NGHIÊN cứu một số đặc điểm DI TRUYỀN mức tế bào ở một số THỂ BỆNH hội CHỨNG rối LOẠN SINH tủy tại TRUNG tâm HUYẾT học TRUYỀN máu, BỆNH VIỆN BẠCH MAI

Sự phát triển nhanhchóng của các công nghệ sinh học phân tử và tế bào đã làm sáng tỏ thêm về cơ chế sinh lý bệnh học phân tử của hội chứng rối loạn sinh tủy, mang lạinhững tiến bộ lớn tr

HÀ HỒNG QUẢNG

NGHI£N CøU MéT Sè §ÆC §IÓM DI TRUYÒN

MøC TÕ BµO ë MéT Sè THÓ BÖNH HéI CHøNG RèI LO¹N SINH TñY T¹I TRUNG T¢M HUYÕT HäC TRUYÒN M¸U,

BÖNH VIÖN B¹CH MAI

Chuyên ngành: Huyết học - Truyền máu

Mã số:

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Vũ Minh Phương

HÀ NỘI – 2019

AML : Acute myeloid leukemia.

SLTC : Số lượng tiểu cầu

WHO : World Health Organization

SLD : Multilinaeage dysplasia

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH TỦY 3

1.1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh tủy. 3

1.1.2 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh. 4

1.1.3 Triệu chứng của hội chứng rối loạn sinh tủy. 12

1.1.4 Chẩn đoán và phân loại và tiên lượng hội chứng rối loạn sinh tủy.13 1.1.5 Điều trị. 23

1.2 NHUỘM BĂNG G NHIỄM SẮC THỂ G-BAND STAINING 26

1.2.1 Nguyên lý 26

1.2.2 Chỉ định 26

1.2.3 Chống chỉ định 26

1.2.4 Chuẩn bị 27

1.2.5 Những sai sót và xử trí 28

1.3 CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ TỦY KARYOTYPING ANALYSIS OF BONE MARROW SAMPLE 28

1.3.1 Nguyên lý 28

1.3.2 Chỉ định 29

1.3.3 Chống chỉ định 29

1.3.4 Chuẩn bị 29

1.3.5 Các bước tiến hành 30

1.3.6 Nhận định kết quả 32

1.3.7 Những sai sót và xử trí 32

1.4 CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ MÁU NGOẠI VI KARYOTYPING ANALYSIS OF PERIPHERAL BLOOD SAMPLE 33

1.4.1 Nguyên lý 33

1.4.2 Chỉ định 34

1.4.3 Chống chỉ định 34

BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION 39

1.5.1 Nguyên lý 39

1.5.2 Chỉ định 39

1.5.3 Chống chỉ định 39

1.5.4 Chuẩn bị 39

1.5.5 Các bước tiến hành 40

1.5.6 Nhận định kết quả 42

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 44

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.2.1 Thời gian thực hiện nghiên cứu. 44

2.2.2 Thời gian thu thập số liệu. 44

2.2.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu. 44

2.2.4 Thiết kế nghiên cứu. 44

2.2.5 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu nghiên cứu. 45

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 45

2.3.1.Phương tiện và vật liệu, kĩ thuật nghiên cứu. 45

2.3.2.Tiêu chuẩn chẩn đoán. 46

2.3.3.Các biến số, chỉ số. 46

2.4 SAI SỐ NGHIÊN CỨU 48

2.5 QUẢN LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 48

2.6 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 48

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 57

DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 58

KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán MDS 13

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn phân loại MDS theo WHO 2008 15

Bảng 1.3 Bất thường về di truyền trong MDS theo WHO 2008 17

Bảng 1.4 Tiêu chuẩn phân loại MDS theo WHO 2016 18

Bảng 1.5 Chấm điểm tiên lượng MDS theo WPSS 20

Bảng 1.6 Xếp nhóm tiên lượng MDS theo WPSS 20

Bảng 1.7 Chấm điểm tiên lượng MDS theo IPSS 21

Bảng 1.8 Xếp nhóm tiên lượng MDS theo IPSS 21

Bảng 1.9 Chấm điểm tiên lượng MDS theo IPSS-R 22

Bảng 1.10 Xếp nhóm nguy cơ MDS theo IPSS-R 23

Bảng 2.1 Biến số nghiên cứu đặc điểm chung của đối tượng 46

Bảng 2.2 Biến số lâm sàng 47

Bảng 2.3 Biến số cận lâm sàng 47

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính của nhóm nghiên cứu 50

Bảng 3.2 Tỉ lệ phân loại theo nhóm bệnh hội chứng rối loạn sinh tủy 52

Bảng 3.3 Số lượng các bất thường di truyền học mức độ tế bào phát hiện được 54

Bảng 3.4: Tỉ lệ bệnh nhân phân loại theo nguy cơ di truyền học tế bào 55

Bảng 3.5: Tỉ lệ bệnh nhân phân loại theo bảng điểm tiên lượng IPSS-R 56

Bảng 3.6 Mối liên quan giữa bất thường di truyền mức tế bào với phân nhóm tiên lượng bệnh nhân 57

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa phân tầng nguy cơ theo IPSS – R với triệu chứng lâm sàng 57

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 50

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 51

Biểu đồ 3.3 Triệu chứng lâm sàng 51

Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ bất thường di truyền mức tế bào 52

Biểu đồ 3.5 Số lượng bệnh nhân phân theo các thể của hội chứng rối loạn sinh tủy.53 Biểu đồ 3.6: Tần suất các dạng và mức độ bất thường di truyền mức tế bào 55 Biểu đồ 3.7 Tỉ lệ bệnh nhân theo nguy cơ di truyền học tế bào 56

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các đích phân tử và liệu pháp điều trị trong hội chứng rối loạn sinh tủy 5

