình 2.1 Sơ đồ nhân giống n m mốc Aspergillus oryzae 20

Hình 2.2 Sơ đồ kiểm tra mật độ giống sản xu t 21

Hình 2.3 Nội dung thí nghiệm thực hiện 23

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 24

Hình 2.5 Quy trình sản xu t tương đen 28

Hình 3.1 Mốc giống Aspergillus oryzae trên môi trường thạch nghiêng 33

Hình 3.2 Mốc giống Aspergillus oryzae trên môi trường PGA đĩa petri và dưới kính hiển vi 33

Hình 3.3 Môi trường nhân giống c p 1 34

Hình 3.4 Môi trường nhân giống c p 2 35

Hình 3.5 Mốc giống sau 48 và 72 giờ nuôi c y 35

Hình 3.6 Quy trình nhân giống n m mốc Aspergillus oryzae c p 1 và c p 2 theo thời gian 36

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giống và hàm lượng protein hòa tan thu được 38

Hình 3.8 Hình ảnh dịch đậu đen lên men sau 15 ngày ủ với các tỷ lệ giống 0,5, 1,0 và 1,5% so với nguyên liệu đậu đen 40

Hình 3.9 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ muối và hàm lượng protein hòa tan thu được 41

Hình 3.10 Hình dịch đậu đen lên men sau 15 ngày ủ với tỷ lệ giống 1,0% so với nguyên liệu đậu với các nồng độ dung dịch muối 16, 18 và 20% 42

Hình 3.11 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa thời gian ủ và hàm lượng protein hòa

tan thu được trong quá trình lên men 43Hình 3.12 Hình dịch đậu đen lên men với tỷ lệ giống 1,0% so với nguyên liệu đậu

đen, nồng độ muối 18% được ủ với thời gian 15, 30 và 45 ngày 44Hình 3.13 Hình tương thành phẩm từ đậu đen và đậu nành lên men 48Hình 3.14 Sắc ký đồ acid amin trong đậu đen và tương đen thành phẩm 53

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 19

Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn Bradford 30

Bảng 3.1 Kết quả phân tích các thành phần cơ ản của nguyên liệu 31

Bảng 3.2 Kết quả xác định mật độ tế bào n m mốc trên 1g giống sản xu t/môi trường PGA 37

Bảng 3.3 Tỷ lệ mốc giống sử dụng và hàm lượng protein hòa tan 38

Bảng 3.4 Nồng độ muối sử dụng 40

Bảng 3.5 Thời gian ủ và hàm lượng protein thu được 42

Bảng 3.6 Thành phần nguyên liệu sản xu t tương đen (Hoisine sauce) 45

Bảng 3.7 Kết quả OD595nm và hàm lượng protein hòa tan tương ứng của sản phẩm tương đen (Hoisine sauce) 45

Bảng 3.8 Kết quả đo màu L*a* * của tương đen thành phẩm 47

Bảng 3.9 Kết quả đo c u trúc mẫu tương thành phẩm đậu nành và tương thành phẩm đậu đen 49

Bảng 3.10 Hàm lượng acid amin trong nguyên liệu đậu đen và sản phẩm tương đen (Hoisine sauce) tính trên 100g 51

Bảng 3.11 Hàm lượng acid amin trong nguyên liệu đậu đen và sản phẩm tương đen (Hoisine sauce) tính trên 100g ch t khô 52

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

C&PTSP Nghiên cứu và phát triển sản phẩm

TPA Texture profile analysis

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đa dạng hóa sản phẩm là mục tiêu luôn luôn song hành cùng với sự phát triển của một doanh nghiệp sản xu t Xã hội ngày càng phát triển, nhận thức của người tiêu dùng ngày càng được nâng cao; do đó con người ngày càng quan tâm hơn đến ch t lượng sản phẩm mà họ tiêu dùng hàng ngày Trong số các sản phẩm thực phẩm mà người tiêu dùng sử dụng thì tương đen (Hoisine) là một sản phẩm thực phẩm được sản xu t từ đậu nành lên men nhưng hiện nay trên thị trường ch t lượng sản phẩm tương đen cũng đáng áo động với những sản phẩm có hàm lượng protein không cao, được sản xu t với quy trình kém vệ sinh, sử dụng phẩm màu và nhiều phụ gia không an toàn Trong số các nguồn protein con người sử dụng thì protein từ thực vật đang được quan tâm sử dụng trong thời đại ngày nay, đặc biệt là protein từ các loại hạt ngủ cốc, các loại đậu

Cây họ đậu có chứa đến 20,5 – 31,7% protein, 1,14 – 3,03% ch t béo, 4% xơ, 56 – 67% carbohydrate, và có thành phần các acid amin thiết yếu [1, 2] Trong đó, đậu nành là một nguồn protein tuyệt vời với các acid amin thiết yếu, có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của con người và được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp chế biến [3] Tuy nhiên, hạt đậu đen không chỉ là một nguồn nguyên liệu cung c p giàu protein với các thành phần acid amin thiết yếu mà trong hạt đậu đen còn có thành phần anthocyanin là hợp ch t flavonoid có khả năng tạo màu cho sản phẩm [4] Vì vậy, hạt đậu đen được chọn làm nguyên liệu để thực hiện nghiên cứu

Xu t phát từ thực tế đó, đề tài: “Lên men bán rắn đậu đen bằng nấm mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng trong sản xuất tương đen (Hoisine) giàu đạm” –

sẽ tạo ra một dòng sản phẩm tương đen dinh dưỡng có hàm lượng protein cao với màu anthocyanin tự nhiên (từ đậu đen) an toàn cho sức khỏe của người tiêu dùng và

