Luận văn phân lập giám định virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý ở lợn mắc bệnh

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðẠO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-* -

NGUYỄN TRỌNG CƯỜNG

PHÂN LẬP GIÁM ðỊNH VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan rằng, ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược làm rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 11 năm 2009 Tác giả luận văn

Nguyễn Trọng Cường

Lời cám ơn

để hoàn thành Luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi luôn nhận ựược sự quan tâm giúp ựỡ của các thầy giáo, cô giáo và bạn bè ựồng nghiệp Nhân dịp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ quý báu của Ban lãnh ựạo, các cán bộ công nhân viên Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung ương ựã dành nhiều thời gian và công sức giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ựề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Cảm Ờ Giám ựốc Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung ương người ựã tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Ờ Ban đào tạo Sau ựại học, cơ sở ựào tạo ựã giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như ựộng viên tôi thực hiện tốt ựề tài

Xin chân thành cảm ơn Chi cục Thú y các tỉnh, các chủ hộ chăn nuôi lợn và các tập thể, cá nhân ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ựình và bạn bè ựồng nghiệp ựã luôn giúp ựỡ, ựộng viên giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 11 năm 2009 Tác giả luận văn

Nguyễn Trọng Cường

2.1.4.1 Ngu ồn gốc và phân loại 9

2.1.4.2 Hình thái và c ấu trúc của PRRSV 12

2.1.4.3 S ức đề kháng của PRRSV 18

2.1.4.4 V ật chủ và phương thức truyền lây 18

2.1.4.5 C ơ chế gây bệnh của virus 19

2.1.5.1 Ch ẩn đốn qua các dấu hiệu lâm sàng 21

2.1.5.2 Ch ẩn đốn dựa vào bệnh tích 23

2.1.5.3 Ph ương pháp huyết thanh học 25

2.1.6 Thu thập mẫu bệnh phẩm nghi mắc Hội chứng rối loạn sinh sản 26

và hơ hấp để chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

2.1.6.1 Ph ương pháp lấy mẫu 26

2.1.6.2 B ảo quản và vận chuyển 26

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về PRRS 27

CHƯƠNG III – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.3.1 Phân lập, giám định virus PRRS trong các ổ dịch tự nhiên 31

3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm triệu chứng, bệnh tích lợn mắc PRRS 31

3.4 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 31

4.1 Kết quả phân lập, giám định virus PRRS từ các mẫu bệnh phẩm 43

4.2.1 Kết quả phân tích trình tự gen NSP2 48

4.3 Kết quả theo dõi các biểu hiện lâm sàng 53

60

4.4.2 Bệnh tích ñại thể ở lợn choai mắc PRRS 62

4.5 Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý vi thể ở lợn mắc PRRS 70

4.5.1 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở lợn con mắc PRRS 70

4.5.2 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở lợn choai mắc PRRS 73

4.5.3 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở lợn nái mắc PRRS 74

PRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

PCR: Polymerase chain reaction

RT-PCR: Real time - polymerase chain reaction

IPMA: Immunoperoxidase monolayer assay

ELISA: Enzyme linking immuno sorband assay

EAV: Equine arteritidis virus

LDHV: Lactate dehydrogenase elevating virus

SHFV: Simian haemorrhagic fever virus

DNA: Deroxyribonucleic acide

RNA: Ribonucleic acide

ORF: Open reading frame

NSP: None structure protein

FAO: Food agriculture organization

OIE: Office International des Epizooties

WTO: World trade organization

H.E: Haematoxylin eosin

lập ở một số nước với VR-2332

Bảng 4.2 Số lượng mẫu xét nghiệm PRRS theo các ñịa phương

Bảng 4.3 Một số ñịa ñiểm ñia lấy mẫu và quan sát các triệu

Bảng 4.7 Kết quả tổng hợp mổ khám các mẫu bệnh phẩm theo

CHƯƠNG I

MỞ ðẦU

Việt Nam ñã ra nhập tổ chức Thương mại Thế giớí (WTO), giao lưu buôn bán ngày càng ñược ñẩy mạnh, trong ñó có trao ñổi ñộng vật và các sản phẩm nguồn gốc từ ñộng vật Trong quá trình giao lưu buôn bán, việc nhập khẩu con giống cũng như các sản phẩm làm thức ăn chăn nuôi với mục ñích nâng cao năng suất chăn nuôi cũng khó tránh khỏi nguy cơ làm cho dịch bệnh gia súc có ñiều kiện xâm nhập

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory

Syndrome - PRRS) còn gọi bệnh Tai xanh là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn mọi lứa tuổi, lây lan nhanh Mầm bệnh PRRS có thể ghép với nhiều loại mầm bệnh vi khuẩn và virus khác, do ñó làm ốm và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh, gây ra những tổn thất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi

Bệnh gây ra do virus PRRS (PRRSV), lần ñầu tiên ñược phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 và sau ñó ở Châu Âu và Châu Á vào những năm 90 Hiện nay, hội chứng này ñã trở thành dịch ñịa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà Lan, ðan Mạch, Anh, Pháp, ðức… và ñã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi

Ở Việt Nam, lợn ñược lấy huyết thanh phát hiện kháng thể dương tính với PRRSV lần ñầu tiên vào năm 1997 Sau ñó, các kết quả ñiều tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống phía Nam cho thấy có sự lưu hành của PRRSV ñộc lực thấp, nhưng ñến trước tháng 3/2007 chưa có ổ dịch nào ñược báo cáo chính thức trong phạm vi cả nước

Theo Cục Thú y (2008) [3], do lần ñầu tiên dịch PRRS thể lâm sàng xuất hiện tại Việt Nam và do không quản lý ñược việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch ñã lây lan và phát triển mạnh tại 6 tỉnh khác thuộc ñồng bằng sông Hồng với tổng số lợn mắc bệnh là 31.750 con Sau 3 tháng, dịch ñược

khống chế tại các tỉnh phía Bắc, nhưng đợt dịch thứ 2 lại bùng nổ vào ngày 25/6/2007 ở một số tỉnh miền Trung, nặng nhất ở tỉnh Quảng Nam, với tổng

số lợn mắc bệnh là 33.839 con Dịch PRRS tiếp tục diễn ra lẻ tẻ với qui mơ nhỏ hơn trong suốt các tháng cuối năm 2007 Sau đĩ, cuối tháng 3/2008 dịch PRRS nổ ra ở Hà Tĩnh và bùng phát dữ dội ở các tỉnh Thanh Hố, Nghệ An và tiếp đến dịch được phát hiện ở Quảng Nam, Lâm ðồng, Thừa Thiên Huế, Thái Nguyên, Ninh Bình, Nam ðịnh, Thái Bình; đến ngày 19/5/2008 đã cĩ 60 huyện, thị, 820 xã xuất hiện dịch với tổng số lợn mắc bệnh là 268.292 con, số tiêu huỷ là 268.378 con

Hiện nay, virus lưu hành rộng rãi trên đàn lợn mắc bệnh đã khỏi về triệu chứng lâm sàng và tiếp tục được bài thải, phát tán ở nhiều địa phương Do chăn nuơi nhỏ lẻ, phân tán, khơng áp dụng các biện pháp an tồn sinh học, chưa quản lý tốt việc vận chuyển buơn bán lợn nên nguy cơ dịch tái phát, nổ

ra ở bất cứ địa phương nào, đặc biệt khi thời tiết thay đổi tạo điều kiện thuận lợi cho virus gây hội chứng PRRS và các mầm bệnh khác phát triển gây bệnh Xuất phát từ đặc điểm dịch tễ học của Hội chứng gây rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn cĩ sự khác thường về triệu chứng lâm sàng so với các mơ tả trước năm 2007, chúng tơi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:

