Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết chloroform lá đu đủ đực (carica papaya l ) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA ĐẶNG HỒ KHÁNH HÒA NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC CARICA P

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA

ĐẶNG HỒ KHÁNH HÒA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH

CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA

PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng- Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH

CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA

PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện : Đặng Hồ Khánh Hòa Lớp : 14CHD

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

Đà Nẵng-Năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập tại Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Đà Nẵng, bằng sự nổ lực của bản thân và sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, bạn bè

và người thân, em đã hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến thầy giáo GS.TS.Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

và hoàn thành báo cáo để khóa luận được hoàn thành đúng tiến độ chương trình

Em xin chân thành cảm ơn cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Hóa - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng và Nhà trường

đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Do những điều kiện chủ quan và khách quan chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong đón nhận những lời góp ý chân tình, thiết thực

từ thầy cô, bạn bè để khóa luận đạt đến sự hoàn thiện nhất

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3

5 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC 5

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC 6

1.4.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 8 1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 11 1.5.1 Phương pháp MTT 11

1.5.2 Phương pháp SRB 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Xác định các thông số vật lý 14

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học

trong lá Đu đủ đực 15

2.2.3 Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực 16

2.2.4 Sơ đồ điều chế các cao chiết 22

2.2.5 Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết chloroform 23

2.2.6 Định danh một số hợp chất có trong cao chiết chloroform 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG VẬT LÝ 26

3.1.1 Độ ẩm 26

3.1.2 Hàm lượng tro 26

3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại 27

3.2.KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU DỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI CHLOROFORM 28

3.2.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm

dầm 28

3.2.2 Kết quả khảo thời gian chiết soxhlet trong dung môi chloroform 31

3.2.3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm trong dung môi chloroform 32

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC 35

3.4 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT 37

3.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CHLOROFORM TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC 37

3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT CHLOROFORM LÁ ĐU ĐỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

1 KẾT LUẬN 41

2 KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 42

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Thế kỷ thứ XXI là thế kỷ phát triển về mọi mặt của toàn nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao Bên cạnh đó, con người cũng đang đứng trước nguy cơ mắc nhiều bệnh tật đặc biệt là các căn bệnh hiểm nghèo như ung thư Con người đã và đang từng bước tìm ra các loại thuốc và các phương pháp có khả năng kìm hãm sự phát triển của chúng Tuy nhiên, một trong những giải pháp hiện nay là dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta

Ở Việt Nam với khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của thảm thực vật, vì vậy nguồn dược liệu ở nước ta khá phong phú Một trong số

đó là cây Đu đủ Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là loại cây ăn quả có nguồn gốc

từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở nước ta, cây Đu đủ được trồng rất nhiều với diện tích trồng của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9]

Cây Đu đủ được biết đến như một vị thuốc hữu hiệu được ông cha ta sử dụng

để chữa bệnh, bồi bổ và chăm lo cho sức khỏe Trong quả Đu đủ xanh có các enzyme như papain, pepsin là một trợ giúp tuyệt vời cho quá trình tiêu hóa Quả Đu

đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột hoạt động bình thường [19] Lá Đu

đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm [1,20] Hợp chất phenol trong lá Đu đủ

đã được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa mạnh [21] Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ưng thư, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế phát triển khối u gây tế bào ung thư [6]

Chính bởi nguồn nguyên liệu có sẵn dồi dào và phong phú cùng với công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là bộ phận

lá và quả cây Đu đủ Thế nhưng những công trình nghiên cứu về lá đu đủ đực, hoa,

rễ, thân vẫn còn rất hạn chế

Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam-

Đà Nẵng”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực (Carica papaya L.), góp phần cung cấp các

thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của chúng, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Lá Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về lá cây Đu đủ

- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,

ứng dụng của các bộ phận của cây Đu đủ

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

- Phương pháp trọng lượng;

- Các phương pháp chiết mẫu gồm: ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm;

- Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC - MS)

- Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

5 BỐ CỤC CỦA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Khóa luận tốt nghiệp gồm 44 trang; 12 bảng; 10 hình ảnh và 23 tài liệu tham khảo Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1 – Tổng quan tài liệu (9 trang)

Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (13 trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang)

Kết luận và kiến nghị (1 trang)

Tài liệu tham khảo (3 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae) Nguồn gốc Châu

Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta có một chi

- Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp

- Giống Đu đủ Mehico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao Lá xanh đậm, phiến

lá dày, cuống lá to, màu xanh

- Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam

- Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày

- Giống Đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá

- Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9]