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng rối loạn sinh tủy (myelodysplastic syndrome – MDS) là nhómbệnh bao gồm các rối loạn ác tính dòng tế bào gốc tạo máu ở tủy xương dẫnđến các biểu hiện bất thường về hình thái, sinh máu không hiệu quả ở máu vàtủy và có nguy cơ tiến triển thành Lơ xê mi cấp [1],[2] Sự phát triển nhanhchóng của các công nghệ sinh học phân tử và tế bào đã làm sáng tỏ thêm về

cơ chế sinh lý bệnh học phân tử của hội chứng rối loạn sinh tủy, mang lạinhững tiến bộ lớn trong chẩn đoán và giúp ước lượng tiên lượng của bệnhnhân cũng như ảnh hưởng đến kế hoạch và đáp ứng điều trị [1] Cùng với sựphát triển của các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại, các bất thường trong di truyềnhọc như đột biến điểm và bất thường số lượng bản sao có thể phát hiện được

ở lượng lớn bệnh nhân MDS [3] Hơn 50% trường hợp mắc hội chứng rốiloạn sinh tủy biểu hiện đột biến điểm xô-ma, điều này làm gián đoạn quátrình sống còn của tế bào, bao gồm nhưng không hạn chế các cơ chế sửa chữaDNA, dòng thác tín hiệu, nối mRNA và các điều hòa ngoài gene [2],[4] Các

dữ liệu này đã mở rộng thêm những hiểu biết về bệnh học của hội chứng rốiloạn sinh tủy, giải mã được các con đường sinh học mà chúng có thể là đíchcủa các loại thuốc mới, giúp phát triển những hướng đi mới trong điều trị hộichứng rối loạn sinh tủy Sự kết hợp các bất thường khác nhau giữa nhiễm sắcthể và đột biến điểm xô ma góp phần làm phong phú bệnh cảnh lâm sàng hộichứng rối loạn sinh tủy [5] Các karyotype bệnh lý là 1 phần của hệ thống tínhđiểm International Prognostic Scoring System (IPSS) được sử dụng để tínhtoán tiên lượng bệnh nhân hội chứng rối loạn sinh tủy Các bất thường tế bàomắc phải được phát hiện ở 40-50% trường hợp hội chứng rối loạn sinh tủy và

ý nghĩa lâm sàng của mỗi karyotype đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhđiều trị và diễn biến của bệnh [3], [4] Việc xác định các gen cụ thể bị ảnh

hưởng bằng mỗi bất thường trong tế bào học đang còn là một thách thức vàhậu quả của mỗi loại bất thường vẫn đang được cần làm sáng tỏ thêm [6] Đểtrả lời cho những câu hỏi đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với tên đề

tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền mức tế bào ở một số thể bệnh

hội chứng rối loạn sinh tủy ở TT HHTM, bệnh viện Bạch Mai” với 2 mục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH TỦY

Hội chứng rối loạn sinh tủy Myelodysplastic - Syndrome (MDS) là thuậtngữ được sử dụng để chỉ khái quát 1 nhóm bệnh ung thư các tế bào tủy đadạng mà có điểm chung (1) nguồn gốc của chúng phát sinh từ đột biến somacủa tế bào gốc tạo máu vạn năng, (2) tạo máu không hiệu quả, và (3) xuhướng tiến triển đến bệnh bạch cầu tủy cấp tính [7]

Các thuật ngữ khác nhau đã được sử dụng để chẩn đoán MDS, từ bệnh

“bạch cầu thiếu máu” (leukanaemia) ở những năm 1900, đến tiền lơ xê minăm 1953, và “lơ xê mi cấp tiềm tàng” (smouldering acute leukemia) vàonăm 1963 và cuối cùng cho đến năm 1982 phân loại quốc tế đầu tiền về MDS

đã được nhóm French American British (FAB) công bố [8] Phân loại này đãđược sửa đổi bởi WHO vào năm 2001, 2008 và hiện tại vào năm 2016 [9],[10], [11]

Ở Mỹ, thống kê năm 2003 – 2008 tần suất mắc MDS từ 4.1 đến 4.6 catrên 100000 người [12], [13] So với tần suất mắc các bệnh lý huyết học áctính thì MDS xếp hàng thứ 7 ở Anh giai đoạn 2004 - 2011 [14], [15] và thứ 5

ở Hàn Quốc giai đoạn 1999 – 2008 [16]

Trong MDS, bất thường nhiễm sắc thể có thể được quan sát được từ 30đến 80% số bệnh nhân tùy thuộc vào phân loại dưới nhóm của MDS và liệubệnh có phải là nguyên phát hay không, tiếp theo là do bệnh lý huyết học áctính trước đó hoặc xảy ra do hóa trị hoặc xạ trị [3], [17] Trong số 20-70%bệnh nhân còn lại có Karyotype bình thường, trong đó ngày càng có nhiều

bằng chứng chứng minh có các thay đổi ở mức siêu hiển vi như đột biếnđiểm, mất đoạn siêu nhỏ (microdeletions), khuếch đại nhỏ, thay đổi nguyênsinh chất hoặc những bản sao mất thông tin di truyền như uniparental disomy(UPD) tạo nên cơ sở di truyền học của bệnh [18], [19], [20] Sự không đồngnhất về tế bào học trong MDS vô cùng lớn Trong một nghiên cứu đa trungtâm ở Đức-Áo, kết quả cho thấy phát hiện được những thay đổi trongKaryotype ở 1080 (52%) bệnh nhân trong tổng số 2072 bệnh nhân mắc MDSvới tổng số 2370 bất thường nhiễm sắc thể Chia nhỏ phân nhóm nhữngnhiễm sắc thể bất thường giống nhau với nhau đã xác định 684 loại bấtthường tế bào học khác nhau Karyotypes bất thường cho thấy một mối liên

hệ rõ ràng với mức độ nghiêm trọng của MDS, tăng với số lượng tế bào blasttrong tủy và cường độ của sự loạn sản tế bào [3]