đa dạng hóa dòng sản phẩm tương đen truyền thống

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên

men của đậu đen từ n m mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng dịch đậu đen sau lên

men để sản xu t tương đen (Hoisine sauce) giàu protein, an toàn không sử dụng phẩm màu thực phẩm

Đa dạng hóa sản phẩm, tạo ra dòng sản phẩm tương đen mới với màu tự nhiên từ các hợp ch t anthocyanins có trong nguyên liệu đậu đen

Với các mục tiêu cụ thể sau:

− Xác định thành phần trong nguyên liệu đậu đen

− Nuôi c y và nhân giống n m mốc Aspergillus oryzae trên môi trường PGA và

trên các môi trường nhân giống trung gian

− Khảo sát điều kiện lên men đậu đen ằng n m mốc Aspergillus oryzae: tỷ lệ mốc

giống so với nguyên liệu đậu, nồng độ muối sử dụng và thời gian ủ với hàm mục tiêu là hàm lượng protein hòa tan trong dịch đậu lên men

− Sản xu t tương đen (Hoisine sauce) từ dịch đậu đen lên men

− Đánh giá tính ch t hóa lý và giá trị dinh dưỡng của tương thành phẩm

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: đậu đen sử dụng phục vụ cho nghiên cứu trong luận văn là

đậu đen được mua từ công ty Xuân Hồng; n m mốc Aspergillus oryzae do phòng

nghiên cứu và phát triển sản phẩm (NC&PTSP) công ty cổ phần Nosafood cung

c p

Phạm vi nghiên cứu: sử dụng n m mốc Aspergillus oryzae để lên men đậu đen và sử

dụng dịch đậu đen sau lên men để sản xu t tương đen (Hoisine sauce) giàu dinh dưỡng và an toàn khi sử dụng

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Xác định thành phần trong nguyên liệu đậu đen (độ ẩm, hàm lượng tro tổng, hàm lượng car ohydrates, hàm lượng đạm, béo, thành phần và hàm lượng các acid amin)

Sản xu t mốc giống Aspergillus oryzae bằng phương pháp nuôi c y vi sinh, từ

giống trong ống nghiệm trên môi trường PGA được nhân giống trên các môi trường trung gian để tạo ra mốc giống phục vụ cho việc nghiên cứu

Khảo sát các điều kiện lên men của n m mốc Aspergillus oryzae trên đậu đen ằng

phương pháp lên men án rắn

Ứng dụng dịch đậu đen lên men sản xu t tương đen (Hoisine) thành phẩm giàu protein với các acid amin thiết yếu và sử dụng màu anthocyanins tự nhiên có trong nguyên liệu đậu đen để tạo màu cho sản phẩm; tạo ra dòng sản phẩm không sử dụng phẩm màu

5 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học: nghiên cứu ứng dụng lên men bán rắn trên đậu đen để tạo sản phẩm tương mới giàu protein và có hoạt tính sinh học

Ý nghĩa thực tiễn: ứng dụng sản xu t tương đen giàu dinh dưỡng và an toàn, đa dạng dòng sản phẩm tương phục vụ cho người tiêu dùng

TỔNG QUAN CHƯƠNG 1

Tổng quan đậu đen

1.1

Hình 1.1 Cây và hạt đậu đen

Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrica ( L.) Skeels hoặc có từ đồng nghĩa là Vigna unguiculatathuộc họ fabaceae phân bố chủ yếu ở vùng châu Á, Nigeria, Mỹ,

châu Phi đặc biệt phổ biến ở vùng sub-Saharan Africa, phía tây Brazil và phía bắc Ghana [5]

Đặc điểm hình thái đậu đen

1.1.1

Đậu đen là loài cây phân họ Đậu mọc hằng năm, toàn thân không lông Lá kép gồm

3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai ên Hoa màu tím nhạt Quả giáp dài, tròn, trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen Tại Việt Nam, ngoài giống cây trồng thường th y có màu đen, còn gọi là đậu dải đen, có nhiều giống cho hạt có màu khác như đậu đỏ, đậu trắng, đậu trứng cuốc, đậu mắt cua, đậu trắng Lạng Sơn, đậu dải trắng rốn đỏ, đậu dải trắng rốn đen [6]

Đối với hạt, đậu đen là loại đậu cỡ trung bình, có hình oval và lớp vỏ màu đen mờ Chúng cũng được gọi là đậu rùa Chúng có hương vị ngọt với c u trúc mềm Chúng

là những hạt đậu phổ biến ở các nước Trung Mỹ, Nam Mỹ và Caribe [7]

Đặc điểm sinh thái cây đậu đen

1.1.2

Sự sinh trưởng và phát triển của đậu đen được nghiên cứu trong môi trường nhiệt đới Theo EJ Littleton và MD Dennett, diện tích lá đậu đen tăng nhanh hơn và cái chết của lá bắt đầu sớm hơn trong mùa m, tốc độ giãn nở trung bình của lá tăng theo nhiệt độ Nhiệt độ cho sự nảy mầm và giãn nở của lá lần lượt là 16 và 20°C [8]

Khi được trồng trong nhà kính để thu hoạch lá chồi non, đậu đen đạt năng su t cao

nh t tại thời điểm 50 ngày sau khi gieo trồng Ngoài ra, các yếu tố mật độ cây và thời gian thu hoạch cũng ảnh hưởng đến trọng lượng chồi và trọng lượng ch t khô

ăn được [9]