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

Hình 1.1 Hình ảnh Đu đủ

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ TRONG NƯỚC

Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ

phân đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol,

cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Trong

đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [2]

Năm 2014, Hồ Thị Hà tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu

đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, buthanol) Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được phân lập từ lá Đu đủ [3]

Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một

số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [4]

Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và β-sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [7]

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI NƯỚC

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [22]

Năm 2008, Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu

về thành phần hóa học các bộ phận cây Đu đủ, phát hiện trong lá Đu đủ có những chất như sau: Alcaloid carpaine, pseudocarpain và dehydrocarpaine I và II, choline, carposide, vitamin C, E [15]

Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-

MS bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và hexadecanoic acid, methyl ester (18,25%) [13]

Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong lá Đu đủ:

1.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ

Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học các bộ phận của cây Đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá phong phú

 Tác dụng trị giun sán

Năm 1994, Satrija F và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa

Đu đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật: Tác dụng trên Asaris sum (sán lợn) ghi nhận liều 4g và 8g nhựa/kg có khả năng diệt được 80% và 100% sán sau 7 ngày trị liệu [14]

 Tác dụng hạ huyết áp

Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ trái Đu đủ Các kết quả này cho rằng nước ép từ quả Đu đủ gây hạ huyết áp do hoạt tính trên các thụ thể α-adrenoceptive [12]

 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ

có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và

Staphylococcus aureus Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa

và Shigella flexneri Benzyl isothiocyanate phân lập từ Đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium

notatum và Shigella Rễ Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/mL, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/mL (với IC50 > 128 µg/ml) [3]

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực

 Tác dụng trị u bướu, ung thư

Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách

từ phôi chuột [8]

Năm 2017, Đỗ Thị Thúy Vân và Giang Thị Kim Liên đã công bố kết quả sàng lọc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu hái ở Quảng Nam-Đà Nẵng Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết chloroform có hoạt tính gây độc tế bào tốt trên 3 dòng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B và ung thư vú MCF-7 ở hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/Ml [4]

Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan Ariyani đã chứng minh trong lá Đu

đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs) RIPs có khả năng gây độc tế bào in

cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63% Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [23]

Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây Đu đủ cái có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư Một số chất trong cây Đu đủ cái đã được chứng minh là tác dụng lên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Tuy nhiên vẫn tập trung vào các bộ phận lá cái và quả Đu đủ Chưa có công bố về hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất phân lập từ các bộ phận khác như rễ, thân,… cây Đu

đủ cái và hoa, lá cây Đu đủ đực

 Tác dụng chống oxy hóa

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiễm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh,

Năm 2010, Satrija F và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá Đu

đủ Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau như: DPPH, 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate), acid nitric, superoxit, hydroxylion và lipid peroxidase Giá trị IC50 tương ứng của các phương pháp là: 198, 185, 244, 323, 461 và 922 µg/mL [14]

Năm 2013, Maisarah A.M và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

từ các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β-carotene Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt Tuy nhiên, hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [11]

Như vậy, kết quả nghiên cứu khẳng định lá cây Đu đủ cái có hoạt tính chống oxy hóa Tuy nhiên, nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu

về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ lá Đu đủ còn rất hạn chế Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá Đu đủ đực

20 và 30 µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là

3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [3]

 Công dụng trong dân gian

- Lá Đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu

- Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ

em

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A và

cộng sự [18] Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư

Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu

tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai

phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến

1.5.1 Phương pháp MTT

Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [9] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

Formaran (màu tím) Tetrazolium (màu vàng)

1.5.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh

vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào

pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào

đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

Tris-CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu lá của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017 Lá Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu

Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 5,0 m là cây thân thảo,

lá to có màu hơi xanh lục, lá mọc so le, có cuống dài, mỗi phiến lá chia làm 8-9 thùy sâu, đặc biệt cây đu đủ đực không có quả mà chỉ có hoa Lá Đu đủ đực được chọn là lá không bị sâu, màu xanh lục không quá non hoặc quá già Cây được chọn

để thu hái có nhiều lá và hoa Sau khi hái đem về loại sạch bụi bẩn, mủ, bỏ cuống, rửa sạch, thái nhỏ từ 1-2cm và đem phơi trong nắng nhẹ cho đến khi khô hẳn, rồi đem xay thành bột