Phần lớn những khó khăn trong việc điều trị những bệnh nhân mắc hộichứng rối loạn sinh tủy liên quan đến tính không đồng nhất về mặt sinh họccủa họ, đó là những bệnh nhân có một nhóm chứa thông tin đột biến di truyền

và tế bào trong tủy hỗn tạp [21] Trong suốt thập kỷ vừa qua, đã có nhữngbước tiến lớn trong nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử trong hội chứngrối loạn sinh tủy [18], [22], [23]Các nghiên cứu đó đã chỉ ra các nhóm và tỉ lệmắc của các đột biến soma góp phần vào cơ chế gây rối loạn chức năng củacon đường truyền tín hiệu trong hội chứng rối loạn sinh tủy và những liênquan của chúng với tiên lượng bệnh và đáp ứng với một số thuốc nhất định.Thêm vào đó, các dữ liệu đã mô tả sự xuất hiện của cơ chế liên quan đến miễndịch gây ức chế khả năng tự xóa đi các dòng ác tính của cơ thể trong hộichứng rối loạn sinh tủy [24]

1.1.2.1 Toàn cảnh về di truyền sinh học tử trong hội chứng rối loạn sinh

tủy

Hiện tại có hơn 45 đột biến gây bệnh ở gen soma đã được phát hiệntrong hội chứng rối loạn sinh tủy có liên quan đến nhiều chức năng khác nhau,bao gồm sửa đổi histone, sửa chữa DNA, điều hòa ngoài gen, ghép nối ARN,phiên mã, tái thiết chromatin, và mạng lưới tín hiệu của các kinase [25]

Hình 1.1 Các đích phân tử và liệu pháp điều trị trong hội chứng rối loạn sinh tủy Sự không đồng nhất của các bất thường phân tử hiện có trong các

nhóm rối loạn của hội chứng rối loạn sinh tủy, liên quan đến nhiều loại gensoma bị đột biến và chức năng sinh học của chúng, mà đã được trình bày cùngvới các thuốc điều trị trong các thử nghiệm lâm sàng tập trung vào các tổnthương này

Nguồn: Alex Aleshin, and Peter L Greenberg Blood Adv 2018;2:2787-2797

Tại thời điểm chẩn đoán, hầu hết các trường hợp MDS đều phức tạp vềmặt di truyền, với nhiều dòng chứa đa đột biến cùng nhau, điều này góp phầnvào quá trình tiến triển bệnh và/hoặc tái phát, mặc dù việc tạo máu thường chỉ

bị chi phối bởi 1 dòng đặc hiệu [26] Với việc áp dụng rộng rãi giải trình tựgen theo mục tiêu, nó đã giúp nhận ra rằng trên 80 phần trăm bệnh nhân mắc

rối loạn sinh tủy ẩn chứa hơn 1 đột bệnh gene đã biết hiện nay [23] Tuynhiên, đột biết tái phát hiện được chỉ chiếm tỉ lệ rất nhỏ (khoảng 10%), trong

số đó có từ 25 gene trở lên có liên quan đến tiên lượng bệnh Thường có độtbiến bù trừ cùng xảy ra Tuy nhiên, 1 số loại đột biết nhất định được ghi nhận

là tự loại trừ nhau (ví dụ, các gene spliceosome) [27] Các nghiên cứu giảitrình tự 1 tế bào (single-cell) về tăng sinh tủy ác tính đang cho thấy các kiến trúc vô tính phức tạp hơn, như đã được dự đoán từ các nghiên cứu giải trình

tự hàng loạt trước đó , mang lại ý nghĩa cho việc theo dõi bệnh và xác địnhcác dòng kháng trị [28] Động học biến đổi của các đột biến trong hội chứngrối loạn sinh tủy bao gồm tiềm năng thay đổi dòng chiếm ưu thế theo thờigian của đột biến cụ thể của bệnh nhân Thông qua cách theo dõi lien tụctrạng thái đột biến bằng phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo [next-generation sequencing (NGS)], tiến triển các dòng trong hội chứng rối loạnsinh tủy có thể theo dõi được theo thời gian Quản lý bệnh – gây thay đổi liệupháp điều trị là việc rất áp lực vì nó có khả năng dẫn đến biến đổi tỉ lệ tươngđối của các dòng đang có hiện tại và dẫn đến làm nổi lên các dòng mới liênquan đến kháng trị

1.1.2.2 Bất thường trong duy trì và sửa chữa DNA

Duy trì tính chính xác của bộ gene là rất quan trọng cho việc hình thànhchức năng đầy đủ của tế bào nhân thực Phá hủy DNA có thể dẫn đến kết quảlàm tổn hại đến quá trình nội sinh và ngoại sinh của tế bào, ví dụ như việc hóatrị độc tế bào và xạ trị Phá hủy chuỗi kép DNA là 1 trong những dạng pháhủy bộ gene nghiêm trọng nhất và được sửa chữa bởi quá trình tải tổ hợptương đồng [homologous recombination (HR)] và nối điểm tận không tươngđồng [nonhomologous end-joining (NHEJ)] [29] Tái tổ hợp tương đồng là cơchế sữa chữa DNA tế bào được ưu thích hơn vì nó dùng DNA tương đồng,thường là từ chromatid chị em, làm mẫu để sữa chữa Các con đường thay thế

khác, ví dụ như nối điểm tận không tương đồng, để sữa chữa phá hủy DNAchuỗi kép là 1 hình thức thô sơ bằng cách nối những điểm cuối của đoạnDNA mà không có cơ chế ức chế lỗi hiệu quả Bất kì sự suy giảm quá trình tái

tổ hợp tương đồng nào cũng dẫn đến tăng sự phụ thuộc vào con đường dễ xảy

ra lỗi như nối điểm tận không tương đồng và đưa vào các đột biến mất đoạn

và thêm đoạn [30] Sinh bệnh học của hội chứn rối loạn sinh tủy là một quátrình phức tạp gồm một chuỗi nhiều bước qua đó dẫn đến sự tích tụ các tổnthương di truyền trong DNA làm thay đổi các chức năng tế bào gây ra sự xuấthiện của các dòng tiền ung thư Phá vỡ chuỗi kép DNA là loại tổn thươngDNA nặng nhất, nếu nó không được sửa chữa có thể dẫn đến mất ổn định củanhiễm sắc thể và làm xuất hiện các nhiễm sắc thể bất thường Các nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các cơ chế của HR và NHEJ có liên quan đến tính nhạy cảm,sinh bệnh học và tiên lượng của hội chứng rối loạn sinh tủy [31], [32]