Một nghiên cứu khác về đậu đen ở miền nam Nigeria cho th y, thời gian trồng ảnh hưởng đáng kể đến ch t lượng vụ mùa, năng su t và thiệt hại côn trùng Vào vụ trồng tháng Tám, thiệt hại côn trùng lớn nh t Maruca testulalis (sâu đục trái đậu) gây hại nghiêm trọng nh t, bọ trĩ ảnh hưởng ít nh t Khi gieo trồng đầu mùa, năng

su t hạt khô cao hơn nhưng gieo trồng cuối vụ thì ch t lượng thu hoạch tốt hơn [10] Có thể trồng xen đậu đen và cao lương để ức chế sâu hại và côn trủng gây bệnh, tăng năng su t vụ mùa [10]

Giá trị dinh dưỡng của đậu đen

Đậu đen giàu vitamin A&C, thiamin, riboflavin, niacin, vitamin B6, pantothenic acid và một hàm lượng nhỏ foliate Rễ và lá của đậu đen là nguồn giàu calcium,

phosphorous và Vitamin B Đậu đen còn là nguồn giàu các acid amin thiết yếu, các hợp ch t có hoạt tính sinh học [13]

Trong hạt đậu đen có chứa khoảng 0,18% – 0,59% tannins, phenolic acids, như hydroxibenzoic acid, protocatechuic acid, 2,4-dimethoxibenzoic acid, và các dẫn

p-xu t của cinnamic acid, như p-coumaric acid, caffeic acid, cinnamic acid và ferulic acid Các amino acid được từ chiết xu t của hạt đậu đen được phân tích như sau: aspartate (27,8%), threonine (3,3%), serine (2,6%), glutamine (43,5%), proline (17,6%), glycine (9,5%), alanine (18,7%), cysteine (3,6%), valine (8,0%), methionine (3,2%), isoleucine (5,3%), leucine (5,4%), tyrosine (0,5%), phenylalanine (5,5%), histidine (4,5%), lysine (0,5%), arginine (14,3%) và tryptophan (0,5%) [12]

Một nghiên cứu khác về hạt đậu đen s y khô đã được nghiên cứu Hạt đậu đen đã

s y có thành phần protein thô, ch t béo thô, tro và ch t chiết xu t không chứa nitơ lần lượt chiếm 29, 10, 4 và 53% [14]

Giá trị năng lượng của 100g ch t khô của nguyên liệu hạt là 1737KJ Các acid amin thiết yếu, isoleucine, lysine, tyrosine và phenylalanine hiện diện ở nồng độ cao hơn lần lượt là 124,3; 79,5 và 79,1mg/100g protein thô Các acid béo không bão hòa chiếm hơn 60% tổng số acid béo Hạt đậu đen đã s y là một nguồn khoáng ch t tiềm năng như kali, canxi, phốt pho, kẽm và sắt Đồng thời, ảnh hưởng của việc n u

ăn đối với các yếu tố dinh dưỡng cũng được thử nghiệm N u ăn gây ra giảm tương ứng 0,02%, 0,59% và 0,36% trong các thành phần khoáng ch t của kali, canxi và phốt pho [14]

Tổng quan nấm mốc Aspergillus oryzae

1.2

Hình thái và đặc điểm sinh hóa

1.2.1

Aspergillus oryzae là một loại n m mốc nổi tiếng và có vai trò quan trọng trong sản

xu t nhiều loại đồ uống và thực phẩm truyền thống của nhiều quốc gia trên thế giới như Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc,…với các sản phẩm nổi tiếng như

rượu sake, miso, nước tương [15]

Bào tử n m mốc Aspergillus oryzae như hình 1.2

Hình 1.2 Bào tử n m mốc Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae được phân loại như sau:

 Loài: Aspergillus oryzae

Cơ thể sinh trưởng của n m mốc Aspergillus oryzae là một hệ sợi bao gồm những

sợi r t mảnh, chiều ngang 5 – 7 µm, phân nhánh r t nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (n m đa ào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính ào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính

Cuống đính ào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1 – 2 mm nên có thể nhìn th y

bằng mắt thường Phía đầu cuống đính ào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế ào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính

bào tử Đính ào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau Đặc điểm của giống Aspergillus oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và

ngoại ào (amylase, protease, pectinase,…) Chúng mọc và phát triển có khi thành

lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Các ào tử này dễ bị gió cuốn bay xa khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae 1.2.2

Độ ẩm môi trường

1.2.2.1

Độ ẩm tốt nh t cho sự hình thành enzyme của n m mốc Aspergillus oryzae là 55 –

60% Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển Hoạt độ nước (aw) là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của n m mốc Theo nghiên cứu của John I Pitt và Beverly F Miscamble [16] thì hoạt độ nước cho sự phát triển của

n m mốc Aspergillus flavus, A nomius, A oryzae và A parasiticus dao động từ 0,996 đến 0,75 và phụ thuộc vào nhiệt độ Aspergillus flavus A oryzae và A parasiticus có hoạt độ nước cho sự phát triển tương đối giống nhau: ở 25oC là 0,82,

ở 30o

C là 0,81, ở 37oC là 0,80 A nomius có hoạt độ nước cho sự phát triển có khác

hơn các loài còn lại một chút, cụ thể: ở 25o

C và 30oC là 0,83, ở 37oC là 0,81 [16]

Ảnh hưởng của oxi

1.2.2.2

N m mốc Aspergillus oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình

thường khi đầy đủ oxi Tốc độ h p thụ O2 tăng trong giai đoạn tăng trưởng logarit

và cho th y đỉnh ở giá trị hệ số hô h p (respiratory quotient – RQ) khoảng 1,0, sau

