Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetate lá đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA TRẦN NGUYỄN XUÂN TRINH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC C

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA

TRẦN NGUYỄN XUÂN TRINH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH

CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA

PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng- Năm 2018

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH

CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA

PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện : Trần Nguyễn Xuân Trinh

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

Đà Nẵng-Năm 2018

Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn chân

thành đến thầy GS.TS.Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ

trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy cô

giảng dạy cô và công tác tại phòng thí nghiệm Khoa Hóa - Đại học Sư phạm Đà Nẵng

và Nhà trường đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng em xin phép được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian quý báu để nhận xét, tham gia và đánh giá khóa luận này

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Trần Nguyễn Xuân Trinh

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC 5

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC 5

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 8

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 13 1.5.1 Phương pháp MTT 13

1.5.2 Phương pháp SRB 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lí 16

2.2.1.1 Độ ẩm 16

2.2.1.2 Hàm lượng tro 16

2.2.1.3 Xác định hàm lượng kim loại 17

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực 17

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật 17

2.2.2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất 18

2.2.3 Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực 18

2.2.3.1 Alcaloid 18

2.2.3.2 Flavonoid 19

2.2.3.3 Coumarin 19

2.2.3.4 Saponin 20

2.2.3.5 Đường khử 20

2.2.3.6 Polyphenol 21

2.2.3.7 Steroid 21

2.2.3.8 Axit hữu cơ 21

2.2.3.9 Chất béo 22

2.2.3.10 Carotene 22

2.2.3.12 Iridoid 23

2.2.4 Sơ đồ điều chế các cao chiết 23

2.2.5 Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết ethyl acetace 24

2.2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư 24

2.2.5.2 Các dòng tế bào 25

2.2.5.3 Phương pháp 25

2.2.5.4 Thử độc tế bào 25

2.2.6 Định danh sơ bộ một số hợp chất có trong cao chiết ethyl acetate 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC 27

3.1.1 Độ ẩm 27

3.1.2 Hàm lượng tro 27

3.1.3 Hàm lượng một số kim loại 28

3.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI ETHYL ACETATE 29 3.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm 29

3.2.1.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate 29

3.2.1.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi ethyl acetate 30

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi ethyl acetate. 32

3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm 33

3.2.3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate 33

3.2.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate 35

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC 36

3.4 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT 38

3.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC 38

3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 KẾT LUẬN 43

2 KIẾN NGHỊ 43

O 44

Thành phần hóa học cây Đu đủ 8 1.2

Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung

thư khác nhau trong điều kiện in vitro 10

1.3 Hoạt tính chống ung thư của glucosinolate, phenolic,

flavonoid, carotenoid và alcaloid trong Đu đủ 11 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu lá Đu đủ đực 27 3.2 Kết quả hàm lượng tro của nguyên liệu lá Đu đủ đực 28 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ

3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi

3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung

3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet tối ưu bằng dung

3.7 Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm tối ưu bằng dung

3.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ siêu âm tối ưu bằng dung môi

3.9 Định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực 36

3.11 Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết ethyl acetate 39 3.12 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate trong lá

3.1 Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời

3.2 Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo tỉ lệ

3.3 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo

3.4 Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời

3.5 Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo

3.6 Sắc ký đồ GC-MS của dịch ethyl acetate lá Đu đủ đực 40

Ngày nay cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm

có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta

Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới Sản lượng

Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [11]

Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [11] Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác nhau

Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán, Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [29, 30] Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [1, 16] Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [21, 47]

Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7] Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu, Chính bởi công dụng chữa bệnh củ ều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học củ

chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ cái Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về lá của cây Đu đủ đực

Đối với việc sử dụng cây Đu đủ hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệ

ọ ứng minh Vì

vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl

acetate cây Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

chiết ethyl acetate lá Đu đủ đực (Carica papaya L.

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

này, tiến hành định danh các hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm

- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết ethyl acetate trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1.

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng

dụng của các bộ phận của cây Đu đủ

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

- Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm;

- Các phương pháp định danh thành phần hóa học;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm ( 12 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận ( 13 trang)

Kết luận và kiến nghị ( 1 trang)

Tài liệu tham khảo (1 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae) Nguồn gốc Châu Mỹ

được trồng khắp nơi ở nước ta Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [28] Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có một chi và một loài [1]

Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4

mét, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1] Cây Đu đủ còn được gọi Thù

đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành

3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [8] Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm:

- Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp

- Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày

- Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11]

A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

Đu1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [12]

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [8]

Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ phân

đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol,

cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Trong đó, sterculin A

và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [5]

Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ nhựa quả Đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [9]

bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexanee, CH2Cl2, EtOAc, buthanol)

Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, ap

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC

[30]

Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập được 2 alcaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31]

lysozyme

Năm 2012, Adlin Afzan và cộng sự đã xác định được 12 hợp chất có trong lá Đu

đủ [16] bao gồm alcaloid piperideine là carpaine; acid hữu cơ: acid malic, acid quinic; dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2); flavonol glycoside: quercetin-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranoside (manghaslin), kaempferol-3-O- (2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranoside (clitorin), quercetin-3-O-rutinoside (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin) Năm 2013, Ikeyi Adachukwu và cộng sự đã phân tích thành phần hóa học trong

lá Đu đủ Kết quả cho thấy có sự xuất hiện của các hợp chất alcaloid, flavonoid, saponin, tannin và glycoside bằng các thuốc thử đặc trưng [15]

Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong cây Đu đủ:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cây Đu đủ

Glycoside Prunasin, Sambunigrin

Sterol β-sitosterol, Daucosterol

Triterpene Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Acid hữu cơ Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl malate,

ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2)

Như vậy, thành phần hóa học các bộ phận của cây Đu đủ cái đã được nghiên cứu Các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá, quả và các bộ phận khác như rễ, thân, hạt,… cây Đu đủ cái Tuy nhiên nghiên cứu về các bộ phận như hoa và lá cây Đu đủ đực lại rất ít

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ

Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vật được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [3, 39, 49] Hoạt tính sinh học các bộ phận của cây

Đu đủ như lá, quả được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá

Năm 2012, Moses Alo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng nước

lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17]

Năm 2015, K Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của lá

Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm Kết quả cho

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết các bộ phận cây Đu đủ cái

có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây Đu đủ đực.



.ết với cồn

từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma

TG -180 ở chuột nhắt trắng Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [7]

Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [10]

50 = 2,8 μg/mL Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63% Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [36]

ịnh được phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 của lá Đu

đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50

ợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ phân đoạn CH2Cl2 của lá Đu

đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư

vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [6]

Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng Đu đủ để ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2:

Bảng 1.2 Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác

nhau trong điều kiện in vitro

Dòng tế bào ung thư Phương pháp

Tế bào ung thư vú T47D Phân mảnh

protein RIPS phân lập từ lá

- Các phân mảnh protein gây độc

tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL)

- Kích thích quá trình tự chết với biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và BCl-2 (giảm 63%)

- Tế bào ung thư dạ dày

- Ung thư tuyến tụy

- Ung thư buồng trứng

- Tế bào lymphoma

- Ung thư vú MCF-7

- Ung thư tử cung

Dịch chiết nước của lá Đu

đủ (1,25-27 mg/mL)

Tác dụng chống ung thư, nồng độ tác dụng phụ thuộc vào từng dòng

tế bào ung thư và ngăn chặn sự tổng hợp AND

- Tế bào T

- Tế bào lymphoma

- Bệnh bạch cầu mãn tính

- Ung thư gan Hep G2

- Ung thư phổi PC 14

- Ung thư tuyến tụy

- Ung thư biểu mô H2452

- Ung thư vú MCF-7

Dịch chiết nước của lá Đu

đủ (0,625-20 mg/mL)

Ức chế sự tăng sinh của các dòng

tế bào khối u rắn và tế bào tạo máu Dịch chiết nước lá Đu đủ làm giảm cytokine IL-2 và IL-4, trong khi đó lại làm tăng cytokine Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α

- Ung thư phổi LU-1

- Ung thư vú MCF-7

- Ung thư biểu mô KB

Phân đoạn dichloromethan

từ dịch chiết methanol lá Đu

đủ

Ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư phổi (IC50 tương ứng 18,21 µg/mL), tế bào ung thư vú (IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và

tế bào ung thư biểu mô (IC50 tương ứng 18,44 µg/mL)

- Ung thư vú MCF-7 Đu đủ bào ung thư máu (IC50 lần lượt

tương ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế bào ung thư phổi (IC50 lần lượt tương ứng 1,29 và 2,17 µg/mL) và

tế bào ung thư vú (IC50 lần lượt tương ứng 1,34 và 2,43 µg/mL) Tóm tắt các kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, cơ chế tác dụng của các nhóm chất glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alcaloid đã được tìm thấy trong các phần khác nhau của cây Đu đủ được thể hiện ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Hoạt tính chống ung thƣ của phenolic, flavonoid và alcaloid trong Đu

đủ

Các hợp chất đã đƣợc chiết tách Hoạt tính chống ung thƣ của các hợp

chất tinh khiết Nhóm chất: Phenolic, Flavonoid

- Ức chế sự tăng sinh tế bào

- Cảm ứng biểu hiện gen ức chế khối u

- Tăng cường chức năng miễn dịch

- Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu

Nhóm chất: Alcaloid

Carpaine

Pseudocarpaine

Nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế

các tế bào ung thư:

- Ung thư biểu mô KB

- Ung thư máu HL-60

- Ung thư phổi LU-1

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định các bộ phận cây Đu đủ cái có hoạt tính chống oxy hóa Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Đu

đủ cái còn rất hạn chế Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của cây Đu đủ đực



Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch

chiết cồn từ lá cây Đu đủ [33] Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết

RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [6]

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và cộng

sự [29] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia

(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro,

tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)

1.5.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và

đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

Nguyên liệu lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam – Đà Nẵng Lá

Đu đủ đực, sau khi được thu hái sẽ đem rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột

để sử dụng cho nghiên cứu

Cây Đu đủ đực được chọn lấy cao khoảng 1,5m -10m có nhiều lá và hoa Lá to hình chân vịt, mọc so le, cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8 -9 thùy sâu, mỗi thùy lại

bị khía thêm nữa như bị xẻ rách Lá Đu đủ đực được lựa chọn phải có màu xanh mướt, không non không già Sau khi hái đem vào bỏ cuống, rửa sạch rồi thái nhỏ khoảng 1 -2

cm, vẩy cho ráo nước Đem ra chỗ nắng to, phơi thật khô rồi đem nghiền nhỏ thành bột

Bột lá Đu đủ đục hơi thô, màu xanh, được bảo quản trong tủ lạnh khi chưa dùng đến

Hình 2.1 Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi chiết ethyl acetate

Một số hóa chất khác cũng được sử dụng

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, binh tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc,…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lí

2.2.1.1 Độ ẩm

- Tiến hành :

Chuẩn bị các cốc sứ được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong

tủ sấy đến khối lương không đổi m0 Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ

Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu nguyên liệu lá đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 100°C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2

%

1

2 1

m

m m

Trong đó: m1: khối lượng mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực khô (g)

m2: mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi sấy (g)

W : độ ẩm của mẫu(%)

Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu

Kết quả khảo sát độ ẩm của lá đu đủ đực được trình bày qua bảng 3.1

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

- Cách tính kết quả:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức:

% tro = [(m2– m0) x 100]/ m1Trong đó:

m0: khối lượng cốc sứ (g)

m1: khối lượng nguyên liệu lá Đu đủ đực khô (g)

m2: khối lượng của cốc sứ và nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi tro hóa (g)

Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

2.2.1.3 Xác định hàm lượng kim loại

Mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10ml Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS,tại đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ số 660 Trưng Nữ Vương, Quận Hải Châu, TP Đà Nẵng Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong

lá Đu đủ đực

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng Có nhiều kỹ thuật chiết như: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm

- Chiết ngâm dầm: mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với dung môi ethyl acetate Sử dụng Soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột cây) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Thực hiện chiết ngâm dầm khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian khác nhau Đối với khảo sát theo tỉ lệ lần lượt là 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30 đối với dung

môi Đối với khảo sát theo thời gian ngâm lần lượt là 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày đối với dung môi Cân 10g cho mỗi mẫu thử

- Chiết soxhlet: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi ethyl acetate bằng bộ soxhlet Sử dụng soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Thực hiện chiết soxhlet khảo sát lượng cao thu được tại các mốc thời gian 2 giờ,

4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ đối với dung môi

- Chiết siêu âm: mẫu thực vật khô được chiết siêu âm với dung môi ethyl acetate bằng máy siêu âm Sử dụng soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Thực hiện chiết siêu âm khảo sát lượng cao thu được tại thời gian và nhiệt độ khác nhau Đối với khảo sát thời gian, lần lượt cân 10 gam bột cho mỗi lần thử, khảo sát các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút đối với dung môi Đối với khảo sát nhiệt độ, lần lượt cân 10 gam bột cho mỗi lần thử, khảo sát các mốc nhiệt độ 300

C, 400C, 500C, 600C, 700C đối với dung môi

Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết siêu

âm, chiết soxhlet và chiết ngâm dầm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết

2.2.2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất

Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS trên máy GCMS tại Trung tâm Hóa học - Khoa Hóa thuộc Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc thử Mayer, Wagner:

+ Thuốc thử Mayer:

Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60mL nước cất và hòa tan 5 gam KI trong 10mL nước cất Trộn hai dung dịch, cho vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch 100mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dịch chiết, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt hoặc màu trắng