Các dữ liệu gần đây đã chỉ ra rằng sự xuất hiện đột biến IDH1/2 có thểdẫn đến giảm cơ chế sửa chữa theo con đường HR và tăng độ nhạy của tế bàotrong hội chức rối loạn sinh tủy đối với các chất ức chế polybo ADP ribosepolymerase (PARP) và các thuốc gây tổn thương DNA khác (temozolomide,cisplatin, daunorubicin) [33] Khiếm khuyết trong con đường HR có thể đượckhai thác thành 1 liệu pháp điều trị bằng cách trấn áp các cơ chế sửa chữaDNA đã bị lỗi (muối bạch kim hoặc kiềm hóa) hoặc bằng cách tăng có chọnlọc lực sự phụ thuộc của các tế bào của các tế bào khối u với vào các conđường thay thế sửa chữa DNA dễ bị lỗi [34], [35] Kinh nghiệm ban đầu vớiveliparib chất ức chế PARP kết hợp với temozolomide cho thấy các dấu hiệukhiêm tốn về hiệu quả trong nhóm bệnh nhân AML kháng trị hoặc tái hoặcsau tái phát, với tỷ lệ thuyên giảm hoàn toàn (CR) là 17% Trong nghiên cứunày, sự phosphoryl hóa histone H2AX do điều trị (một dấu hiệu của phá vỡDNA chuỗi kép) có liên quan đến tăng đáp ứng với điều trị Hầu hết các bệnh

nhân đạt lui bệnh hoàn toàn trong nghiên cứu này đều mắc AML thứ pháthoặc liên quan đến điều trị trong bối cảnh đã được chẩn đoán MDS trước đóhoặc Lơ xê mi kinh dòng hạt mono (Chronic Myelo-Monocytic Leukemia -CMML) [36] Các nghiên cứu bổ sung về thuốc ức chế PARP đơn thuần vàkết hợp với thuốc giảm methyl hóa (hypomethylating agent – HMA) trongMDS đang được tiến hành.

1.1.2.3 Rối loạn chức năng Telomerase

Khiếm khuyết trong quá trình duy trì tính toàn vẹn của telomere là mộtđặc điểm nổi bật của bệnh ung thư và có liên quan đến sinh bệnh học củaMDS Trong MDS, telomere bị xói mòn và rối loạn chức năng có khả nănglàm tổn thương DNA liên tục và tích lũy các thay đổi phân tử [37], [38], [39].Các bằng chứng gợi ý rằng xói mòn telomere có thể ức chế sự tự đổi mới của

tế bào gốc tạo máu, khả năng phục hồi và biệt hóa [40], [41]

1.1.2.4 Đột biến TP53

Đột biến trong gen ức chế khối u TP53 xảy ra với các tỉ lệ khác nhaunhau trong một loạt các tập hợp MDS TP53 mã hóa một yếu tố sao chép gắnvới DNA gây ra sự ngừng tăng trưởng tế bào, lão hóa và gây chết tế bào bởi quátrình chết tế bào theo chương trình do gây stress tế bào, bao gồm Stress có nguồngốc từ gene ung thư và tổn thương DNA [42] Trong bệnh lý ác tính về huyếthọc, bao gồm MDS, đột biến TP53 có tiên lượng xấu và đặc biệt phổ biến ởMDS thứ phát và một phần bệnh nhân mắc bệnh tế có bất thường del (5q)

1.1.2.5 Chết theo chương trình không hiệu quả

Protein BCL-2 chống lại quá trình chết tế bào theo chương trình bị biểuhiện quá mức trong các bệnh lý huyết học ác tính, nó có liên quan đến việcduy trì và khả năng sống của các tế bào tủy, tình trạng kháng trị, và tiên lượnglâm sàng xấu Trong 1 thử nghiệm đơn nhánh phase 2 của thuốc venotoclax ,

1 loại thuốc tác động đến sự chống lại chết tế bào theo chương trình, trênnhóm 32 bệnh nhân ung thư tủy kháng trị hoặc tái phát, trong đó có 12 bệnhnhân mắc hội chứng rối loạn sinh tủy Cho thấy 33% bệnh nhân có đột biếnisocitrate dehydrogenase 1/2 (IDH1/2) đạt được lui bệnh hoàn toàn, gợi ra tácđộng của thuốc trên phân nhóm này [43] Đột biến protein IDH 1/2 dẫn đếncác thay đổi ngoài gen của các tế bào AML thông qua sản xuấtoncometabolite (R)-2-hydroxyglutarate (2-HG), nhạy cảm hóa những tế bào

đó với chất ức chế protein BCL-2 như venotoclax [44] Hiệu ứng nhạy cảmnày được gây ra bởi sự ức chế hoạt động của cytochrom c oxidase trong chuỗivận chuyển điện tử của ty thể qua trung gian 2-HG, ức chế cytochrome coxidase làm giảm mức ngưỡng khởi phát quá trình chết theo chương trình của

tế bào dựa trên ức chế BCL-2 Những phát hiện này mang lại giá trị tiềm năngtrong việc xem xét việc sử dụng các chất ức chế Bcl-2 ở những bệnh nhân bịđột biến IDH