đó thì giảm song song với giá trị RQ Giai đoạn kết thúc sự tăng trưởng logarit trùng với thời kỳ mà tốc độ h p thụ O2 ở mức cao nh t và giá trị RQ bắt đầu giảm Tốc độ

h p thụ O2 gần như không đổi với cùng nhiệt độ nuôi c y t kể điều kiện hoạt độ nước Tốc độ h p thụ O2 tăng lên khi tăng nhiệt độ nuôi c y và giá trị tối đa của tốc

độ được dự kiến là giữa nhiệt độ nuôi c y là 35 và 40°C, cao hơn nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng [17]

Tốc độ h p thụ O2 trong môi trường nuôi c y tăng gần như tuyến tính với thời gian nuôi c y ở giai đoạn đầu và đạt cực đại sau đó giảm Tốc độ h p thụ O2 tăng lên khi tăng nhiệt độ nuôi c y nhưng tốc độ này ở mức độ th p trong điều kiện aw th p và cũng giảm ở 40°C so với các môi trường nuôi c y ở 20°C Giá trị RQ ở 30°C nằm

trong khoảng 0,95 đến 1,0 độc lập với điều kiện aw trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi c y và suy giảm dần theo sau [17]

Đối với sự tăng trưởng của n m mốc A oryzae, trong giai đoạn tăng trưởng logarit

tổng lượng O2 tiêu thụ có thể được sử dụng để đánh giá sự tăng trưởng vì tổng lượng O2 tiêu thụ tăng theo logarit với giá trị RQ là 0,9 đến 1,09 (trung bình 0,98) trong khoảng thời gian nuôi c y (khoảng 22h) Điều kiện môi trường cũng ảnh

hưởng nh t định đến chiều dài của sợi n m Sự tăng trưởng logarit của A oryzae

trên môi trường bán rắn được duy trì với điều kiện cung c p đủ đường và sự chậm phát triển xảy ra khi có sự thiếu hụt đường phản ánh sự suy giảm giá trị RQ song song với việc giảm tốc độ h p thụ O2 [17]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

pH thích hợp cho n m mốc Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu

khoảng 5,5 – 6,5, các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này [18] Theo công bố của Morten Carlsen và cộng sự (1995) [18] đã cho th y ở giá trị pH r t th p (pH < 2,5), sợi n m không hình thành và thành tế bào bị sưng lên, dẫn đến tăng trưởng r t kém Những kết quả này cho th y c u trúc thành tế bào bị suy yếu ở pH th p Ở pH 3,0 đến 3,5, các sợi n m phân tán tự do đã xu t hiện Trong phạm vi pH từ 4 đến 5, khuẩn lạc và sợi n m được quan sát có sự phát triển

Ở pH 6 có sự tăng trưởng rõ rệt của n m mốc Khi pH cao hơn 4, các tập hợp khuẩn lạc có chứa 10 đến 100 bào tử được quan sát, trong khi ở pH th p (2,5 đến 3,5) chỉ tìm th y các bào tử phân tán tự do Tốc độ sản xu t α-amylase tối ưu trong khoảng pH từ 5 đến 7 Ở pH cao hơn 7 hoặc th p hơn 4 sản xu t α-amylase r t kém

Tổng quan lên men bán rắn

c p ch t dinh dưỡng và phải đủ độ ẩm cho vi sinh vật phát triển [19]

Lên men bán rắn thường được thực hiện trên các khay với các lỗ thoáng khí bên dưới, trên các túi nhựa hay các ống hình trụ Theo M Raimbault và cộng sự [20] nguyên liệu dùng làm cơ ch t cho quá trình lên men bán rắn thường là các nguyên liệu rẻ tiền, phế phẩm trong nông nghiệp

Ưu và nhược điểm của lên men bán rắn

1.3.2

Lên men bán rắn có một số ưu điểm được ứng dụng trong công nghệ sinh học mặc

dù chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm như năng su t lên men cao, hiệu su t sản phẩm cuối cao, độ ổn định của sản phẩm cao, nuôi c y các vi sinh vật chuyên biệt trên các

cơ ch t rắn, đặc biệt là môi trường nuôi c y không cần độ vô trùng cao do hoạt độ nước trong môi trường nuôi c y bán rắn th p [21]

Sự không đồng nh t của cơ ch t rắn được xem là nhược điểm của lên men bán rắn Khi thu hồi sản phẩm từ công nghiệp sản xu t các acid hữu cơ, enzyme, các sản phẩm trao đổi ch t thứ c p bằng kỹ thuật lên men bán rắn thường sót lại phần ch t

cơ rắn dư không lên men Phần vật liệu này có hoạt tính probiotic có thể dùng trực tiếp làm thức ăn chăn nuôi hay là nguyên liệu phối trộn trong công nghệ sản xu t thức ăn hỗn hợp [22, 23]