“Phân lập giám định virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp

ở lợn, nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý ở lợn mắc bệnh”

Với mục tiêu: Xác định được nguyên nhân chính gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn và biến đổi bệnh lý đặc trưng ở lợn mắc PRRS

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Giúp các cán bộ làm cơng tác thú y, người chăn nuơi hiểu rõ thêm về bệnh, nắm bắt được các đặc điểm của bệnh về triệu chứng, bệnh tích để chẩn đốn nhanh, đúng bệnh từ đĩ đưa ra

các biện pháp phịng trừ bệnh kịp thời nhằm nâng cao hiệu quả trong chăn nuơi

ðối tượng và phạm vi nghiên cứu: Lợn bệnh từ các ổ dịch đưa về Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương và các mẫu lợn Trung tâm đi mổ khám lấy mẫu ở một số ổ dịch ở các địa phương

CHƯƠNG II - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI

2.1 Giới thiệu chung về PRRS

2.1.1 Khái quát về PRRS

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory

syndrome - PRRS) ñược ghi nhận lần ñầu tiên trên thế giới vào năm 1987 ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota Năm 1988 bệnh lan sang Canada Sau ñó bệnh xuất hiện ở ðức năm 1990; Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ và Anh năm 1991 và ở Pháp năm 1992

PRRS là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn (kể cả lợn rừng), biểu hiện ñặc trưng của lợn bệnh là các rối loạn về sinh sản ở lợn nái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu Lợn con theo mẹ, lợn nái hậu bị có biểu hiện viêm ñường hô hấp rất nặng, tỷ

lệ chết cao Bệnh bùng phát và gây rối loạn hô hấp, sinh sản ở lợn mọi lứa tuổi với các triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn hàng loạt, hắt hơi, sổ mũi, tăng tần số hô hấp, thở khó, há mồm ra

ñể thở Lợn con thường có tỷ lệ chết cao, lợn lớn tỷ lệ chết thấp hơn nhưng thường bị bội nhiễm thêm các loại vi khuẩn gây bệnh khác ñặc biệt là vi khuẩn gây bệnh ở hệ hô hấp (Phạm Gia Ninh biên dịch, 2000) [14]

Bệnh do hai dòng virus gây ra là dòng Châu Âu với tên gọi là Lelystad và dòng Bắc

Mỹ với tên gọi là VR-2332, bệnh lây lan nhanh và mạnh

Bảng 2.1 Lịch sử phát hiện bệnh Quốc gia Năm xuất

Meredith 1992 ðan Mạch 1992 Botner và cs 1994

Hồng Kông 1991 Chang và cs 1993

PRRS lần ñầu tiên ñược phát hiện, mô tả và thông báo ở Mỹ vào năm 1987, với biểu hiện triệu chứng ở cơ quan sinh sản và hô hấp Lợn nái mắc bệnh tăng tỷ lệ sảy thai ở thai kỳ cuối, ñẻ non, ñẻ ra lợn con yếu hoặc chết, tỷ lệ ñẻ thấp, sau ñó chậm ñộng dục trở lại Tỷ lệ chết cao ở lợn con và lợn con sau cai sữa Lợn con ñang bú sữa hoặc lợn con ñã cai sữa có biểu hiện triệu chứng hô hấp rất nghiêm trọng Sau ñó cũng vào năm 1987 bệnh thấy ở Canada, Nhật Bản, ðức, Hà Lan…

Từ bảng lịch sử phát hiện bệnh cho thấy: Châu Á dịch ñã xuất hiện từ rất sớm, năm

1989 tại Nhật Bản Châu Âu bệnh bắt ñầu xuất hiện năm 1990 ở ðức, sau ñó lan ra rộng khắp (Shimizu và cs, 1994) [35] Bệnh xuất hiện lúc ñầu với rất nhiều tên gọi khác nhau như bệnh thần bí ở lợn, bệnh lợn PRRS, hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn … ðiều này ñược tổng hợp tại bảng một số tên gọi của bệnh dưới ñây:

Bảng 2.2 Một số tên gọi của bệnh

Bệnh bắ hiểm ở lợn (Mystery swine disease) Khi chưa biết rõ nguyên nhân bệnh (ựược sử

dụng nhiều ở Mỹ) Bệnh PRRS Tai một số lợn nái mắc bệnh có màu xanh

Hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn (Swine

infertility and abortion syndrome)

Lợn nái bị bệnh thường vô sinh và sảy thai

Hội chứng sảy thai và bệnh ựường hô hấp

(Porcine epidemic abortion and respiratory

syndrome)

Lợn bị sảy thai và bệnh ựường hô hấp

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

(Porcine reproductive and respiratory

syndrome)

Lợn bị rối loạn sinh sản và bệnh ựường hô hấp

đến năm 1991 khi bệnh lây lan ra nhiều nước trên thế giới với triệu chứng hô hấp

và sinh sản ựặc trưng, nên tại liên minh Châu Âu, bệnh có tên chắnh thức là ỘPorcine

reproductive and respiratory syndromeỢ - viết tắt là PRRS, bên cạnh các tên như nêu trong bảng trên (Zimmermen và cs, 1999) [40] Năm 1992 Tổ chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc tế cho bệnh này Ngày nay tên PRRS ựã ựược sử dụng rộng rãi

2.1.3 Tình hình hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)

2.1.3.1 Trên th ế giới

Những dấu hiệu ựầu tiên của PRRS ựã ựược biết ựến từ những năm 1981 - 1983, nhưng bệnh lần ựầu tiên ựược khẳng ựịnh vào năm 1987 ở Mỹ Cũng năm 1987 ở Canada xuất hiện bệnh, năm 1989 bệnh xuất hiện ở Nhật Bản, đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Pháp, Anh năm 1991, đan Mạch năm 1992 Ầ Năm 1992 dịch lan tràn nhiều nơi trên thế giới

Thống kê từ năm 2005 - 2007 một số nước thông báo có dịch bao gồm:

+ Canada, Colombia, Costarica, Pháp, Ireland, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines có dịch từ tháng 7 - 12 năm 2006

+ đức, Hà Lan có dịch từ tháng 7 - 12 năm 2005

+ Bồ đào Nha có dịch từ tháng 1 - 6 năm 2005

5 ngày bệnh có thể lây ra toàn ñàn, với biểu hiện sốt cao 40 - 420C, nên năm 2006 bệnh này

còn có tên là “Bệnh sốt cao” Năm 2007 dịch lại bùng phát ở Trung Quốc, xảy ra ở 26/33

tỉnh với 257.000 con mắc, chết hơn 68.000 con, tiêu huỷ 175.000 con Tại Trung Quốc, ñã phân lập từ bệnh phẩm của lợn bị bệnh ñược cả chủng ñộc lực thấp và ñộc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ

+ Hồng Kông, dịch PRRS ñã xuất hiện khá lâu, từ những năm 1991 do cả 2 dòng Châu Âu và Bắc Mỹ

+ Philippines dịch PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con Sau ñó dịch lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y, 2008) [3]