1.1.2.6 Bất thường ngoài gene

Các bất thường khác nhau trong hội chứng rối loạn sinh tủy thường cóliên quan đến bất thường sự methyl hóa DNA và các đột biến gene mà nóđược điều hòa bởi các chương trình ngoài gene (TET2 à DNMT3a, chứachương trình kiểm soát methyl hóa DNA; EZH2 và ASXL1, chứa chươngtrình iểm soát methyl hóa histone) [45] Tính chất ngoài gene này trong hộichứng MDS có thể giải thích cho việc phát hiện ra rằng đây là một bệnh đápứng tốt nhất với các chất ức chế methyl hóa DNA Tiến triển của hội chứngMDS được định rõ bởi đặc điểm của các tổn thương ngoài gen tìm được vàcác đột biến gene kiểm soát sự phát triển mà chúng có thể thay đổi trạng tháicân bằng của quá trình tăng sinh/chết theo chu trình, vì thế góp phần vào sựtiến triển thành lơ xê mi cấp

1.1.2.7 Rối loạn điều hòa IDH1/2

Gần đây, sự mất chức năng điều hòa chuyển hóa của tế bào đã đượcchấp nhận như là 1 dấu hiệu chỉ điểm của ung thư [46] Các isoenzyme củagia đình IDH (IDH1,IDH2,IDH3) có chức năng chuyển isocitrate thành α-ketoglutarate qua enzyme khử carboxyl oxy hóa [47] Đột biến xảy ra vớiIDH1 và IDH2 được mô tả đầu tiên trong u tế bào thần kinh đệm, cho thấynhững đột biến này luôn dị hợp và dẫn đến hoạt động của tính trạng mới gâynên sự chuyển hóa α-ketoglutarate thành oncometabolite 2-HG [48], [49].Nồng độ 2-HG tăng lên làm thay đổi điều hòa ngoài gene và ngăn chặn sựbiệt hóa tế bào, vì thế thúc đẩy khối u phát triển [50] Đột biến IDH1 vàIDH2 xảy ra khoảng 20% trong bệnh lơ xê mi cấp [51], và trong hội chứngrối loạn sinh tủy tỉ lệ xảy ra thấp hơn, vào khoảng từ 5% đến 12% [52], [53],[54] Cũng giống như trong lơ xê mi cấp, đột biến IDH1/2 ở những bệnh nhânmắc hội chứng rối loạn sinh tủy có liên quan đến tuổi cao, số lượng tiểu cầucao, karyotype bình thường, và xảy ra cùng với các đột biến DNMT3A,ASXL1, và SRSF2 [53] Hơn nữa đột biến IDH1/2 xảy ra như để triệt tiêu lẫnnhau và cả TET2 [53] Ý nghĩa của đột biến IDH1/2 đối với tiên lượng tronghội chứng rối loạn sinh tủy vẫn còn nhiều tranh cãi nhưng có vẻ gây nên cáctác động tiêu cực đặc biệt là trong những trường hợp bệnh nguy cơ thấp [52],[54], [55], [56].

1.1.2.8 Rối loạn điều hòa của enzyme khử acetyl histone

Sự acetyl hóa histone tạo điều kiện hoạt động cho quá trình phiên mãgene, nó được điều hòa bởi enzyme histone deacetylases (HDACs) Ức chếHDAC có thể phục hồi lại quá trình acetyl hóa của sự mất điều hòa proteinshistone và các yếu tố phiên mã về bình thường

1.1.2.9 Bất thường trong truyền tín hiệu

Sự bất thường trong các con đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đếnquá trình sinh bệnh học và tiến triển của một loạt quá trình tăng sản ác tínhkhác nhau đã được chứng minh trong hội chứng rối loạn sinh tủy, bao gồmserine/threonine kinase AKT, chất có chức năng điều biến quan trọng dòngthác tín hiệu của phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) [57], [58], PKCa [59],the mammalian target of rapamycin [60], aurora kinases [61], cyclin D1 [62],

và casein kinase (CK1α) [63] Với những phát hiện này, một số chất ức chếkinase đã được sử dụng để điều trị bệnh nhân MDS Hợp chất phân tử nhỏ kếthợp Rigosertib gắn lên vùng gắn Ras (Ras-binding) của nhiều kinase, baogồm RAF, PI3K và các tác nhân khác của GTPase liên quan đến Ras, và gây

ra sự ức chế PI3K và các con đường kinase giống polo (polo-like kinasepathway) [58], [64], [65], [66], [67]

1.1.2.10 Ức chế hiệu ứng của Cytokine

Tăng mức ức chế chuyển thành yếu tố phát triển nhóm B của quá trìnhtạo hồng cầu ( yếu tố phát triển chủ yếu và yếu tố biệt hóa -11) xảy ra trong tếbào hồng cầu của hội chứng rối loạn sinh tủy Thuốc Luspatercept là mộtprotein tổng hợp mới hoạt động như một cái bẫy lingand và liên kết và ngănchặn tín hiệu Smad2 / 3, loại tín hiệu ức chế yếu tố này, do đó làm tăng tạohồng cầu [68]

1.1.2.11 Rối loạn chức năng điều hòa miễn dịch

Mặc dù có rất nhiều phương pháp điều trị khác nhau nhưng khả năngdung nạp miễn dịch đối với ung thư có ý nghĩa quan trọng đối khả năng tồntại của khối u đó Làm rối loạn chức năng vi môi trường liên quan đến khối u,

là cơ chế quan trọng, giúp cho khối u có khả năng chống lại sự kiểm tra miễndịch thông qua sự bộc lộ của các protein đặc hiệu giúp can thiệp vào chứcnăng của tế bào miễn dịch Biểu lộ của lympho xuyên màng PD-1 sau khi

hoat hóa tế bào T là một điểm kiểm tra sinh lý bình thường mà hệ thống miễndịch sử dụng để tránh các tế bào T tự phản ứng [69] Tuy nhiên, các tế bàokhối u, thông qua việc tạo ra và biểu hiện quá mức các chất gắn của PD-1 (ví

dụ , PD-L1 và PD-L2), chúng khai thác trực tiếp con đường này thông quabiểu lộ PD-L1 / PD-L2 hoặc gián tiếp bằng cách chiêu mộ các tế bào T điềuhòa mà có biểu lộ PD-L1, gây rối loạn chức năng miễn dịch [70], [71], [72]

◦ Máu ngoại vi:

Thiếu máu bình sắc, có thể gặp hồng cầu non ra máu ngoại vi Bạch cầuhạt có thể bính thường, tăng hoặc giảm, giảm, mất hạt đặc hiệu, có hính ảnhnhân bị đứt đoạn, hoặc tăng hạt đặc hiệu hoặc tăng đoạn, có thể xuất hiện tếbào non ác tình (blast).Tiểu cầu có thể tăng, giảm hoặc bính thường, bấtthường hay gặp nhất là tiểu cầu có kìch thước to (tiểu cầu khổng lồ)

◦ Tủy đồ:

Dòng hồng cầu thường gặp tăng sinh, gặp hồng cầu non đủ các lứa tuổi,các hồng cầu non có nhân chấm, hoặc hồng cầu non ìt tạo hemoglobin Có thểtăng tiền nguyên hồng cầu nhưng ìt gặp các cụm, các đảo hồng cầu non bínhthường Có thể gặp nguyên hồng cầu nhiều nhân, nhân có vệ tinh thấy ở giaiđoạn đa sắc và ưa acid, bào tương có hốc hoặc ìt tạo huyết sắc tố Nhuộmhồng cầu sắt (nhuộm Perls) có thể phát hiện đượcsideroblast vòng (là một tiêuchuẩn trong xếp thể bệnh của hội chứng rối loạn sinh tủy)

Dòng bạch cầu hạt: thường có tăng bạch cầu dòng hạt và dòng mono,giảm hoặc mất hạt đặc hiệu, tế bào méo mó, nứt vỡ, có vệ tinh, xuất hiện tếbào một nhân của bạch cầu đoạn trung tình, bất thường kiểu Pelger Huët Cóthể gặp tăng tế bào tiền tủy bào và tủy bào Tế bào blast bao giờ cũng gặpnhưng tỷ lệ gần như bính thường (dưới 2%), nhưng có thể gặp tăng cao, đếnxấp xỉ 20%, ở thể có tăng quá mức tế bào blast Tiểu cầu: gặp mẫu tiểu cầucòi cọc, không chia thùy hoặc hai thùy, nhiều múi hoặc ìt múi

◦ Sinh thiết tủy xương:

Rất có giá trị trong việc chẩn đoán sớm khi bệnh chuyển thành lơ xê micấp Phát hiện thấy khu trú bất thường của các tế bào đầu dòng chưa trưởngthành (ALIP: Abnormal localization of immature precursors) Khi gặp ALIPthì tiên lượng bệnh dễ chuyển thành lơ xê mi cấp.Có thể có tăng sinh xơ gặp ởthể ìt blast.89

◦ Đặc điểm tế bào di truyền:

Mất NST: 5, 7, 20; thêm NST: 8, 21; mất đoạn nhánh dài NST: 5, 7,

20, (trong đó mất nhánh dài NST số 5 đã được sử dụng để xếp loạibệnh); chuyển đoạn: t(1; 3); (p36; q21); t(1; 7); (p11; q11); t(2; 11);(p21; q23) Không gặp tổn thương đặc hiệu của lơ xê mi dòng tủy: t(8;21); t(15; 17), inv.(16)

◦ Xét nghiệm sinh học phân tử:

Tùy từng thể bệnh mà có chỉ định xét nghiệm hợp lý

1.1.4.1 Chẩn đoán và phân loại

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán MDS [7]

Giảm một hoặc nhiều dòng tế bào máu không giải thích được

Hb < 11 g/dL

ANC < 1500/mL

PLT < 100 000/mL

Có ³ 1 tiêu chuẩn quyết định loạn sinh tuỷ

> 10% tế bào dòng hồng cầu, tuỷ và hoặc mẫu tiểu cầu loạn sinh*

5 – 5% blast ở tuỷ xương

Có bằng chứng bất thường về di truyền tế bào đặc trưng cho MDS [14]

idic(X)(q(13)t(11;16)(q23;p13.3)t(3;21)(q26.2;q22.1)

t(1;3)(p36.3;q21.1)t(2;11)(p21;q23)inv(3)(q21q26.2)t(6;9)(p23;q34)

Loại trừ những chẩn đoán khác được giải thích bởi xét nghiệm máu và tuỷ

Không có tiêu chuẩn chẩn đoán xác định AML: t(8;11), i(16), t(16;16),

t(15;17) hoặc bạch cầu cấp dòng hồng cầu

Không có rối loạn huyết học khác (ALL, suy tuỷ, hoặc lymphoma)

Loại trừ:

- HIV hoặc nhiễm virus khác

- Thiếu sắt hoặc đồng

- Thiếu B12, folate hoặc vitamin khác

- Đang điều trị methotrexate, azathioprine hoặc hoá trị liệu

- Lạm dụng rượu (dùng nhiều trong thời gian dài)

- Những bệnh lý tự miễn (ITP, IHA, HC Evans, HC Felty, SLE)

- Những rối loạn di truyền (thiếu máu Fanconi, thiếu máu Diamond-Blackfan,

HC Shwachman-Diamond syndrome…)

*Hiện diện ³ 6 tháng, nếu không có bất thường di truyền tế bào được xác định

◦ Tiêu chuẩn phân loại loạn sinh tủy theo WHO 2008

Năm 2008, WHO cập nhật tiêu chuẩn phân loại loạn sinh tủy chi tiết,cùng với hệ thống tiên lượng WPSS (bảng 1.2) ra đời dựa trên nền tảng “Phânloại của WHO về u mô tạo máu và lympho” xuất bản lần thứ 3 năm 2001

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn phân loại MDS theo WHO 2008 [7], [11]

Loạn sinh đơn dòng, loạn sinh ≥10% TB trong 1 dòng tuỷ

< 5% TB non

Loạn sinh ≥ 10% của mỗi ≥ 2dòng TB tuỷ (đầu dòng neutrophilvà/ hoặc hồng cầu và/ hoặc mẫutiểu cầu)

TB non < 1%(b) hoặckhông có không có Auerrods

< 1 x 10^9/L monocytes

< 5% TB nonKhông có Auer rods

± 15% nguyên bào sắt vòng nhẫn

RAEB-1

Giảm ≥1 dòng TB

< 5% TB non (b)Không có Auer rods

-TB non Auer rods ± (c)

của MDS (bảng 1.3) < 5% tế bàonon

Chỉ có bất thường del(5q) về ditruyền tế bào

Không Auer rodsGhi chú

(a) Có thể khảo sát thấy giảm 2 dòng tế bào Trường hợp giảm 3 dòng tế bàonên xếp vào MDS-U

(b) Nếu phần trăm nguyên bào tuỷ (myeloblast) < 5% nhưng nằm trongkhoảng 2 – 4% myeloblast trong máu thì phân loại là RAEB-1 Trường hợpRCUD và RCMD với 1% myeloblast trong máu thì phân loại là MDS-U.(c) Trường hợp với Auer rods và < 5% myeloblast trong máu và ít hơn 10%trong tuỷ thì nên phân loại là REAB-2 Mặc dù quan sát thấy 5 – 19% tế bàonon trong máu thì chẩn đoán là RAEB-2, nhưng trường hợp RAEB-2 có thể

có tế bào non < 5% trong máu nếu có Auer rods hoặc 10 – 10% tế bào nontrong tuỷ hoặc cả hai Tương tự những trường hợp RAEB-2 có thể có < 10%

tế bào non trong tuỷ nhưng có thể chẩn đoán dựa vào Auer rods (+) và/ hoặc 5– 19% tế bào non trong máu

Bảng 1.3 Bất thường về di truyền trong MDS theo WHO 2008

Chỉnh sửa từ phân loại 2008 Trong phân loại của WHO chỉnh sửa năm

2016 về loạn sinh tuỷ chủ yếu dựa vào mức độ loạn sinh và phần trăm của tếbào non cho phân loại bệnh và việc giảm tế bào chuyên biệt ảnh hưởng khôngnhiều lên phân loại MDS Hơn nữa, việc biểu hiện loạn sinh hình thái nặngcủa dòng thường không tương ứng với giảm tế bào chuyên biệt trong nhữngtrường hợp loạn sinh tuỷ Vì lý do này, thuật ngữ cho MDS ở người lớn đãthay đổi là bỏ thuật ngữ “refractory anemia” (thiếu máu dai dẳng) và

“refractory cytopenia” (giảm dai dẳng các dòng tế bào), thay vào đó là

“myelodysplastic syndrome” (MDS: hội chứng loạn sinh tuỷ) Sau đây làphân loại WHO được chỉnh sửa 2016

Bảng 1.4 Tiêu chuẩn phân loại MDS theo WHO 2016 [9].

Phân loại

Dòng loạn sản

Giảm dòng

tế bào máu

% RS trong HC nhân

Tỉ lệ tế bào non

5%*

BM < 5%, PB <1%,

không Auer rods

không Auer rodsMDS-RS

≥5%*

BM < 5%, PB <1%,

không Auer rods

không Auer rods

không Auer rodsMDS-EB

BM 5% – 9% hoặc

PB 2% - 4%, khôngAuer rods

BM 10% – 19%hoặc PB 5% - 19%,hoặc có Auer rodsMDS-U

Với blast PB

BM < 5%, PB =1%**,

không Auer rods

Phân loại

Dòng loạn sản

Giảm dòng

tế bào máu

% RS trong HC nhân

không Auer rodsGiảm TB dai

Ghi chú:

Giảm dòng tế bào máu được định nghĩa khi: Hb < 10g/dL; PLT < 100 x109/L; số lượng neutrophile tuyệt đối < 1,8 x 109/L Hiếm khi, MDS hiệndiện với thiếu máu nhẹ hoặc số lượng tiểu cầu trên mức bình thường.Monocyte ở máu ngoại vi phải < 1 x 10^9/L

* Nếu có đột biến SF3B1 hiện diện

** 1% blast trong máu ngoại vi phải được ghi nhận trong ít nhất 2 lần khácnhau

*** Những trường hợp ring sideroblast ≥ 15% theo định nghĩa có loạn sinhhồng cầu nặng, và được phân loại như MDS-RS-SLD

1.1.4.2 Tiên lượng hội chứng rối loạn sinh tủy

Hiện tại hệ thống tiên lượng loạn sinh tuỷ của WHO chưa được cậpnhật theo phân loại 2016, hướng dẫn của NCCN mới nhất (phiên bản I.2008)vẫn đề nghị sử dụng theo phân loại WHO 2008

◦ Tiên lượng theo WHO 2008 (WPSS)

Bảng 1.5 Chấm điểm tiên lượng MDS theo WPSS

Tốt: bình thường, -Y đơn độc, del(5q) đơn độc, del(20q) đơn độc

Xấu: phức tạp (³3 bất thường) hoặc bất thường NST 7

Trung bình: những bất thường NST còn lại (khác nhóm tốt và xấu)