Sự khác biệt chính giữa lên men bán rắn và lên men chìm có liên quan đến các tính năng lý – hóa khác nhau như là: a) sự đảo trộn và khuếch tán của cơ ch t và sản phẩm trong sinh khối ở lên men bán rắn ít hơn nhiều; b) khả năng hoà tan và khuếch tán của oxi cùng các khí không phân cực khác trong lên men bán rắn mạnh hơn; c) nhiệt lượng tiêu tốn cho lên men bán rắn ít hơn; d) lượng nước thải ra trong lên men bán rắn ít hơn so với lên men chìm Những điểm khác biệt này được xem như là các

mặt thuận lợi và hạn chế của lên men bán rắn so với lên men chìm Kết quả của nhiều nghiên cứu đã cho th y được ch t lượng khác nhau giữa lên men bán rắn và lên men chìm Sự khác nhau này là do đặc điểm sinh lý của vi sinh vật không tuân theo một quy luật chung mà phụ thuộc vào từng quá trình nuôi c y, đặc biệt là trong một số các trường hợp liên quan đến việc sản xu t các bào tử n m, enzyme và các sản phẩm trao đổi ch t bậc hai [23, 24]

Viniegra-González và cộng sự so sánh năng su t của các enzyme sử dụng trong lên men bán rắn và lên men chìm và giải thích lý do cho sản xu t cao hơn trong lên men bán rắn Sinh khối cao hơn, sản xu t enzyme cao và phân rã protein th p, góp phần tạo ra sản xu t tốt hơn trong lên men án rắn [25]

N m mốc và n m men là những vi sinh vật thích hợp cho quá trình lên men bán rắn

vì chúng yêu cầu một hoạt độ nước th p cho quá trình phát triển Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn cũng được lên men bằng lên men bán rắn trong thu nhận enzyme như

vi khuẩn Bacillus thuringenesis [26]

Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men bán rắn

1.3.3

V n đề khó khăn thường gặp trong lên men bán rắn là quá trình khu y trộn môi trường, trao đổi nhiệt, thông khí và quá trình kiểm soát độ ẩm, độ pH Đây chính là các yếu tố làm cho lên men bán rắn có phần nào hạn chế khi đưa ra ứng dụng theo quy mô công nghiệp [23, 27]

Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước

1.3.3.1

Lượng nước sử dụng trong lên men bán rắn r t th p Điều này có ý nghĩa thực tiễn cao trong công nghiệp do giảm được lượng nước thải r t nhiều so với lên men chìm [20, 23] Trong lên men bán rắn, có thể xem sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trên cơ ch t rắn không có sự hiện diện của nước tự do Nước trong hệ thống tồn tại ở dạng liên kết với cơ ch t hoặc ở dạng liên kết h p phụ hay liên kết mao quản trong cơ ch t Độ ẩm trong lên men bán rắn ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của

vi sinh vật Không có mức độ ẩm tối ưu cho t t cả các loại cơ ch t và vi sinh vật Thông thường độ ẩm thay đổi từ 30 đến 85% [23, 24] Theo Oriol và cộng sự [28]

trong lên men bán rắn, hàm lượng nước tối ưu của môi trường cơ ch t mà vi sinh

vật phát triển được thể hiện bằng thông số hoạt độ (water activity - a W) Việc giảm

a W sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha lag kéo dài, giảm tỷ lệ tăng trưởng và cuối cùng là hàm lượng sinh khối thu được sẽ th p

Nhu cầu oxi

và đi ra khỏi hệ thống được mô tả như hình 1.3 [27]

Hình 1.3 Thành phần thể tích dòng khí đi vào và ra trong lên men án r ắn

Nhiệt độ và sự truyền nhiệt

1.3.3.3

Nhiêt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến quá trình lên men bán rắn Do đó, việc làm giảm nhiệt độ của cơ ch t trong quá trình lên men bán rắn ở quy mô công nghiệp là nhiệm vụ r t cần thiết Do cơ ch t rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo ra một gradient về nhiệt Khi cơ ch t rắn tích tụ nhiệt

sẽ làm tăng hàm lượng ẩm và gây khó khăn cho quá trình truyền nhiệt V n đề duy trì nhiệt và hàm lượng ẩm ổn định trong lên men bán rắn ở quy mô công nghiệp đang là bài toán nan giải trong kỹ thuật Tuy nhiên, người ta cũng có thể thực hiện được với các thiết bị chuyên dùng đặc biệt [23, 24, 27] Trong thực tế sản xu t tại công ty Nosafood, để khắc phục tình trạng nhiệt độ trong cơ ch t lên men bán rắn (lên men bán rắn đậu nành để sản xu t nước tương) thì giải pháp được đưa ra là sau thời gian cho mốc phát triển trên cơ ch t đậu nành (khoảng 12h) sẽ dùng quạt công nghiệp để thổi vào phòng nuôi c y để tạo sự thông thoáng khí bên trong phòng, giúp cho quá trình truyền nhiệt được thực hiện nhanh chóng để không ảnh hưởng đến quá trình phát triển của n m mốc

Một số nghiên cứu và ứng dụng

1.4

Việc sử dụng n m mốc trong công nghiệp thực phẩm đã được ứng dụng rộng rãi và

có nhiều thành tựu trên thế giới, và có nhiều nghiên cứu và ứng dụng như sau:

Ở Nhật Bản, ứng dụng lên men bán rắn trong sản xu t enzyme, sản xu t nước tương (còn gọi là Koji) Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của n m mốc

Aspergillus oryzae sẽ sinh ra các enzyme amylase và protease, các enzyme này sẽ

thủy phân cơ ch t trong quá trình lên men bán rắn [29] Việc sử dụng n m mốc

Aspergillus oryzae trong lên men được Tominaga và cộng sự nghiên cứu và công bố năm 2006 [30] đã so sánh một số chủng A oryzae với A flavus cho th y rằng so với trình tự A flavus, các gen A oryzae có chứa các đoạn gen sản xu t aflatoxin đã ị đột biến và loại bỏ, thay thế bằng các gen cơ sở Mặc khác, n m mốc Aspergillus oryzae đã được sử dụng ở nhiều thế kỷ trong ngành công nghiệp thực phẩm và

thường được coi là an toàn, và không có chủng A oryzae nào được biết là sản xu t

aflatoxin

S Okrathok và cộng sự (2018) đã thực hiện nghiên cứu “Tác dụng của bột sắn lên

men với Aspergillus oryzae như là một thành phần thức ăn trong chế độ ăn của gà

mái” Nghiên cứu này được thực hiện để khảo sát các tác động của việc sử dụng bột

sắn lên men với Aspergillus oryzae thay thế thành phần thức ăn để cải thiện giá trị

dinh dưỡng trong chế độ ăn của gà mái có thể được sử dụng trong chế độ ăn của gà mái lên đến 24% mà không cho th y tác động tiêu cực đến khả năng tiêu hóa ch t dinh dưỡng, sản xu t trứng, ch t lượng trứng hoặc sinh hóa máu [31]

Kee-Jong Hong, Chan-Ho Lee và Sung Woo Kim đã thực hiện nghiên cứu “Lên men cải thiện ch t lượng dinh dưỡng của đậu nành và các thực phẩm từ đậu nành

bằng chủng n m mốc Aspergillus oryzae GB-107” [32] Nghiên cứu này đã đánh

giá ảnh hưởng của quá trình lên men đến ch t lượng dinh dưỡng của đậu nành và

thực phẩm từ đậu nành Đậu nành và bột đậu nành đã được lên men bởi Aspergillus oryzae GB-107 trong 48h Sau khi lên men, hàm lượng ch t dinh dưỡng cũng như

ch t ức chế trypsin của chúng được đo và so sánh với các loại đậu nành và bột đậu nành thô Đậu nành lên men và bột đậu nành lên men chứa hơn 10% protein thô so với đậu nành thô và bột đậu nành Hàm lượng acid amin thiết yếu là không thay đổi sau khi lên men Lên men loại bỏ hầu hết các ch t ức chế trypsin từ cả đậu nành và bột đậu nành Lên men làm tăng lượng peptide kích thước nhỏ (<20kDa) so với đậu nành thô, trong khi giảm đáng kể peptide kích thước lớn (>60kDa) Bột đậu nành lên men chứa nhiều peptide cỡ nhỏ (<20kDa) so với bột đậu nành Bột đậu nành lên men không chứa peptide kích thước lớn (>60kDa), trong khi 22,1% peptide trong bột đậu nành có kích thước lớn (>60kDa) Tóm lại, quá trình lên men làm tăng hàm lượng protein hòa tan, loại bỏ các ch t ức chế trypsin và giảm kích thước peptide trong đậu nành và bột đậu nành Những tác động của quá trình lên men có thể làm cho thực phẩm từ đậu nành hữu ích hơn trong chế độ ăn uống của con người như một loại thực phẩm chức năng và mang lại lợi ích cho vật nuôi như một thành phần thức ăn mới

Lên men bán rắn được ứng dụng trong công nghệ sinh học như sản xu t các enzyme: phytase, amylase, inulinase, cellulase, protease, alpha-galactosidase, lipase, tannase, laccase, chitinase, L-glutaminase, lipase [33-46] trong sản xu t các acid hữu cơ như là: lactic acid, citric acid

Khảo sát tính ch t và khả năng kháng oxi hóa của ch t màu từ đậu đen dựa trên thay đổi của điều kiện chuẩn bị và tồn trữ [47] Nghiên cứu tiến hành với vỏ đậu đen ở miền nam Việt Nam được tách ra sau khi ngâm, sau đó trích ch t màu bằng nước Ngâm đậu trong dung dịch acid citric 1% có thể bảo vệ anthocyanin và nâng cao nồng độ của chúng trong dịch chiết Hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết khi ngâm trong nước và acid citric 1% lần lượt là 92 và 166mg/L Hạ th p pH của dịch chiết xuống vùng acid dẫn đến sự thay đổi tông màu (từ đỏ nâu sang đỏ) và tác động nhẹ đến khả năng kháng oxi hóa Bột màu được thu từ dịch chiết sau khi loại dung môi có màu tím đen và hàm lượng anthocyanin khoảng 1,1% Sau một tháng tồn trữ

ở nhiệt độ th p và tránh sáng, tổng hàm lượng anthocyanin giảm và bị biến ch t Đặt biệt, hoạt tính kháng oxi hóa của ch t màu vẫn được duy trì theo thời gian tồn trữ

Chiết xu t từ đậu đen giàu anthocyanin: ứng dụng làm màu thực phẩm và tiềm năng chống bệnh tiểu đường [48] Chiết xu t giàu anthocyanin ở pH 2,5 và điều kiện bảo quản 4oC hoạt tính được bảo đảm trong 277 ngày; chiết xu t giàu anthocyanin được

sử dụng như là một nguồn ch t màu tự nhiên và là ch t có hoạt tính sinh học trong việc điều trị bệnh tiểu đường

Chiết xu t từ vỏ hạt đậu đen giàu anthocyanin được ứng dụng trong việc tạo màu cho nước uống thể thao Vỏ hạt đậu đen Idaho và Otomi được chiết xu t trong nước

và acid citric 2% (1/50, v/v) khu y liên tục trong 4h ở 40oC, và lượng anthocyanin thu được 1,83mg và 1,02mgC3G/g, tương ứng với hai loại đậu đen [4]; các chiết

xu t giàu anthocyanin này có thể được ứng dụng là ch t màu tự nhiên thay thế cho màu tổng hợp và có khả năng kháng oxi hóa cao

Việc nghiên cứu lên men bán rắn đậu đen ằng các chủng n m khác nhau

Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizopus azygosporus

và Rhizopus sp No 2 [49] cũng đã được tiến hành và tùy vào loài n m sử dụng

trong quá trình lên men bán rắn khác nhau mà hoạt tính kháng oxi hóa khác nhau như khả năng oxi hóa gốc tự do DPPH, năng lực khử và khả năng khử Fe3+

thành

Fe2+ Đậu đen được lên men sẽ có khả năng oxi hóa gốc tự do DPPH, năng lực khử

và khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ cao hơn đậu đen không lên men

Ngoài ra, Peter R Shewry và cộng sự (2002) nghiên cứu về protein của các loại ngũ cốc và khả năng tận dụng các nguồn ngũ cốc cho chế biến các sản phẩm thức ăn cho người và động vật [50]

Christine Murzyn, Claire Riehle và Maura Killian (2014) đã nghiên cứu và sử dụng bột đậu đen như là một ch t thay thế bột chức năng và là ch t tăng protein và xơ trong công nghệ làm bánh chocolate [51]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa phương pháp sản xu t tương truyền thống với các nghiên cứu đã được công bố nhưng phát triển theo một hướng đi riêng Lần đầu tiên sử dụng đậu đen để sản xu t tương thay đậu nành, làm tăng giá trị protein của thành phẩm và đặc biệt là trong sản phẩm không sử dụng phẩm màu mà tận dụng chính màu tự nhiên của nguyên liệu đậu đen – các hợp ch t anthocyanins – để tạo màu cho sản phẩm tương

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2

Phương tiện nghiên cứu

2.1

Địa điểm và thời gian

2.1.1

Luận văn được thực hiện tại:

 Phòng F6.5 Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, trường Đại Học Công NghiệpThành Phố Hồ Chí Minh – 12 Nguyễn Văn Bảo, phường 4, quận Gò V p,

 Dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, becher (50, 100, 250ml)

 Máy quang phổ so màu

 Thiết bị đo cơ lý tại F4 Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh, model CT3 4500 của hãng BROOKFIELD, 90 – 265V ~ 50/60 Hz, Power 150VA

 Máy đo màu cầm tay Minolta Chromameter (CR-400, Minolta Camera Co., Osaka, Japan)

 Cân điện tử Ohaus, độ chính xác 0,0001g và 0,01g

 Nước c t

 Thuốc thử Bradford, thành phần thuốc thử trong 100ml như sau:

 Coomassie Brilliant Blue: 0,0010g

 Ethanol tuyệt đối: 4,7g

Nguyên liệu đậu đen sử dụng trong nghiên cứu từ nguồn cung c p của Công ty

Xuân Hồng; n m mốc Aspergillus oryzae, muối sử dụng được cung c p bởi phòng

NC&PTSP Công ty cổ phần Nosafood

Phương pháp nghiên cứu

C, áp su t 1,5atm, trong thời gian 15 phút (từ khi đạt nhiệt độ 121o

C) (áp dụng theo cách chuẩn bị mẫu của công ty Nosafood đang sử dụng đối với nguyên liệu đậu nành trong sản xu t tương)

Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

2.2.2

Phương pháp phân tích các chỉ tiêu được thể hiện như ảng 2.1

Bảng 2.1 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

2.2.3

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp Dùng phép kiểm định LSD từ phân tích ANOVA một yếu tố để so sánh sự khác nhau giữa các nghiệm thức, số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm thống kê Statgraphics

Các thí nghiệm được tiến hành theo thí nghiệm dạng chuỗi, kết quả của thí nghiệm trước được chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp sau đó

Phương pháp bố trí thí nghiệm nghiên cứu

2.2.4

Sơ đồ nhân giống nấm mốc Aspergillus oryzae

2.2.4.1

Theo sơ đồ nhân giống đang thực hiện tại công ty cổ phần Nosafood

Hình 2.1 Sơ đồ nhân giống n m mốc Aspergillus oryzae

Thành phần môi trường nhân giống c p 1 và nhân giống c p 2: gạo t m 20% và bắp

đã xay vỡ thành những mảnh nhỏ 50% Gạo t m được n u chín, bắp mảnh được làm

ẩm bằng nước và trộn với cơm đã n u, sau đó đem h p tiệt trùng ở áp su t 1,5atm

và trong thời gian 15’; môi trường nhân giống được làm nguội và c y n m mốc từ các ống nghiệm vào

Môi trường nhân giống c p 1 (được gọi là môi trường bình tam giác) hỗn hợp môi trường sau khi phối trộn được trải vào các hộp nhựa hình hộp chữ nhật với kích thước 12×16×6cm có nắp, trên nắp có đục lỗ nhỏ để thông khí, sau đó đem h p tiệt

Nhân giống c p 1

Nhân giống c p 2

Định kỳ 2 tuần c y truyền giữ giống trên

trùng môi trường này ở 121o

C trong thời gian 15’ và để nguội c y giống n m mốc

Aspergillus oryzae vào, nuôi ở tủ m 32 – 350C trong thời gian 24h

Môi trường nhân giống c p 2 (được gọi là môi trường trung gian) hỗn hợp môi trường sau khi phối trộn được h p tiệt trùng và được để nguội; sau đó trộn với môi trường nhân giống c p 1 (đã được c y giống) và đem trải ra các khay có kích thước dài 40cm, rộng 30cm với bề dày lớp môi trường là từ 1 – 2cm, phía trên được phủ bởi một t m vải được làm ẩm nước và đã được h p tiệt trùng, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 48 – 72h là sử dụng được [52] (thu được giống sản xu t)

N m mốc Aspergillus oryzae được nhân giống và giữ giống trên môi trường thạch

nghiêng potato glucose agar (PGA), môi trường PGA được chuẩn bị như sau: khoai tây rửa sạch loại bỏ vỏ và cắt hạt lựu; đun sôi với 1L nước c t trong 30 phút Lọc qua vải mỏng, thu nước trong và phối trộn với các thành phần khác, đun sôi để hòa tan Chiết rót vào các ống nghiệm và h p tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15’ [53]

Sơ đồ kiểm tra mật độ giống sản xuất (mật độ tế bào/1g giống)

Cân 1g mẫu giống sản xu t định mức thành 100ml bằng nước c t vô trùng, pha loãng đến các nồng độ thích hợp và hút 0,1ml trang trên các đĩa môi trường PGA đã

h p tiệt trùng (mỗi nồng độ sử dụng 3 lần lặp), sau đó đem nuôi ở tủ m (32oC) và đếm khuẩn lạc sau 12h nuôi c y

Mật độ tế bào (CFU/g) được xác định theo công thức: [53]

1 1 i i

N A



Trong đó:

A: số tế ào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) (CFU/g) trong 1g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa c y tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích mẫu (ml) c y vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

N m mốc giống Aspergillus oryzae từ các ống nghiệm sau quá trình nhân giống 2

c p theo sơ đồ nhân giống hình 2.1 sẽ tạo thành giống sản xu t Trước khi tiến hành các khảo sát theo nội dung chi tiết của các thí nghiệm 1, 2 và 3 thì giống sản xu t phải được xác định mật độ tế bào (CFU/1 g giống sản xu t)

Kiểm tra mật độ tế bào giống sản xu t được thực hiện như hình 2.2

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.2.4.3

Nội dung thí nghiệm thực hiện bao gồm 2 nội dung chính:

− Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn của n m mốc

Aspergillus oryzae trên cơ ch t đậu đen

− Ứng dụng dịch đậu đen lên men sản xu t tương đen (Hoisine) giàu protein

Hình 2.3 Nội dung thí nghiệm thực hiện

Từ nội dung thí nghiệm như trên, sơ đồ thí nghiệm tổng quát được bố trí như hình 2.4 Trong hình 2.4 các yếu tố được thể hiện như sau: a1, a2, a3 là tỷ lệ giống sử dụng (tỷ lệ giống so với nguyên liệu đậu đen; 1, b2, b3 nồng độ muối sử dụng; c1,

c2, c3 là thời gian ủ; ax, bx, cx là các giá trị xác định được sau mỗi thí nghiệm dựa trên yếu tố theo dõi là hàm lượng protein hòa tan thu được Nguyên liệu đậu đen sau khi h p tiệt trùng được để nguội tự nhiên xuống 50 – 55oC, sau đó được c y giống sản xu t vào và nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24h, sau đó đậu lên men được

bổ sung thêm dung dịch nước muối và cho vào các hủ thủy tinh để ủ ngoài nắng

Phương pháp thực hiện nghiên cứu được bố trí cụ thể như các phần tiếp theo

Đậu đen

Nội dung 1: khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình lên men đậu đen

bằng n m mốc Aspergillus oryzae

Nội dung 2: Ứng dụng

dịch đậu đen lên men sản

xu t tương đen (Hoisine)

- Xác định công thức sản

xu t tương thành phẩm

- Xác định tính ch t hóa lý: độ màu, c u trúc gel của tương phẩm

- Xác định hàm lượng protein và thành phần acid amin của tương thành phẩm

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

b = 16%

c = 15 ngày

Xác định hàm lượng protein hòa tan

Yếu tố cố định:

ax

c = 15 ngày

Xác định hàm lượng protein hòa tan

Thí nghiệm 3

c1 = 15 ngày c2 = 30 ngày c3 = 45 ngày

cx

Xác định các thành phần cơ bản trong nguyên liệu

2.2.5

Mục đích: xác định các thành cơ ản an đầu trong nguyên liệu đậu đen

Nguyên liệu đậu đen được gửi đến Công ty TNHH Eurofins Sắc ký Hải Đăng địa chỉ Lô E2b-3, đường D6, Khu công nghệ cao, quận 9, TP Hồ Chí Minh (Văn phòng nhận mẫu: Lầu M, 141 Nguyễn Du, quận 1, TP Hồ Chí Minh) để xác định các chỉ tiêu:

lượng protein hòa tan

Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của quá trình lên men n m mốc đến hàm lượng protein hòa tan bao gồm các thí nghiệm 1, 2 và 3 [54]

Khối lượng đậu đen sử dụng cho các thí nghiệm 1, 2 và 3 là 500g; khối lượng dung dịch nước muối sử dụng là 600g

Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ giống sản xuất sử dụng

2.2.6.1

Mục đích: xác định tỷ lệ giống sản xu t sử dụng

Yếu tố khảo sát: khảo sát tỷ lệ giống sản xu t/nguyên liệu đậu đen ở các tỷ lệ: 0,5%, 1% và 1,5% so với khối lượng nguyên liệu đậu đen nghiên cứu (500g) tương ứng với khối lượng giống sản xu t sử dụng là: 2,5g, 5g và 7,5g

Yếu tố cố định:

 Thời gian ủ: 15 ngày

 600g dung dịch muối có nồng độ: 16%