2.1.3.2 T ại Việt Nam

Năm 1997 lần ñầu tiên trong lịch sử, PRRSV ñược phát hiện ở ñàn lợn giống ngoại nhập về từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Sau khi kiểm tra 51 con có 10/51 con có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này ñã ñược xử lý ngay sau ñó Tuy nhiên, những năm tiếp theo các nghiên cứu của (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, Nguyễn Ngô Minh Triết, 2000) [6] ở 17 trại của 5 tỉnh phía Nam cho thấy, trong 3.402 mẫu huyết thanh xét nghiệm có 596 mẫu có kháng thể PRRS Như vậy có thể thấy PRRSV ñã xuất hiện và lưu hành ở nước ta

Theo báo cáo của Cục Thú y, kể từ tháng 3 năm 2007 ñến nay, trên cả nước dịch PRRS ñã bùng phát thành 4 ñợt dịch lớn:

*) ðợt dịch thứ nhất diễn ra từ ngày 12/03/2007 ñến 15/5/2007

ðây là lần ñầu tiên dịch PRRS bùng phát trên ñàn lợn nước ta Bắt ñầu tại Hải Dương sau ñó ñã lây lan nhanh và phát triển mạnh trên 146 xã, phường thuộc 25 huyện, thị xã của 07 tỉnh ñồng bằng Sông Hồng ñó là Hải

Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng Số lợn mắc bệnh là 31.750 con, số lợn chết và xử lý là 7.296 con

*) đợt dịch thứ hai diễn ra từ ngày 25/06/2007 ựến 11/12/2007

Dịch bắt ựầu xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam, từ ựây dịch lây lan ra tổng số 178 xã, phường của 40 huyện, thị xã thuộc 14 tỉnh, thành phố là Cà Mau, Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu, Khánh Hòa, Bình định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương Tổng số lợn ốm là 38.827 con, số ựã chết

và xử lý là 13.070 con

Như vậy, trong năm 2007, dịch PRRS ựã xuất hiện tại 324 xã, thuộc 65 huyện của

19 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số chết và phải tiêu hủy là 20.366 con

*) đợt dịch thứ ba diễn ra từ ngày 28/03/2008 ựến 20/5/2008

Dịch xuất hiện ở nhiều xã thuộc 10 tỉnh miền Bắc, Trung bộ như Hà Tĩnh, Lâm đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Thanh Hóa, Ninh Bình, Nam định, Thái Bình và Thái Nguyên Số xã, phường có dịch là 821 xã, 59 phường và huyện, thị với tổng

số lợn mắc bệnh là 271.439 con, số chết và phải tiêu hủy là 270.393 con

*) đợt dịch thứ tư diễn ra từ ngày 04/6/2008 ựến ngày 22/8/2008

Trong ựợt này, dịch bệnh xảy ra lẻ tẻ ở 128 xã trên 38 huyện thị của 17 tỉnh thành thuộc cả ba miền Bắc, Trung, Nam nhưng với với quy mô nhỏ hơn so với các ựợt trước ựó

Số lợn ốm là 37.247 con, trong ựó số lợn chết và tiêu huỷ là 29.383 con

Kết quả thống kê qua các ựợt dịch cho thấy: (1) Lợn mọi lứa tuổi ựều mắc, nhưng lợn nái và lợn con theo mẹ chiếm ựa số; (2) Tỷ lệ lợn mắc PRRS tại Việt Nam cao hơn so với những nghiên cứu ựánh giá của quốc tế; (3) Dịch lây lan nhanh do không quản lý ựược việc vận chuyển buôn bán lợn ốm, do việc giết mổ lợn bệnh bừa bãi tại ựịa phương không kiểm soát ựược, do người dân thiếu kiến thức về dịch PRRS nên không khai báo dịch hoặc bán tháo bán chạyẦ, (4) Tại ổ dịch, ngoài PRRSV là nguyên nhân chắnh, người ta còn xác ựịnh ựược rất nhiều vi khuẩn, virus kế phát, cộng phát khác có thể gây chết lợn

Một câu hỏi ựặt ra là Ộnguồn gốc PRRS từ ựâu?Ợ, ở trong nước hay từ nơi khác xâm

nhập vào? Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung ương kết hợp với bộ Nông nghiệp Mỹ, Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung Quốc phân tắch cấu trúc gen của virus PRRS ựộc lực cao ựang

lưu hành ở Việt Nam Theo kết quả ban ñầu khẳng ñịnh có sự tương ñồng tới 83% với dòng Bắc Mỹ và gần 99% với chủng virus ñộc lực cao của Trung Quốc theo (Tô Long Thành và Nguyễn Văn Long, 2008) [18] Một câu hỏi nghi vấn ñặt ra là có thể virus PRRS của Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc?

2.1.4 Virus học PRRS

2.1.4.1 Ngu ồn gốc và phân loại PRRS

Khi dịch bệnh xảy ra, lúc ñầu người ta cho rằng một số virus như: Parvovirus, virus giả dại (Pseudorabies), virus cúm lợn (Porcine entero virus), ñặc biệt virus gây viêm cơ tim (Encephalomyo carditis) gây nên Virus ñược phân lập ở 16 trong số 20 lợn con bị bệnh, 41 trong số 63 lợn nái bị bệnh, phát hiện thấy 75% trong số 165 lợn nái mắc bệnh có huyết thanh dương tính với PRRS, có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, ngoài ra còn phát hiện trong bào thai của lợn nái ñang chửa và ở lợn ñang phát triển Nguyên nhân gây PRRS ñã ñược Collins và cs xác ñịnh vào năm 1990, sau khi sử dụng dịch lọc bệnh phẩm của lợn ngoài thực ñịa tiến hành gây nhiễm cho lợn thí nghiệm ñã khẳng ñịnh PRRS do một loại virus gây ra (Collins và cs, 1990) [26] Năm 1991, Viện nghiên cứu Thú y Trung ương ở Lelystad (Hà Lan) sau khi ñã áp dụng ñịnh ñề Koch và phân lập virus trên tế bào ñại thực bào phế nang của lợn ñã khẳng ñịnh PRRS do virus gây ra Các tác giả Hà Lan ñặt tên virus gây bệnh là virus Lelystad (Wensvoort và cs, 1991) [37] Năm 1992 tại Mỹ các nhà khoa học cũng phân lập ñược một loại virus gây PRRS và ñặt tên là virus VR-2332 (Benfield và

cs, 1992) [24] Về mặt di truyền học và ñặc tính kháng nguyên, hai chủng virus này hoàn toàn khác nhau, người ta cho rằng nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai virus Lelystad và VR-2332 ñã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR-2332) (Tô Long Thành, 2007) [17], (Junhan và cs, 2006) [29]

Các kết quả nghiên cứu của Benfield (1992) [24], Cozelman (1993) [27], Dea (1992) [28], Saito (1996) [34], Tô Long Thành (2007) [17], cho thấy PRRSV có quan hệ gần về mặt sinh học, về cấu trúc di truyền với virus gây viêm ñộng mạch ở ngựa (Equine arteriditis virus - EAV), virus LDHV (Lactate dehydrogenase elevating virus) ở chuột và virus SHFV (Simian haemorrhagic fever virus) ở khỉ Dựa vào ñặc ñiểm ñó người ta ñưa 4 nhóm ñó vào cùng giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Virus có cấu trúc RNA, thuộc họ Togaviridae, gần giống với virus gây viêm ñộng mạch ở ngựa (EAV), Lactate dehydrogenase elevating virus của chuột (LDHV) và virus gây sốt xuất huyết trên khỉ (SHFV)

Virus rất thích hợp với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào hoạt ñộng ở vùng phổi Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả các kháng nguyên là virus, vi khuẩn,…khi xâm nhập vào cơ thể; còn riêng ñối với virus PRRS thì nó có thể tồn tại và nhân lên ñược trong các ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết các ñại thực bào (tới 40%) Do vậy, khi ñã xuất hiện trong ñàn, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt ñộng âm thầm ðiều ñó, thấy rõ trong các ñàn lợn vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt thì có sự ra tăng ñột biến

về tỷ lệ viêm phổi

Chúng ñều mang chung một số ñặc tính sau:

+ Là loại virus RNA có vỏ bọc và có khả năng sinh sản trên tế bào ñơn nhân, tế bào ñại thực bào cũng như khả năng truyền qua nhau thai ñể gây bệnh cho bào thai

+ Bộ gen dễ thay ñổi, nên tính kháng nguyên không ổn ñịnh, có khả năng trốn tránh phản ứng miễn dịch của cơ thể, nên nó tồn tại rất lâu trong cơ thể vật chủ

+ Virus VR-2332 là virus phân lập ñược ở hầu hết các nước Châu Á

Sự tương ñồng về Nucleotide ñược tổng hợp theo bảng dưới ñây:

Bảng 2.3 Sự tương ñồng về Nucleotide của các chủng virus phân lập ở một số nước

với VR-2332 Giống Nguồn Gốc Tương ñồng (%)

Taiwan Taiwan 97 807/94 Canada 92 Olot Tây Ban Nha 66

2.1.4.2 Hình thái và c ấu trúc của PRRSV

Virus gây ra PRRS ở lợn thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, chứa duy nhất hệ gen RNA sợi ñơn dương

Virus PRRS có cấu trúc hình cầu, gồm 20 mặt ñối xứng, ñường kính hạt virion của virus vào khoảng 45 - 55 nm, thậm chí lên ñến 80 nm Nhân nucleocapsid có ñường kính

25 - 35 nm, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra rất rõ trích theo William T., Christianson và Han Soo Joo (2001) số 2 [22]

Hình ảnh về hình thái của PRRSV

Acid Nucleic

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp DNA

là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2-deoxyuridin và mitomycin C chứng tỏ acid nucleic ñó

là RNA

Sợi RNA này có khối lượng khoảng 15.1 kb

HA Cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Hình ảnh cấu trúc hệ gen của PRRS

Protein

Virus PRRS có các loại protein cấu trúc bao gồm:

+ Nucleocapsid protein (N, ORF 7) (ORF: open reading frame) khoảng 14 - 15kDa, ñây là protein vỏ bọc nhân

Hình ảnh cấu trúc lớp vỏ capxit

+ Protein màng (M, ORF 6) khoảng 18 - 19 kDa là protein liên kết vỏ bọc

+ Glycoprotein vỏ (E , ORF 5) từ 24 - 25 kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen

Ngoài ra còn có 3 loại glycoprotein cấu trúc ít thấy hơn và ñược kí hiệu là ORF 2, 3

và 4

Kháng thể ñơn dòng kháng protein N là chủ yếu, ñồng thời cũng kháng một số protein khác mà người ta chưa xác ñịnh ñược về mặt cấu trúc Những nghiên cứu của Benfield, Nelson (1992) [24] và Wensvoort, De Kluyver (1991) [37], cho thấy các chủng virus Châu Âu tương tự nhau về cấu trúc kháng nguyên nhưng chúng có những sai khác nhất ñịnh so với chủng virus của Châu Mỹ Tương tự, dòng virus Châu Mỹ cũng có sự tương ñồng nhau về cấu trúc kháng nguyên

Các virus PRRS gây bệnh hiện nay tại một số nước ở Châu Á và một số quốc gia ở Nam Mỹ, Úc, New Zealand, Thụy ðiển và Thụy Sĩ ñã ñược xác ñịnh là từ hai chủng virus trên

Hình ảnh cấu trúc virus PRRS

Virus có 8 cấu trúc ựọc mật mã (ORFs) ựã ựược xác ựịnh chức năng đó là: ORF 1a

và 1b ựược báo trước ựể lập mã RNA polymerase bởi vì các yếu tố của chuỗi ựược bảo quản trong RNA polymerase như của các RNA virus tương tự ORF 2 ựến 6 ựược báo trước

ựể lập mã các protein kết hợp với màng của virus ORF 7 ựược báo trước ựể lập mã các protein vỏ nhân Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, virus sinh ra 6 mRNA Tất cả 6 mRNA chứa trình tự sắp xếp chung nhận ựược từ ựầu 5' của hệ RNA trong gen và tất cả

chúng ñều có ñuôi 3' polyA Muelenberg kết luận rằng dựa trên chuỗi nucleotit, tổ chức hệ gen, cách nhân lên của virus thì có thể xếp chúng vào nhóm virus ñộng mạch (arterivirus) mới

Hình ảnh cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS

Sợi RNA của virus có kích thước 15 - 15,5 kb và gồm ít nhất 8 khung ñọc mở ORF

- Open reading frame (ORF 1a, ORF 1b, ORF 2 - 7), có chức năng mã hoá cho 20 loại protein thành thục, trong ñó có 6 protein chính có khả năng trung hoà kháng thể, bao gồm 4 phân tử glycoprotein màng, 1 protein xuyên màng (M), 1 protein nucleocapsit (N), kháng thể ñơn dòng kháng protein N là chủ yếu (Youjun Feng và cs, 2009) [21]

Protein không cấu trúc số 2 (NSP2) và glycoprotein 5 (ñược mã hoá bởi ORF 5) ñược coi là 2 vùng có tính ñồng nhất cao và là những vùng ñóng vai trò quyết ñịnh tính gây bệnh của các chủng PRRSV ðây là hai ñoạn có khả năng biến ñổi rất lớn, quyết ñịnh ñộc lực của virus Người ta dựa vào ñây ñể ñịnh type virus (Tô Long Thành, 2007) [17]

Cũng dựa vào protein không cấu trúc này mà từ 2 dòng virus ban ñầu là dòng Châu

Âu và dòng Bắc Mỹ, hiện nay PRRSV ñã biến ñổi thành nhiều chủng khác nhau Dòng Bắc

Mỹ có chủng P129, MN184, 2 chủng này có nhiều ñoạn ñứt trên protein NSP2, dòng Bắc

Mỹ khi lan sang Trung Quốc, Việt Nam ñã tạo ra 1 chủng mới có sự ñứt ñoạn 30 aa trong protein NSP2 ở vị trí aa thứ 481 và 532 - 560 (Youjun Feng và cs, 2009) [21]

2.1.4.3 S ức ñề kháng của PRRSV

Virus PRRS tồn tại 1 năm trong nhiệt ñộ lạnh từ – 200C ñến – 700C, 40C virus tồn tại ñược 1 tháng, PRRSV ñề kháng kém ở nhiệt ñộ cao, ở 370C sống ñược 48 giờ, 560C bị giết sau 1 giờ Với các chất sát trùng thông thường và môi trường acid, virus dễ dàng bị tiêu diệt, ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virus rất nhanh (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2007) [5], (Trần Thị Bích Liên, 2008) [8], (Tô Long Thành, 2007) [17]

Tính gây nhiễm của PRRSV bị ảnh hưởng bởi pH, PRRSV chịu ñựng ñược pH trong khoảng 6,5 - 7,5, khả năng gây nhiễm của PRRSV bị bất hoạt nhanh chóng ở pH < 6

và pH > 7 (Benfield và cs, 1992) [24], (Bùi Quang Anh và cs, 2008) [2]

Trong thịt ñông lạnh ở 40C PRRSV tồn tại tới 48 giờ PRRSV bất hoạt nhanh chóng trong ñiều kiện khô hạn ở môi trường bên ngoài, nhưng tồn tại ñược 9 ngày trong nước giếng, 11 ngày trong nước máy (Trần Thị Bích Liên, 2008) [8]

Trong mẫu huyết thanh ở 250C, thì 47%, 14%, 7% mẫu huyết thanh vẫn phân lập ñược PRRSV trong 24, 48, 72 giờ Ở 40C hoặc – 250C, thì 85% mẫu huyết thanh vẫn phân lập ñược PRRSV trong 72 giờ (Zimmermen và cs, 1999) [40]

2.1.4.4 V ật chủ và phương thức lây truyền

Khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một ñặc tính sinh học quan trọng Mầm bệnh

có ñộc lực càng cao, khả năng gây bệnh càng lớn và ngược lại Tuy vậy, nó còn phụ thuộc rất lớn vào vật chủ, các nhân tố trung gian và phương thức lây truyền, ñể mầm bệnh ñó phát triển, phát tán và hình thành dịch

Vật chủ của PRRSV là lợn Lợn ở tất cả các giống, các lứa tuổi ñều mẫn cảm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Vịt trời, thuỷ cầm chân màng, lợn rừng là loài mang trùng Vì thế lợn rừng, vịt trời, thủy cầm ñược coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán mầm bệnh PRRSV ñược xác ñịnh là không lây sang gia súc khác và người (Tô Long Thành, 2007) [17]

ðường truyền lây là một yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng tới tốc ñộ lây lan và quy

mô dịch bệnh truyền nhiễm

PRRSV có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng Từ ñây mầm bệnh ñược bài thải và phát tán ra môi trường bên ngoài Nhiều tác giả cho rằng trong tinh dịch của lợn ñực giống bị PRRS cũng là nguồn lây lan virus (Yaeger và

cs, 1993) [39] Lợn nái ñang chửa bị bệnh, virus có thể truyền qua nhau thai cho thai lợn

(Christianson và cs, 1993) [25] Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể ñào thải virus ra môi trường

Tóm lại, PRRS truyền chủ yếu theo ñường không khí, lây trực tiếp do tiếp xúc hay gián tiếp qua nhân tố trung gian mang mầm bệnh như phân, rác, chất ñộn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, thức ăn và nước uống bị ô nhiễm…

2.1.4.5 C ơ chế gây bệnh của virus

ðặc trưng nổi bật của họ virus Arteriviridae là khả năng thích ứng ñặc biệt trên tế bào ñại thực bào ðối với PRRSV, tế bào ñại thực bào phế nang phổi là tế bào thích ứng ñặc biệt ðại thực bào là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào Vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn tế bào ñại thực bào trong phế nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2007) [5]

Hình ảnh PRRSV phá huỷ ñại thực bào ở phổi

Lúc ñầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Trong hệ thống miễn dịch, đại thực bào là tế bào trình diện kháng nguyên, là loại tế bào đĩng vai trị mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch Khi đại thực bào bị tấn cơng và phá huỷ thì khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể giảm, rất dễ mắc các bệnh nhiễm trùng

kế phát khác ðối với lợn thịt sắp xuất chuồng khi mắc PRRS, những biểu hiện bệnh ở đường hơ hấp là rất rõ ràng

Khi con vật bị PRRS sẽ bị viêm phổi rất nặng nề, dĩ nhiên khả năng cung cấp oxy cho cơ thể sẽ bị giảm, gây rối loạn chuyển hố các chất trong cơ thể ðặc biệt nguy hiểm với con vật đang mang thai, nhu cầu về năng lượng, oxy tăng, nên rất dễ bị sảy thai, thai suy dinh dưỡng và chết thai Ngồi ra virus cịn cĩ thể truyền qua nhau thai để gây bệnh cho thai (Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, 2007) [20]

Nhìn chung lợn ở mọi lứa tuổi đều cĩ thể mắc, nhưng bệnh sảy ra trầm trọng ở lợn nái và lợn con

2.1.5 Các kiến thức về chẩn đốn

2.1.5.1 Ch ẩn đốn qua các dấu hiệu lâm sàng

Theo ghi nhận của nhiều nghiên cứu về các dấu hiệu triệu chứng lâm sàng ở lợn mắc Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp cho thấy, lợn bệnh thường cĩ các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn đỏ ở da, thở khĩ, phân thường táo bĩn hoặc ỉa chảy và một

số triệu chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát và từng loại lứa tuổi của lợn:

*) Lợn nái:

Các triệu chứng chủ yếu là tím tái âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàng loạt,

đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độ tuổi của thai: Thai dưới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết là 93,75% (Phạm Ngọc Thạch và cs, 2007) [15]

Lợn nái trong giai đoạn nuơi con thường lười uống nước, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung và âm đạo, mí mắt sưng, cĩ thể thấy phân táo bĩn hoặc ỉa chảy, bị viêm phổi

*) Lợn đực giống:

Triệu chứng chủ yếu là viêm dịch hồn, bìu dái thấy nĩng đỏ, (chiếm 95%), dịch hồn cĩ biểu hiện sưng đau, lệch vị trí (85%), giảm tính hưng phấn trong hoạt động giao phối (Lê Văn Năm, 2007) [13]

Lợn đực giống giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch thường ít, chất lượng tinh dịch kém, thể hiện: nồng độ tinh trùng (C) thường dưới 8x107; hoạt lực của tinh trùng (A) dưới 0,6; sức kháng của tinh trùng (R) dưới 3000; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) tăng trên 10%; tỷ lệ sống của tinh trùng giảm xuống cịn dưới 70% và độ nhiễm khuẩn tăng cao trên 2x104 Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản (Nguyễn Văn Thanh, 2007) [16]

*) Lợn con theo mẹ:

Thể trạng gầy yếu, triệu chứng phát ra đột ngột, đường huyết hạ thấp do khơng bú

mẹ, mí mắt sưng, cĩ dử màu nâu, trên da xuất hiện những đám phồng rộp (Phạm Ngọc Thạch và cs, 2007) [15]

Lợn con thường tiêu chảy hàng loạt và rất nặng, phân dính đầy xung quanh hậu mơn ðây là triệu chứng đặc trưng của PRRS ở lợn con chưa cai sữa, biểu hiện này khơng phổ biến ở lợn lớn Phát ban đỏ là biểu hiện phổ biến thứ hai và xảy ra ngay sau khi bệnh bắt đầu xuất hiện Chảy nước mắt, mắt cĩ dử và mí mắt sưng húp là biểu hiện phổ biến thứ 3, kết hợp với các dấu hiệu lạc giọng, khản tiếng, thở khĩ, thở thể bụng, chảy nước mũi, khớp đau, sưng to nên chân thường chỗi ra, đi lại khĩ khăn, tỷ lệ tử vong cao (Archie Hunter, 1996) [23]; (Lê Văn Năm, 2007) [13]

*) Ở lợn con sau cai sữa và lợn thịt:

Ở lợn thịt, các dấu hiệu triệu chứng tập trung chủ yếu ở đường hơ hấp Lợn bị viêm phổi nặng, ho nhiều, thở rất khĩ khăn, thở dốc, thở thể bụng, cĩ con ngồi thở như chĩ ngồi,

cĩ con tựa vào tường để lấy sức thở, hắt hơi, chảy nước mắt Do phổi bị viêm nặng nên hiện tượng da xanh (đặc biệt là tai xuất hiện sớm), điển hình và chiếm tỷ lệ lớn ở loại lợn này

Ở lợn con sau cai sữa, mí mắt thường sưng húp, cĩ màu đỏ thâm, làm cho mắt lõm sâu tạo nên một quầng thâm xung quanh mắt nên nhìn lợn giống như được “đeo kính râm”

Tỷ lệ táo bĩn ở lợn loại này rất cao nhưng tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn lợn con theo mẹ (Lê Văn Năm, 2007) [13]

2.1.5.2 Ch ẩn đốn dựa vào bệnh tích

Nghiên cứu bệnh tích là một trong những khâu quan trọng để xác định các tổn thương do bệnh nguyên gây ra Kết quả nghiên cứu về bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể

ở các nhĩm lợn bệnh của nhiều tác giả cho thấy:

*) Lợn nái chửa: ðặc biệt là lợn nái chửa kỳ hai thường bị đẻ non hoặc đẻ chậm Trường hợp đẻ non (sảy thai) thì thấy nhiều thai chết, trên cơ thể thai chết lưu thường cĩ nhiều đám thối rữa Trường hợp đẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn nhiều so với đẻ non Song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc đẻ do thời gian đẻ kéo dài Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

*) Lợn nái nuơi con, lợn choai và lợn vỗ béo: Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như các ổ viêm áp xe đĩ khơng xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp xe thường

cĩ màu xám đỏ, rắn, chắc Khi cắt đơi đám phổi cĩ biểu hiện bệnh tích thấy cĩ mủ chảy ra,

mơ phổi cũng lồi ra và cĩ màu đỏ xám loang lổ như tuyến ức biểu hiện màu giống như đá granit Trong một thuỳ phổi cĩ nhiều đám biến đổi như mơ tả Cắt miếng phổi biến đổi bệnh tích bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng Những lợn bị táo bĩn thì ruột chứa nhiều cục phân rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng

ở những lợn bị tiêu chảy thì thành ruột mỏng, trên bề mặt cĩ phủ một lớp màu nâu

*) Lợn con theo mẹ: Xác gầy, da trùng, ruột chứa nhiều nước, đơi khi thấy cĩ một

số cục sữa vĩn khơng tiêu, thành ruột mỏng, loét van hồi manh tràng Hạch màng treo ruột xuất huyết, gan sưng và tụ huyết Thận xuất huyết lấm chấm hình đầu đinh ghim, não sung huyết, hạch vùng hầu, vùng họng và hạch amidan sưng, sung huyết (Phạm Sỹ Lăng, Phan ðăng Kỳ, 2007) [7]

Khi quan sát bệnh tích vi thể ở phổi, nhiều tác giả kết luận Thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm tế bào viêm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (pneumocyte) làm cho phế nang bị nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào bị phân huỷ trong phế nang (Nguyễn Văn Thanh, 2007) [16]

Nghiên cứu phương pháp chẩn đốn Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn nhiều tác giả cho rằng PRRS cĩ thể chẩn đốn được bằng hai phương pháp cơ bản đĩ là chẩn đốn lâm sàng và chẩn đốn trong phịng thí nghiệm (đặc

biệt là chẩn đốn huyết thanh học) Tuy nhiên, trên thực tế để đảm bảo độ chính xác cao, việc phối hợp cả hai phương pháp là cần thiết

Về chẩn đốn lâm sàng thường dựa vào hai nhĩm triệu chứng đĩ là các triệu chứng

về rối loạn hơ hấp và rối loạn sinh sản

- Ở lợn nái tăng đột biến tỷ lệ sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, tỷ lệ lợn con sơ sinh chết cao, các hiện tượng này xảy ra trong khoảng từ 8 - 20% tổng số lợn nái của cơ sở chăn nuơi;

- Ở các nhĩm lợn khác cĩ hiện tượng đồng loạt bỏ ăn hoặc ăn ít, sốt cao 40 - 410C, khĩ thở, ban đỏ ở da, táo bĩn hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh, đặc biệt ở một số con lợn bệnh chĩp tai bị ứ huyết cĩ màu xanh tím

Khi thấy lợn cĩ các triệu chứng nêu trên, bước đầu cĩ thể nghi ngờ là Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp Tuy nhiên, để đảm bảo độ chính xác cần phải lấy mẫu bệnh phẩm (máu lợn bệnh cịn sống hoặc các tổ chức bệnh phẩm như phổi, hạch, lách, của lợn chết hoặc ốm sắp chết) để làm các xét nghiệm chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

- Dựa vào phương pháp miễn dịch đánh dấu bằng enzyme (ELISA) hoặc phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT) theo quy trình của OIE

- Phương pháp nhân gen PCR để phát hiện virus hoặc phương pháp phân lập virus gây bệnh trên các mơi trường phơi gà hoặc các mơi trường tế bào đặc biệt

Các phương pháp này cho độ chính xác cao (từ 92 - 95%) trong chẩn đốn xác định Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn (Bùi Quang Anh và cs, 2008) [2]

2.1.5.3 Ph ương pháp huyết thanh học

Cĩ thể phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn, dịch của cơ thể, từ thai chết lưu bằng nhiều phương pháp, nhưng hiện nay thường sử dụng bốn phương pháp sau (William T., Christianson và Han Soo Joo, 2001) [25]:

+ IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) - Phương pháp miễn dịch cĩ gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp ðây là phương pháp sử dụng một thảm tế bào đã gây nhiễm virus chuẩn để phát hiện kháng thể Nếu huyết thanh cĩ kháng thể thì cĩ sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng thể cĩ kết hợp khi cho cơ chất vào sẽ xuất hiện màu đậm, đĩ là phản ứng dương tính Phản ứng âm tính nếu thảm tế bào cĩ màu hồng nhạt

+ Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp Cơ chế giống phản ứng ELISA hay IPMA, nhưng khác là kháng kháng thể cĩ gắn chất phát quang, khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang cĩ hiện tượng phát màu

+ Phản ứng trung hồ huyết thanh SN (Serum Neutrolization)

+ Phản ứng ELISA (Enzyme linked immunosortbent assay) trực tiếp và gián tiếp, nhưng người ta thường sử dụng phản ứng ELISA gián tiếp Thực chất giống phương pháp IPMA, đĩ là sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể, kháng kháng thể cĩ gắn enzyme nên khi cho cơ chất vào cĩ hiện tượng phát màu

Phản ứng IPMA là phản ứng được dùng đầu tiên để phát hiện kháng thể PRRS và hiện nay vẫn đang được sử dụng nhiều ở Châu Âu IPMA cĩ thể được làm trên thảm tế bào PAM, CL2621 hoặc MA104, MARC145

Phản ứng ELISA được sử dụng nhiều ở Mỹ, đây là phản ứng sử dụng kháng nguyên gắn vào đĩa mà virus chuẩn được gây nhiễm trên tế bào PAM

2.1.6 Thu thập mẫu bệnh phẩm nghi mắc Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp để chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

2.1.6.1 Ph ương pháp lấy mẫu

Trường hợp tiến hành mổ khám tại thực địa, nơi cĩ ổ dịch, chọn các con chết điển hình, lấy các cơ quan phủ tạng (lách, hạch, thận, phổi) bảo quản trong điều kiện lạnh cho xét nghiệm virus; ðồng thời lấy tất cả các cơ quan tổ chức trong cơ thể, mỗi loại cắt dày khơng quá 0,5 cm bảo quản trong dung dịch formalin 10% theo tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm + 9 phần formalin cho làm xét nghiệm bệnh tích vi thể

ðối với các mẫu máu lấy yêu cầu bảo quản cĩ chất chơng đơng (EDTA) để làm xét nghiệm virus huyết; Hoặc lấy các mẫu máu để đơng, chắt lấy huyết thanh cho làm xét nghiệm phát hiện kháng nguyên, kháng thể

Tất cả các mẫu vật cần được gửi nhanh đến phịng thí nghiệm và được bảo quản theo yêu cầu kỹ thuật, cĩ báo cáo diễn biến tình hình và biên bản mổ khám, lấy mẫu kèm theo

2.1.6.2 B ảo quản và vận chuyển

ðối với mẫu bệnh phẩm nguyên con (lợn choai, lợn con sau cai sữa, thai chết) nghi mắc bệnh cĩ thể gửi nguyên con mới chết hoặc sắp chết (gửi càng nhanh càng tốt) Hoặc

ñiều kiện có thể mổ khám ñược thì cần lấy các cơ quan phủ tạng (lách, hạch, thận, phổi) bảo quản trong phích ñá có ñá lạnh gửi nhanh về phòng thí nghiệm cho xét nghiệm virus; ðồng thời lấy tất cả các cơ quan tổ chức trong cơ thể, mỗi loại cắt dày không quá 0,5 cm bảo quản trong dung dịch formalin 10% theo tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm + 9 phần formalin cho làm xét nghiệm bệnh tích vi thể

ðối với mẫu bệnh phẩm máu có chất chống ñông (EDTA) và mẫu huyết thanh ñã chắt ra khỏi máu ñông, bảo quản trong phích ñá có ñá lạnh gửi nhanh ñến phòng xét nghiệm cho xét nghiệm virus huyết hoặc phát hiện kháng nguyên, kháng thể

(Các phương pháp mổ khám, lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu gửi ñi xét nghiệm ñược áp dụng theo tiêu chuẩn OIE và Tài liệu Tiêu chuẩn ngành – Cục Thú y)

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PRRS

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1987 khi lần ñầu tiên dịch PRRS ñược phát hiện ở Bắc Mỹ cho ñến nay ñã có rất nhiều công trình nghiên cứu về PRRS Nhiều thành quả ñã ñược ứng dụng và mang lại hiệu quả thiết thực cho công tác phòng, chống và kiểm soát dịch PRRS trên thế giới

Wensvoort (1991) [37], Collins (1990) [26], áp dụng ñịnh ñề Koch ñã khẳng ñịnh nguyên nhân cuả PRRS là do virus, khẳng ñịnh có hai dòng virus nguyên mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS Tác giả ñã ñặt tên cho virus gây ra PRRS ở Châu

Âu là Lelystad

Benfield (1992) [24], Cozelman (1993) [27], Dea (1992) [28], Saito (1996) [34], ñã khẳng ñịnh virus gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với virus viêm ñộng mạch ngựa, virus tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, virus gây sốt xuất huyết ở khỉ Cũng như ñưa

ra những ñặc tính quan trọng của họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Benfield (1992) [24], ñã mô tả, ñặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR-2332 và ñưa ra ñặc tính của PRRSV như sức ñề kháng của PRRSV Tác giả khẳng ñịnh PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5 - 7,5

Mengeling và cs (1996a) [31], Mengeling và cs (1998) [32], nghiên cứu về vacxin chống lại PRRSV Khẳng ñịnh virus vacxin kích thích ñáp ứng miễn dịch chậm, virus vacxin có thể truyền qua nhau thai truyền từ con mẹ sang con con

Vezina và cs (1996) [36], Yoon và cs (1995) [38], ñã nghiên cứu về quá trình ñáp ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRSV Các tác giả ñã khẳng ñịnh kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRSV Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4 - 5 tuần sau nhiễm PRRSV và ñạt tối ña vào lúc 10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm

Zimmermen và cs (1999) [40], ñã nghiên cứu một cách ñầy ñủ và sâu sắc về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Các tác giả ñã giải thích về nguồn gốc tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho ñộc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi có tên PRRS

Jun Han, Yue Wang, Kay S Faaberg (2006) [29], ñã khẳng ñịnh, về mặt di truyền học và ñặc tính kháng nguyên hai loại virus Lelystad và VR-2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai virus này ñã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc

Mỹ (VR-2332)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1997 nước ta nhập 51 con lợn giống từ Mỹ vào miền Nam, khi lấy mẫu kiểm tra có 10/51 mẫu huyết thanh dương tính với PRRS Từ năm 1997 ñến năm 2006 có rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về PRRS nhưng chỉ dừng lại ở ñiều tra, giám sát huyết thanh học Bắt ñầu từ tháng 3 năm 2007 khi dịch PRRS thực sự bùng nổ thì việc nghiên cứu không chỉ có chiều sâu mà còn phân tích rất nhiều khía cạnh về dịch PRRS ở Việt Nam

Tô Long Thành (2007) [17], ñã trình bày một cách tổng hợp về PRRS nói chung, khẳng ñịnh lợn các lứa tuổi ñều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả ñã ñưa

ra biện pháp phòng PRRS, trong ñó nhấn mạnh việc phòng PRRS bằng vacxin

Khi lợn mắc PRRS không chỉ có những bệnh tích ñặc trưng nhất của PRRS là ở phổi và hạch lâm ba, mà còn có những bệnh tích khác do vi khuẩn kế phát gây ra Những vi

khuẩn kế phát ở ñường hô hấp và phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (Suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (Liên cầu khuẩn type 2), Bordetella bronchiseptica (Viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (Viêm ñường

hô hấp)… (Bùi Quang Anh và cs, 2007) [1]

Phạm Ngọc Thạch và cs (2007) [15], nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng, chỉ tiêu

máu ở lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã thấy rằng: thời gian nung bệnh là 3 -

7 ngày, tần số hơ hấp, tim mạch, thân nhiệt đều tăng cao so với sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh lý, sinh hố máu đều thay đổi, đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm trong máu tăng rất cao trong khi đĩ hàm lượng đường huyết giảm, protein tổng số của lợn bệnh lại giảm nhiều so với sinh lý bình thường

Lê Văn Năm (2007) [13], khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc ðồng bằng Bắc Bộ - Việt Nam nhận thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngồi nước cơng bố Nhưng điểm khác đĩ là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bĩn ở lợn lớn hơn

Tơ Long Thành, Nguyễn Văn Long và cs (2008) [18], đã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến Trung tâm Chẩn đốn thú y Trung ương nhiều hơn năm 2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS cĩ sự bội nhiễm vi khuẩn Chủng virus độc lực cao của Việt Nam cĩ sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc đến 99% Khi sử dụng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam cơng cho lợn thí nghiệm lợn khơng chết, huyễn dịch bệnh phẩm lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h ðiều này cho thấy vai trị của vi khuẩn bội nhiễm

Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên và cs (2007) [4], nghiên cứu về phương pháp chẩn đốn virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn bằng kỹ thuật RRT-PCR đưa

ra kết luận: Quy trình RRT-PCR sử dụng trong nghiên cứu cĩ tính ổn định và độ tin cậy cao, hồn tồn cho phép phát hiện được RNA của virus PRRS trong mẫu

Trần Thị Bích Liên (2008) [8], đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV ðặc biệt tác giả đưa ra phương pháp chẩn đốn PRRS như phân lập virus bằng phương pháp IPMA, IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên

sử dụng phương pháp RRT-PCR là hiệu quả nhất, phát hiện kháng thể cĩ hai phương pháp

cĩ độ chính xác cao là IPMA và ELISA

CHƯƠNG III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðịa điểm

ðể triển khai các nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tơi đã thực hiện nghiên cứu tại hai Phịng Bệnh lý, Ký sinh trùng và Phịng Virus thuộc Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương – Cục Thú y và các địa phương cĩ dịch PRRS

3.2 ðối tượng nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm lợn nguyên con nghi mắc PRRS được gửi về Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương từ các địa phương và lợn trong ổ dịch PRRS tại các địa phương khi chúng tơi đi mổ khám lấy mẫu

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Phân lập, giám định virus PRRS trong các ổ dịch tự nhiên

- Số lượng mẫu bệnh phẩm xét nghiệm PRRS của Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương trong các đợt dịch và các dịch nhỏ lẻ xảy ra tiếp theo (2007 – 2009) Số mẫu dương tính trên tổng số mẫu nhận được giám định bằng phương pháp RRT-PCR

- Phân lập virus, giải trình tự gen virus PRRS đã phân lập được (gửi mẫu hợp tác nước ngồi – Trung Quốc và Hoa Kỳ)

3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm triệu chứng, bệnh tích ở lợn mắc PRRS

- Quan sát, theo dõi triệu chứng lâm sàng

- Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS

- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể ở lợn mắc PRRS

3.4 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nguyên liệu, trang thiết bị nghiên cứu

- Các mẫu bệnh phẩm lợn bị mắc Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp

- Các máy mĩc, hĩa chất, mơi trường, Kit chẩn đốn, thuốc nhuộm dùng nghiên cứu trong phịng thí nghiệm

Thiết bị, hóa chất dùng trong nuôi cấy phân lập trên tế bào:

- Buồng cấy BSC cấp 2

- Kính hiển vi ñảo ngược

- Máy hút chân không

- Máy khuấy từ và que khuấy từ

- Cân ñiện tử chính xác 4 ñơn vị (0,0000)

- Nồi ñun cách thuỷ

- Micropipet nhiều ñầu: 5µl ñến 50µl, 50µl ñến 300µl

- Dụng cụ nuôi cấy tế bào: lọ nhựa T25, ñĩa nhựa 96 giếng, 6 giếng, 24 giếng

- Cồn Ethanol 960

- Cồn Ethanol 700

Mơi trường:

- Nước cất và nước khử ion

- Mơi trường nuơi cấy:

Tế bào: Sử dụng tế bào MARC145

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

- Các phương pháp chẩn đốn lâm sàng thường quy và mổ khám bệnh tích (Hồ Văn Nam, 1982) [10], (Hồ Văn Nam và cs, 1996) [9], (Hồ Văn Nam và cs, 1996) [11] và (Chu ðức Thắng và cs, 2008) [19]

- Kết quả phân lập, giám định virus trong phịng thí nghiệm

*) Phân lập virus trên mơi trường tế bào MARC145

- Mơi trường duy trì ( EMEM + 5% FCS)

Chuẩn bị bệnh phẩm gây nhiễm tế bào:

- Huyết thanh qua lọc

- Tổ chức: nghiền 0,5 g tổ chức gồm phổi, hạch, lách bằng cối chày sứ

- Thêm 20 ml môi trường duy trì

- đông tan 3 lần (bệnh phẩm cũ)

- Li tâm 3000 vòng/phút

- Lọc dịch ựã pha trên qua lọc minipore 0,45 ộm

Gây nhiễm tế bào MARC145

- Tế bào vừa phủ khoảng 90% chai nuôi tế bào T25 hoặc T75

- Bỏ môi trường ựang có trong bình, rửa 1 lần bằng PBS lượng 2ml

- Thêm vào 5 ml huyễn dịch virus

- đặt bình nằm trong tủ 37oC trong 1 giờ

- Loại bỏ huyễn dịch virus rửa 1 lần lượng 2 ml PBS

- Thêm 10ml EMEM duy trì

- Nuôi trong tủ 5 - 10% CO2 ở 37oC

Theo dõi hủy hoại tế bào do virus PRRS

Quan sát sự phát triển của tế bào trên kắnh hiển vi trong vòng 7 ngày Thay môi trường nếu cần (1ngày/1lần) tế bào nhiễm virus thay ựổi hình thái: co tròn thành từng ựám sau

ựó là tế bào không bám dắnh

Thu huyễn dịch tế bào có chứa virus: Cất chai tế bào có virus vào tủ âm sau 1 giờ lấy ra giải ựông Cho toàn bộ môi trường nuôi và tế bào vào ống Falcon 15ml, ly tâm, thu dung dịch ở trên và bỏ cặn tế bào

Kiểm tra sự có mặt của virus bằng phương pháp RRT-PCR

*) Phát hiện, giám ựịnh virus bằng phương pháp RRT-PCR

• Nhỏ 500µl huyễn dịch phủ tạng vào ống ly tâm loại 1,5 ml cộng với 500µl Qiagen buffer RLT có 1% β-ME, lắc ñều trên máy Votex

• Ly tâm nhẹ rồi thêm 500µl cồn ETOH 70% (ethanol) vào ống, lắc mạnh bằng máy Votex

• Ly tâm mẫu ñã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ñộ 5000xg ở nhiệt ñộ phòng;

• Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây tốc ñộ ≥ 8000xg ở nhiệt ñộ phòng;

• Bổ sung 700µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới vào cột lọc;

• Nhỏ 500µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ

≥ 8000xg, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer, thay ống thu mới;

• Ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña, bỏ ống thu;

• ðặt cột lọc vào ống thu RNA, nhỏ 50 µl RNase free H2O vào cột lọc, ủ ở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút Tách RNA bằng cách ly tâm trong 1 phút ở 10000vòng/phút, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu RNA;

• Bảo quản mẫu RNA thu ñược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ñộ thấp hơn

Primer forward 0,5 µl Primer reverse 0,5 µl

Bảng 3.1 Chu kì nhiệt của phản ứng RRT-PCR Kit Quá trình Nhiệt độ ( o C) Thời gian Số vịng

- Phân tích kết quả xét nghiệm: Các giá trị mặc định đã được thiết lập để phát hiện virus

PRRS Mẫu cĩ giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính Mẫu cĩ giá trị Ct trong khoảng 35 -

40 được coi là nghi ngờ Mẫu khơng cĩ Ct được coi là âm tính Những bệnh phẩm này cần được xác chẩn bằng phương pháp phân lập virus trước khi cĩ kết luận chẩn đốn cuối cùng