Cơ chế phản ứng thủy phân tinh bột:
Không phụ thuộc nguồn gốc của chất xúc tác, mỗi khi mối liên kết α–1,4–
glucoside bị phân cắt thì tại ngay điểm đó lập tức được liên kết với nhóm ion của nước.
Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột ở trong môi trường giàu nước bởi enzyme α-amylase, người ta thấy rằng, các chất xúc tác bẻ gãy mối liên kết glucoside giữa cacbon số 1 (C1) với nguyên tử oxy. Ở mạch amylose, khi mối liên kết α–1,4–
glucoside bị phân cắt thì nhóm hydroxyl (OH-) sẽ liên kết với cacbon số 1 (C1) của gốc glucoside bên trái, còn cation hydro (H+) sẽ liên kết với O- ở nguyên tử C4 ở gốc glucoside bên phải. Đối với mạch amylopectin, khi mối liên kết α–1,6–glucoside bị cắt đứt, thì nhóm OH- của nước sẽ liên kết với nguyên tử C1 ở mạch chính, còn H+ sẽ liên kết với O- ở nguyên tử C6 ở mạch nhánh.
Trang 13 Một cách tổng quát, nếu tất cả các mối liên kết glucoside của tinh bột bị phân cắt (bao gồm n gốc) thì cần có (n-1) phân tử nước để liên kết với chúng và sẽ tạo ra n phân tử đường glucose. Nhưng vì n là đại lượng lớn cho nên hiệu số n và (n-1) có thể xem là không đáng kể. Lúc đó phương trình thủy phân tinh bột có thể biểu diễn:
( C6H10N5)n + n H2O → n C6H12O6
Nếu chỉ tính cho một gốc glucose thì có thể viết ngắn gọn : C6H10N5 + H2O → C6H12O6
162 18 180
Từ đây ta có thể rút ra kết luận: lượng glucose thu hồi theo lý thuyết từ phản ứng thủy phân hoàn toàn tinh bột bằng 111,11% lượng cơ chất tham gia đầu vào.
Trong thực tế, sản phẩm thủy phân của tinh bột thường tính theo lượng đường maltose, lúc đó sự cân bằng sản phẩm có thể tính theo phương trình :
(C6H10N5)n + n/2 H2O → n/2 C12H22O11
n 162 n/2 18 n/2 342
Một đặc điểm quan trọng nhất của liên kết glucoside trong các polysacchaside là chỉ có các electron mà không có các electron tham gia. Trong trường hợp như vậy, đóng vai trò phân cực là electron . Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm còn gây ra một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử oxy, nên nó tích điện âm.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột chưa hồ hóa nhưng với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình nhiều giai đoạn [18,30]:
- Ở giai đoạn đầu-giai đoạn dextrin hóa- chỉ một số liên kết trong phân tử có thể bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột bị giảm nhanh (cả amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Trang 14 - Ở giai đoạn thứ hai-giai đoạn đường hóa- các dextrin phân tử thấp vừa mới tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không tạo màu với iod. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
- Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (6-7 gốc glucopyranose một). Sau đó các các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục nên các polyglucose này cứ ngắn dần lại và bị phân giải chậm đến maltotetraose, maltotriose và maltose.
- Qua một thời gian dài dưới tác động của α-amylase, sản phẩm thủy phân của α- amylase chứa 13% glucose và 87% maltose.
- Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết α–1,6–glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin thấp phân tử và isomaltose(8%).
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra dextrin thấp phân tử không cho màu với iod và một ít maltose. Vì vậy, người ta thường gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Sơ đồ biểu diễn cho sự thủy phân như sau:
Tinh bột + H2O → Dextrin + Maltose + Glucose + Glycogen nhiều ít
Nhận định này đã tồn tại trong thời gian khá dài. Tuy nhiên, sau đó người ta tìm thấy rằng trong nấm mốc có α-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dextrin hóa cao vừa tạo một lượng đường lớn glucose và maltose.
Pakumuro và cộng sự cho rằng trong số các α-amylase của vi khuẩn có loại α- amylase dextrin hóa, có loại α-amylase đường hóa. Khi thủy phân tinh bột bằng α- amylase đường hóa thì có tới hơn 60% tinh bột bị phân giải, còn bằng α-amylase
Trang 15 dextrin hóa thì mức độ depolymer hóa không vượt quá 30-40% (Robyt, Prench, 1977).
So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa vượt trội hơn là hoạt lực đường hóa. Theo số liệu của Lifsitx và Braznitsenco (2000), khả năng dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ Asp.oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần, còn ở Bac.subtilis thì cao hơn 2 lần.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột không còn nguyên, còn α-amylase của vi khuẩn lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột chưa được hồ hóa lẫn hồ tinh bột (Brovaretx, Popadicts và đồng sự, 1967). Chế phẩm α- amylase của B.subtilis phân giải hạt tinh bột chưa được hồ hóa 2-2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixink, Popadicts, 2001).
Ở các giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do α-amylase của vi khuẩn tạo ra khi phân giải tinh bột có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc.
α-amylase của vi khuẩn Bac.subtilis tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc (G6, G7, G8). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G6 → G1 + G5
G7 → G1 + G6 Hay G2 + G5
G8 → G2 + G6 Hay G3 + G5
(Robyt, French)
Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylose là glucose và maltose. Đối với α- amylase của vi khuẩn, tỷ lệ glucose: maltose thu được là 1:5; còn đối với α-amylase của nấm mốc tỷ lệ này là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1987).
Fenikxova và Ermosina cho biết rằng các maltopentaose và maltohexaose thủy phân theo sơ đồ sau:
G5 → G1 + G4
G6 → G2 + G4 Hay 2G3 Hay G5 + G1
Trang 16 α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn không tấn công liên kết α–1,6–glucoside của amylopectin nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành các dextrin giới hạn phân nhánh.
Sản phẩm đầu tiên của sự phân giải amylopectin bởi α-amylase vi khuẩn là dextrin có 6 gốc glucose, còn sản phẩm cuối cùng glucose, maltose và các maltodextrin (saccharide có phân nhánh) từ các maltodiose đến maltohexaose. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của α-amylase của nấm mốc chủ yếu là maltose, tiếp đến là maltotriose (Sproster, Uhlig, 1987).
Nếu dùng nồng độ α-amylase vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70- 85% tinh bột thành đường lên men. Với α-amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thành glucose và maltose đến 70-75%. Còn với α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể đến 84-87%.
Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α-amylase vi khuẩn Bac.subtilis ở giai đoạn đầu cao hơn α-amylase Asp.oryzae tới 20% và giảm mạnh khi đạt được 30-32% sự thủy phân.