Bột lá Đu đủ đực hơi thô, màu xanh lục, được bảo quản trong bình hút ẩm

Hình 2.1 Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi chiết chloroform

Một số hóa chất khác cũng được sử dụng

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không,

lò nung, máy siêu âm, soxhlet, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu để xác định độ ẩm là nguyên liệu lá Đu đủ đực, cân lấy khối lượng

độ 1000

C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng

Cách tính độ ẩm

- Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau

khi cân Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu

- Độ ẩm được tính theo công thức sau

100

%

1

2 1

m

m m

Trong đó:

m2: mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi sấy (g)

Tiến hành

- Cân 5 mẫu nguyên liệu lá Đu đủ đực sấy khô với khối lượng m1 đem than

C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng

- Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

- Sau đó cho vào nung 1 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong

Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy,

là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung

Cách tính kết quả:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức:

% tro = [(m2– m0) x 100]/ m1Trong đó:

m0: khối lượng cốc sứ (g)

m2: khối lượng của cốc sứ và nguyên liệu lá Đu đủ đực sau khi tro hóa (g)

2.2.1.3 Hàm lượng kim loại

Mẫu nguyên liệu lá Đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ số 660 Trưng Nữ Vương, Quận Hải Châu, TP Đà Nẵng

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng Có nhiều

kỹ thuật chiết như: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm

- Chiết ngâm dầm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chloroform Cất loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết để tiếp tục nghiên cứu

Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột lá) trong bình chứa bằng thủy tinh, bịt đầu bằng giấy bạc Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Thực hiện chiết ngâm dầm khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian khác nhau Khảo sát theo các tỉ lệ lần lượt là 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30 với 10g nguyên liệu mỗi mẫu thử Khảo sát theo thời gian ngâm lần lượt là 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày với 10g nguyên liệu/200mL dung môi

- Chiết soxhlet: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chloroform bằng

bộ soxhlet Cất loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết

Thực hiện chiết soxhlet khảo sát lượng cao thu được tại các khoảng thời gian

2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 với 10g nguyên liệu/200mL dung môi

- Chiết siêu âm: mẫu thực vật khô được chiết với dung môi chlorofỏm bằng máy siêu âm Cất loại dung môi bằng bộ soxhlet sẽ thu được cao chiết

Thực hiện chiết siêu âm khảo sát lượng cao thu được tại thời gian và nhiệt độ khác nhau Khảo sát theo các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và

150 phút Khảo sát theo các mốc nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C Với 10g nguyên liệu/200mL dung môi mỗi mẫu thử

Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết ngâm dầm, chiết soxhlet và chiết siêu âm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết Lựa chọn phương pháp chiết tối ưu với dung môi chloroform

2.2.2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất

Việc định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết chloroform lá Đu đủ đực thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, thực hiện thông qua việc đo phổ

GC-MS tại Trung tâm Hóa học – Khoa Hóa – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

2.2.3 Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực

2.2.3.1 Alkaloid

Tiến hành

Cân 5 gam bột lá Đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm

tính base Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn

Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với

2 loại thuốc thử Mayer, Wagner:

- Thuốc thử Mayer:

Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60mL nước cất và hòa tan 5 gam KI trong 10mL nước cất Trộn hai dung dịch, cho vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch 100mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dịch chiết

- Thuốc thử Wagner:

Hòa tan 1,27 gam Iod và 2 gam KI trong 20mL nước cất Thêm nước cất cho

đủ 100mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết

Hiện tượng

Khi thử dịch chiết với:

- Thuốc thử Mayer: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt hoặc màu trắng

Lưu ý: tủa tạo thành có thể tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc tan trong ethanol có sẵn trong dung dịch thử

- Thuốc thử Wagner: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

2.2.3.2 Flavonoid

Tiến hành

Cân 10 gam bột lá Đu đủ đực cho vào bình nón 100mL có nắp đậy, thêm 50mL cồn 90˚ Đậy kín Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc Cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch

Hiện tượng

- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%:

Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu dịch chiết chứa Flavonoid thì dung dịch chuyển sang vàng đậm, khi đun nóng thấy xuất hiện màu đỏ

Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1mL dịch chiết:

- Ống 1: thêm 0,5mL dung dịch NaOH 10%

- Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid:

Cân 1 gam bột lá đu đủ đực cho vào bình tam giác có nút đậy Thêm tiếp 5mL ethanol, đun cách thủy trong 5 phút Sau đó lọc lấy dung dịch cồn chiết để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích cỡ bằng nhau: