Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết n hexane lá đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA -------- TRẦN THỊ ĐỨC Ý NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC CAR

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA 

TRẦN THỊ ĐỨC Ý

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU

HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA 

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU

HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện : Trần Thị Đức Ý

Giảng viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Để có được kiến thức và kinh nghiệm như ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn trong khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã hết lòng dạy dỗ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và trang bị cho em những kiến thức cơ bản vững chắc Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo GS.TS Đào Hùng Cường và cô giáo ThS Đỗ Thị Thúy Vân, người đã tận tình hướng dẫn, góp ý, sửa chữa báo cáo và tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành đề tài khóa luận này

Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong phòng thí nghiệm

đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có cơ hội vận dụng kiến thức vào thực tiễn, thành thạo hơn trong một số thao tác thí nghiệm Những kết quả đạt được trong đề tài khóa luận này là hành trang vững chắc, là nền tảng giúp em tự tin vào công việc sau này

Cuối cùng, cho phép em được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã giành thời gian quý báu để nhận xét, đánh giá và tham gia chấm khóa luận này

Đà Nẵng, ngày 23 tháng 04 năm 2018

Sinh viên Trần Thị Đức Ý

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2.Mục tiêu nghiên cứu 2

3.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4.Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3

5.Bố cục của khóa luận tốt nghiệp 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây Đu đủ 4

1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ trong nước 6

1.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ ngoài nước 6

1.4 Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ 9

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào 15

1.5.1 Phương pháp MTT 15

1.5.2 Phương pháp SRB 15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý 18

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực 19

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật 19

2.2.2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất 20

2.2.3 Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực 20

2.2.3.1 Alkaloid 20

2.2.3.2 Flavonoid 21

2.2.3.3 Coumarin 22

2.2.3.4 Saponin 22

2.2.3.5 Đường khử 23

2.2.3.6 Polyphenol 23

2.2.3.7 Steroid 24

2.2.3.8 Axit hữu cơ 24

2.2.3.9 Chất béo 24

2.2.3.10 Carotene 25

2.2.3.11 Polysaccarid 25

2.2.3.12 Iridoid 26

2.2.4 Sơ đồ điều chế các cao chiết 26

2.2.5 Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane 27

2.2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư 27

2.2.5.2 Các dòng tế bào 28

2.2.5.3 Phương pháp 28

2.2.5.4 Thử độc tế bào 28

2.2.6 Định danh thành phần hóa học dịch chiết n-hexane 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả xác định một số đại lượng vật lý 30

3.1.1 Độ ẩm 30

3.1.2 Hàm lượng tro 30

3.1.3 Hàm lượng kim loại 31

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học lá Đu đủ đực trong dung môi n-hexane 31

3.2.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm 31

3.2.1.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi n-hexane 32

3.2.1.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi n-hexane 33

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi n-hexane 36

3.2.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm 36

3.2.3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi n-hexane 36

3.3 Kết quả định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực 38

3.4 Kết quả điều chế cao chiết 40

3.5 Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane từ lá Đu đủ đực 40

3.6 Kết quả khảo sát thành phần hóa học dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU TH M KHẢO 47

Tiếng Việt 47

Tiếng Anh 48

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

1.2 Tác dụng của chất chiết từ lá Đu đủ lên các dòng tế bào

ung thƣ khác nhau trong điều kiện in vitro 11

1.3 Hoạt tính chống ung thƣ của phenolic, flavonoid và

3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của lá Đu đủ đực 30

3.2 Kết quả khảo sát hàm lƣợng tro trong lá Đu đủ đực 30

3.3 Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại trong lá Đu đủ

3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi

3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong

3.6 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi

3.10 Khối lƣợng cao chiết từng phân đoạn 40

3.11 Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết n-hexane 41

3.12 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane lá Đu đủ

3.1 Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao n-hexane theo thời gian

3.4 Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao n-hexane theo thời gian

3.5 Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao chiết n-hexane theo nhiệt

3.6 Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực 41

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Xã hội phát triển kéo theo nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều Hiện nay, y học hiện đại đã có nhiều phương pháp điều trị bệnh với hiệu quả điều trị cao Tuy nhiên, điều trị bằng thuốc trong thời gian dài có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người bệnh và là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh khác Do đó, việc sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên an toàn hơn, không phải chịu các tác dụng hay độc tố từ các chất hóa học ngày càng được ưa chuộng

Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng rất nhiều, diện tích trồng Đu đủ cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9] Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao

Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để kháng nấm, kháng viêm Đã

có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [20, 21] Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [24] Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt,

có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [1, 14] Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [16, 32]

Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ưng thư Ở nước

ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [6]

Chính bởi công dụng chữa bệnh của lá Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học nó, nhưng chủ yếu là nghiên cứu trên Đu đủ cái Còn rất ít nghiên cứu về lá của cây Đu

đủ đực

Việc sử dụng lá Đu đủ hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian, nhiều người c n e ngại vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần

hoạt chất cụ thể của lá Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư

Chính vì những lí do trên, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực

(Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực (Carica papaya L.), góp phần cung cấp các thông

tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của ch ng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Lá Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng

- Xác định chỉ số hóa lý

- Chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực trong dung môi n-hexane bằng 3 phương pháp: ngâm dầm, soxhlet, siêu âm để lựa chọn phương pháp chiết tối ưu Từ dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, tiến hành định danh các hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm

- Tiến hành chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi: methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết n-hexane trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư v

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu thu ết

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về lá cây Đu đủ

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,

ứng dụng của lá cây Đu đủ

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

- Phương pháp trọng lượng;

- Các phương pháp chiết mẫu gồm: ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm;

- Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC - MS)

- Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

5 Bố cục của khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận tốt nghiệp gồm 50 trang; 12 bảng; 6 hình,ảnh và 36 tài liệu tham khảo Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1 – Tổng quan tài liệu (13 trang)

Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (13 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang)

Kết luận và kiến nghị (2 trang)

Tài liệu tham khảo (4 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae) Nguồn gốc Châu

Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [25] Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có một chi và một loài [1]

Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ

2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống

lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1] Cây Đu đủ còn được gọi Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên Ngoài ra cũng

có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [5] Ở Việt Nam, một số giống Đu

đủ hiện nay đang được trồng bao gồm:

- Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp

- Giống Đu đủ Mehico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao Lá xanh đậm, phiến

lá dày, cuống lá to, màu xanh

- Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam

- Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày

- Giống Đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá

- Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9]

A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

H nh 1.1 H nh ảnh Đu đủ

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [10]

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm

tỷ lệ tương ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [7]

Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ

phân đoạn chiết n-hexane của lá Đu đủ Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol,

cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Trong

đó, sterculin và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [3]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá

Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, buthanol) Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol , carpaine, pseudocarpaine Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol lần đầu tiên được phân lập từ lá Đu đủ [4]

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC

Trên thế giới, năm 1965, Govindachari T.R., Nagarajan K và Viswanathan

N đã xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alcaloid được phân lập từ lá Đu đủ 30]

Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập được 2 alcaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31]

Năm 2002, David S và cộng sự đã xác định được glycoside là prunasin và sambunigrin trong lá và thân Đu đủ [28]

Năm 2007, ntonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [18].

Năm 2008, Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu

về thành phần hóa học các bộ phận cây Đu đủ, phát hiện trong lá Đu đủ có những chất như sau: Alcaloid carpaine, pseudocarpain và dehydrocarpaine I và II, choline, carposide, vitamin C, E [22]

Năm 2012, dlin fzan và cộng sự đã xác định được 12 hợp chất có trong lá

Đu đủ [15] bao gồm alcaloid piperideine là carpaine; acid hữu cơ: acid malic, acid quinic; dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2); flavonol glycoside: quercetin-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside (manghaslin), kaempferol-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside (clitorin), quercetin-3-O-rutinoside (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin)

Năm 2015, K Kayalvizhi, Dr L Cathrine và K Sahira Banu đã khảo sát thành phần hóa học của lá Đu đủ cái ở Ấn Độ với 7 dung môi ethanol, methanol, aceton, chloroform, petroleum ether, hexane và ethyl acetate Kết quả cho thấy sự

có mặt của các hợp chất phenol, protein, amino acid, carbohydrate, glycoside, flavonoid, saponin, alcaloid, phytosterol và terpenoid [23]

Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong lá Đu đủ:

Sterculin A Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Kaempferol Acid protocatechuic

H nh 1.2 Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ

Alcaloid Carpaine, Pseudocarpain và Dehydrocarpaine I và II, Choline

Glycoside Prunasin, Sambunigrin

Sterol β-sitosterol, Daucosterol

Triterpene Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Acid hữu cơ

Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2)

Như vậy, thành phần hóa học lá Đu đủ cái đã được nghiên cứu Chưa thấy nghiên cứu trên lá cây Đu đủ đực

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ

Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vật được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 26, 34] Hoạt tính sinh học của lá Đu

đủ được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá phong phú

 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ

có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và

Năm 2012, Moses lo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng

nước lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17].

Năm 2015, K Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của

lá Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dương:

Staphylococcus aureus và Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm: Escherichia coli, Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Vibro chloreae [23]

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực

 Tác dụng trị u bướu, ung thư

Năm 2001, tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [6]

Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư v MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách

từ phôi chuột [8]

Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan riyani đã chứng minh trong lá Đu

đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) RIPs có khả năng gây độc tế bào in vitro trên các d ng tế bào ung thư v T47D với IC50 = 2,8 μg/mL Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư v T47D Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63% Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư 35]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 của lá

Đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư v MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/mL) Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ phân đoạn CH2Cl2của lá Đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư v MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [4]

Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng lá Đu đủ để ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2:

Bảng 1.2 Tác dụng của chất chiết từ lá Đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác

nhau trong điều kiện in vitro Dòng tế bào ung thư Phương pháp xử lý Kết quả

Tế bào ung thư v T47D Phân mảnh protein

RIPS phân lập từ lá

- Các phân mảnh protein gây độc tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL)

- Kích thích quá trình tự chết với biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và BCl-2 (giảm 63%)

- Tế bào ung thư dạ dày

- Ung thư tuyến tụy

Tác dụng chống ung thư, nồng độ tác dụng phụ thuộc vào từng dòng tế bào ung thư

và ngăn chặn sự tổng hợp AND

- Tế bào T Dịch chiết nước của lá

Đu đủ (0,625-20

Ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào khối u rắn và tế

- Tế bào lymphoma

- Bệnh bạch cầu mãn tính

- Ung thư gan Hep G2

- Ung thư phổi PC 14

- Ung thư tuyến tụy

- Ung thư biểu mô H2452

- Ung thư v MCF-7

Dịch chiết nước lá Đu đủ làm giảm cytokine IL-2 và IL-4, trong khi đó lại làm tăng cytokine Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α

- Ung thư phổi LU-1

- Ung thư v MCF-7

- Ung thư biểu mô KB

dichloromethan từ dịch chiết methanol lá Đu

đủ

Ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư phổi (IC50tương ứng 18,21 µg/mL), tế bào ung thư v (IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và tế bào ung thư biểu mô (IC50 tương ứng 18,44 µg/mL)

- Ung thư biểu mô KB

- Ung thư máu HL-60

- Ung thư phổi LU-1

- Ung thư vú MCF-7

Chất tinh khiết Carpaine và Pseudocarpaine phân lập từ lá Đu đủ

Carpaine và Pseudocarpaine

ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô (IC50 lần lượt tương ứng 1,13

và 1,66 µg/mL), tế bào ung thư máu (IC50 lần lượt tương ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế bào ung thư phổi (IC50 lần lượt tương ứng 1,29 và 2,17 µg/mL) và tế bào ung thư v (IC50 lần lượt tương ứng 1,34

và 2,43 µg/mL) Tóm tắt các kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, cơ chế tác dụng của các nhóm chất glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và

alcaloid đã được tìm thấy trong các phần khác nhau của cây Đu đủ được thể hiện ở Bảng 1.3:

Bảng 1.3 Hoạt tính chống ung thư của phenolic, flavonoid và alkaloid trong lá

Đu đủ

Các hợp chất đã được chiết tách Hoạt tính chống ung thư của các

hợp chất tinh khiết Nhóm chất: Phenolic, Flavonoid

- Ức chế sự tăng sinh tế bào

- Cảm ứng biểu hiện gen ức chế khối u

- Tăng cường chức năng miễn dịch

- Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào

- Ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn

- Cảm ứng quá trình tự chết

- Ức chế sự truyền tín hiệu

- Ngăn chặn sự hình thành mạch máu trong khối u

 Tác dụng chống oxy hóa

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,

Năm 2010, Satrija F và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá Đu

đủ Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau như: DPPH, 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate), acid nitric, superoxit, hydroxylion và lipid peroxidase Giá trị IC50 tương ứng của các phương pháp là: 198, 185, 244, 323, 461 và 922 µg/mL [19]

Như vậy, kết quả nghiên cứu khẳng định lá cây Đu đủ cái có hoạt tính chống oxy hóa Tuy nhiên, nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu

về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ lá Đu đủ còn rất hạn chế Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá Đu đủ đực

 Các tác dụng dược lý khác

Ngoài những hoạt tính sinh học trên, lá của cây Đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông

máu, kháng viêm,

Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của

dịch chiết cồn từ lá cây Đu đủ [33] Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố

chất chiết lá Đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở chuột

Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên chứng minh được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng

20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là

3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [4]

 Công dụng trong dân gian

Lá Đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và

cộng sự [27] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư

Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu

tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai

phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến

1.5.1 Phương pháp MTT

Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [9] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

1.5.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để

Formaran (màu tím) Tetrazolium (màu vàng)

đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh

vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào

pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào

đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

Tris-CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam – Đà Nẵng

Lá Đu đủ đực, sau khi được thu hái sẽ đem rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu

Cây Đu đủ đực được chọn lấy cao khoảng 1,5m -10m có nhiều lá và hoa Lá

to hình chân vịt, mọc so le, cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8 -9 thùy sâu, mỗi thùy lại bị khía thêm nữa như bị xẻ rách Lá Đu đủ đực được lựa chọn phải có màu xanh mướt, không non không già Sau khi hái đem vào bỏ cuống, rửa sạch rồi thái nhỏ khoảng 1 -2 cm, vẩy cho ráo nước Đem ra chỗ nắng to, phơi thật khô rồi đem nghiền nhỏ thành bột

Bột lá Đu đủ đực hơi thô, màu xanh có thể hơi vàng tùy vào loại lá thu hái, được bảo quản trong tủ lạnh khi chưa dùng đến

Hình 2.1 Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi chiết n-hexane

Một số hóa chất khác cũng được sử dụng

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không,

lò nung, máy siêu âm, soxhlet, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu để xác định độ ẩm là nguyên liệu lá Đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt

độ 1000

C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2

Cách tính độ ẩm

- Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau

khi cân Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu

- Độ ẩm được tính theo công thức sau

100

%

1

2 1

m1: khối lượng mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực bột khô (g)

m2: mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi sấy (g)

- Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

- Sau đó cho vào nung 1 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi

Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy,

là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung

Cách tính kết quả:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức:

% tro = [(m2– m0) x 100]/ m1Trong đó:

m0: khối lượng cốc sứ (g)

m1: khối lượng nguyên liệu lá Đu đủ đực khô (g)

m2: khối lượng của cốc sứ và nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi tro hóa (g)

2.2.1.3 Hàm lượng kim loại

Mẫu nguyên liệu lá Đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ số 660 Trưng Nữ Vương, Quận Hải Châu, TP Đà Nẵng

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong á Đu đủ đực

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng Có nhiều

kỹ thuật chiết như: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm

- Chiết ngâm dầm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi n-hexane Sử dụng soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột lá) trong bình chứa bằng thủy tinh, bịt đầu bằng giấy bạc Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Thực hiện chiết ngâm dầm khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian khác nhau Khảo sát theo các tỉ lệ lần lượt là 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30 với 10g nguyên liệu mỗi mẫu thử Khảo sát theo thời gian ngâm lần lượt là 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày với 10g nguyên liệu/200mL dung môi

- Chiết soxhlet: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi n-hexane bằng bộ soxhlet Sử dụng soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Thực hiện chiết soxhlet khảo sát lượng cao thu được tại các mốc thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 với 10g nguyên liệu/200mL dung môi

- Chiết siêu âm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi n-hexane bằng máy siêu âm Sử dụng soxhlet để thu cao cuối cùng vì lượng cao ít

Thực hiện chiết siêu âm khảo sát lượng cao thu được tại thời gian và nhiệt độ khác nhau Khảo sát theo các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và

150 phút Khảo sát theo các mốc nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C Với 10g nguyên liệu/200mL dung môi mỗi mẫu thử

Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết ngâm dầm, chiết soxhlet và chiết siêu âm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Lựa chọn được phương pháp chiết tối ưu với dung môi n-hexane

2.2.2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất

Việc định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, thực hiện thông qua việc đo phổ

GC-MS tại Trung tâm Hóa học – Khoa Hóa – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

2.2.3 Định tính một số hợp chất trong á Đu đủ đực

2.2.3.1 Alkaloid

Tiến hành