Bảng 1.6 Xếp nhóm tiên lượng MDS theo WPSS

Nhóm nguy

cơ WPSS

Tổngđiểm

Thời gian sống trungbình sau chẩn đoán

(năm)

Thời gian chuyển cấptrung bình sau chẩnđoán (năm)

◦ Tiên lượng theo IPSS

Hệ thống tiên lượng theo IPSS được xuất bản năm 1997

Bảng 1.7 Chấm điểm tiên lượng MDS theo IPSS

Giảm tế bào 0/1 2/3

Những nguy cơ theo NST đồ:

- Tốt: bình thường, -Y đơn lẻ, del(5q) đơn lẻ, del(12p), del(20q) đơn lẻ

- Xấu: bất thường NST 7, phức tạp: ≥ 3 bất thường

- Trung bình: những trường hợp còn lại

Bảng 1.8 Xếp nhóm tiên lượng MDS theo IPSS

Nhóm nguy

cơ IPSS

Tổngđểm

Số năm sống trungbình, nếu không điều

Bảng 1.9 Chấm điểm tiên lượng MDS theo IPSS-R

Di truyền tế bào

Trungbình

Nghèo

Rấtnghèo

TB non trong tủy

hiện diện 2 bất thường

có 3 bất thường

Để đánh giá tiên lượng đầy đủ hơn, hệ thống tiên lượng IPSS bổ sung và cậpnhật năm 2012 được gọi là IPSS-R (bảng 1.5) [13, 7]

Bảng 1.10 Xếp nhóm nguy cơ MDS theo IPSS-R

Nhóm nguy

Số năm sống trungbình, nếu không điều

Điều trị căn cứ theo thể bệnh hội chứng rối loạn sinh tủy (xếp loại FAB

1982 và WHO ), yếu tố nguy cơ, tuổi, toàn trạng Các biện pháp điều trị chìnhlà: Hóa trị liệu, sử dụng các chất cảm ứng biệt hóa,ghép tủy xương, điều trị bổtrợ cho thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng

1.1.5.2 Các phác đồ đề xuất theo thể bệnh

◦ Thể RA/RARS

◦ Thể RAEB

◦ Thể RAEB-t

◦ Nhóm nguy cơ cao chuyển thành lơ xê mi cấp như RAEB-2 (WHO 2001)

hay AEB-t (FAB 1982):

◦ Ghép tế bào gốc tạo máu: thường là ghép đồng loại.

1.1.5.3 Điều trị hỗ trợ

◦ Chống thiếu máu

sắc tố đạt> 100G/L, tốt nhất là nên chọn máu phù hợp phenotype

tiêm dưới da

◦ Chống xuất huyết

khi số lượng tiểu cầu ≤ 50 G/L nhưng có xuất huyết

◦ Chống nhiễm trùng

 Nếu bạch cầu N ≤ 1G/L có thể dùng G-CFS.

1.1.5.4 Một số thuốc và phác đồ điều trị mới

◦ Đơn trị liệu: có thể dùng riêng từng thuốc sau:

giờ 1 lần trong 2-3 tuần

tuần 1 đợt

dùng 4 tuần 1 đợt

liều đến 400mg trong 1-2 tuần tiếp theo

400mg/ ngày

ngày liên tiếp

dùng trong 4-6 tuần

trong tuần 1 và tuần 2; lặp lại chu kỳ mỗi 4 tuần

◦ Phác đồ phối hợp

Kỹ thuật này được sử dụng trong xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể

máu ngoại vi/tủy xương được để nhận diện bất thường nhiễm sắc thể

Không có chống chỉ định

1.2.4.1 Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo

1.2.4.2 Phương tiện - Hóa chất

Chuyển sang cốc 2/30 giây;

Chuyển sang cốc 3/15giây;

Chuyển sang cốc 4/15 giây;

Chuyển sang cốc 5 /10 phút;

Chuyển sang cốc 6 /15 giây;

Rửa dưới vòi nước chảy

◦ Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm băng G được phân tích bất thường về số lượng,

cấu trúc trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằngphần mềm chuyên dụng.

Điều chỉnh lại thờigian cắt của enzymcho hợp lý Pha lạienzym nếu nhầmdung dịch đệm

1.3 CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ TỦY KARYOTYPING ANALYSIS OF BONE MARROW SAMPLE

Tế bào tủy là những tế bào non có khả năng phân bào Do đó người ta

có thể sử dụng thu hoạch trực tiếp hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo màkhông cần chất kích thích non hóa Sau đó dùng chất ức chế phân bào ức chế tếbào ở kỳ giữa của quá trình phân bào lúc này nhiễm sắc thể có hình dạng điểnhình nhất, thu hoạch rồi chuẩn bị tiêu bản phân tích cụm nhiễm sắc thể

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính

Không có chống chỉ định

1.3.4 Chuẩn bị

1.3.4.1 Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật

1.3.4.2 Phương tiện - Hóa chất

- Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L-glutamin, Hepes);

- Huyết thanh bào thai bê (FBS);

- Dung dịch ức chế phân bào (Colcemide 0,01 ‰ (10µg/ml));

- Dung dịch nhược trương(KCL 0,075M (pH=7,4);

2ml tủy được chứa trong ống có chất chống đông heparin sodium.

1.3.5.1Nuôi cấy

◦ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5mlhuyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều

◦ Chuẩn bị chai nuôi cấy

Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch.Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy

◦ Nuôi cấy tế bào

Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị Lắc nhẹcho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC,5% CO2/24 giờ

1.3.5.2 Thu hoạch

◦ Nhỏ colcemide: Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50  l dungdịch colcemide 0.010/00 (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.g/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút

◦ Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:

- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml/mẫu)

- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol : 1 acid acetic

- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo

Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính Chú ý khi nhỏ tiêu bản

để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm

Để tiêu bản khô tự nhiên trước khi nhuộm

Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ

thêm tiêu bản khi cần

1.3.5.4 Nhuộm Giêmsa