Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước

Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không thể dùng cột để phân tích pha đảo với đối tượng khác [8].

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Vũ Ngân Bình - Bộ môn Hóa

phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm Tôi cũng xin bày tỏ lòng

kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và PGS.TS Vũ Đặng Hoàng

đã tận tình hướng dẫn, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên ở

Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và các cán

bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt năm năm học qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về imipenem và cilastatin 2

1.1.1 Đặc điểm của imipenem và cilastatin 2

1.1.2 Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin 3

1.2 Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước 5

1.2.1 Pha tĩnh 5

1.2.2 Pha động 6

1.2.3 Cơ chế tách 7

1.2.4 Ưu điểm 8

1.2.5 Nhược điểm 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Nguyên vật liệu 10

2.2.1 Hóa chất 10

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 10

2.2.3 Chuẩn bị mẫu 11

2.2.4 Chuẩn bị dung môi pha động 12

2.3 Nội dung nghiên cứu 12

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.2 Thẩm định phương pháp 15

2.4 Áp dụng phương pháp 18

2.5 Xử lý kết quả 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 19

3.1.1 Khảo sát pha tĩnh 19

3.1.2 Khảo sát pha động 20

3.1.3 Khảo sát dung môi pha mẫu 23

3.1.4 Khảo sát về thể tích tiêm mẫu 23

3.1.5 Lựa chọn bước sóng phát hiện 24

3.2 Phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin 24

3.3 Thẩm định phương pháp 25

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 25

3.3.2 Độ chọn lọc 25

3.3.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 26

3.3.4 Độ lặp lại 28

3.3.5 Độ đúng 29

3.3.6 Độ thô 31

3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường 32

3.4.1 Công thức tính 32

3.4.2 Kết quả định lượng 32

3.5 Bàn luận chung 33

3.5.1 Ưu điểm của phương pháp 33

3.5.2 Nhược điểm của phương pháp 34

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

4.1 Kết luận 35

4.2 Kiến nghị 35

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận

LC-MS Liquid Chromatography - Mass

Spectrometry

Sắc kí lỏng khối phổ

RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm của IMI và CIL 2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng 4

Bảng 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát 14

Bảng 2.2 Quy trình pha các mẫu đường chuẩn 16

Bảng 2.3 Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng 18

Bảng 3.1 Kết quả độ phù hợp hệ thống……… 25

Bảng 3.2 Kết quả độ chọn lọc 26

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 26

Bảng 3.4 Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày 29

Bảng 3.5 Kết quả độ đúng của CIL 30

Bảng 3.6 Kết quả độ đúng của IMI 30

Bảng 3.7 Kết quả độ thô 31

Bảng 3.8 Kết quả định lượng imipenem trong chế phẩm 33

Bảng 3.9 Kết quả định lượng cilastatin trong chế phẩm 33

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Thienamycin 3

Hình 1.2 Cơ chế tách trong HILIC 7

Hình 3.1 Kết quả khảo sát pha tĩnh 19

Hình 3.2 Kết quả khảo sát thành phần pha động 20

Hình 3.3 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 23

Hình 3.4 Phổ hấp thụ của IMI……… 24

Hình 3.5 Phổ hấp thụ của CIL………24

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của Cilastatin 27

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của imipenem 28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong công tác phòng và điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh do nhiễm khuẩn Các kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng rất phổ biến ở Việt Nam nhưng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc cũng khá cao, trong

số đó có imipenem [5] Imipenem có phổ tác dụng rất rộng trên phần lớn các vi khuẩn Gram dương, Gram âm, ưa khí, kị khí và bền vững với các β-lactamase của vi khuẩnnên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3] Tuy nhiên, nó lại bị phân hủy bởi enzym dehydropeptidase-I (DHP-I) ở ống thận, do vậy nó thường được kết hợp với cilastatin, một chất ức chế DHP-I, trong các chế phẩm thuốc tiêm [3],[16] Theo Cục Quản lí Dược Việt Nam, từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 có 15 số đăng kí trong nước và

47 số đăng kí nước ngoài với chế phẩm chứa hai hoạt chất trên [4] Để đảm bảo được hiệu quả điều trị của imipenem trong lâm sàng cũng như giảm tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc, cần kiểm soát tốt hàm lượng của imipenem trong các chế phẩm được sản xuất

và lưu hành tại Việt Nam

Imipenem và cilastatin chủ yếu được phân tích bằng kỹ thuật sắc kí tạo cặp ion vìchúng có độ phân cực cao [2],[13],[20] Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không thể dùng cột để phân tích pha đảo với đối tượng khác [8] Một kỹ thuật khác có thể dùng để phân tích hai hợp chất trên là sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC) HILIC

sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh phân cực nên lưu giữ tốt các hợp chất phân cực như imipenem và cilastatin Theo tôi tìm hiểu, tính đến nay trên thế giới mới có một số

ít nghiên cứu sử dụng HILIC để định lượng imipenem và cilastatin trong chế phẩm, còn tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được công bố Vì vậy, tôi tiến hành đề

tài: “Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm

bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước” với hai mục tiêu chính:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng HILIC

2 Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng imipenem và cilastatin trong một chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về imipenem và cilastatin

1.1.1 Đặc điểm của imipenem và cilastatin

Imipenem (IMI) là một kháng sinh carbapenem trong nhóm β-lactam, có phổ tác dụng rất rộng nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3].IMI thường được kết hợp với cilastatin (CIL) để ức chế sự phân huỷ của IMI ở thận bởi enzyme DHP-I Đặc điểm cấu tạo và một số tính chất lý hóa của IMI và CIL được liệt kê trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số đặc điểm của IMI và CIL

3

Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều chế phẩm chứa hỗn hợp IMI và CIL đang được lưu hành Các hàm lượng hay được sử dụng làIMI 500 mg (hoặc 750 mg) và CIL 500

mg (hoặc 750 mg) với dạng bột để pha tiêm bắp; IMI 250 mg (hoặc 500 mg) và CIL

250 mg (hoặc 500 mg) với dạng bột để pha tiêm truyền tĩnh mạch [3]

1.1.2 Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin

Trên thế giới có một số nghiên cứu về phân tích đồng thời IMI và CIL trong chế phẩm Phương pháp quang phổ đạo hàm được áp dụng để phân tích đồng thời hai chất này [9],[17] Tuy nhiên, do IMI dễ bị phân hủy thành thienamycin [16] có cấu trúc gần giống IMI (hình 1.1) nên việc sử dụng phương pháp quang phổ đạo cần cân nhắc tới khả năng bị phân hủy của IMI

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Thienamycin

Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay được sử dụng để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm do có thể tách riêng được tạp chất IMI và CIL là những hợp chất phân cực có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại (UV) nên phương pháp hay được sử là sắc kí tạo cặp ion (IPC) và HILIC kết nối với detector tử ngoại Trong đó, IPC được sử dụng phổ biến hơn và được quy định trong một số dược điển [2],[13],[20] Chất tạo cặp ion được sử dụng ở đây là natri hexansulfonat do nó có khả năng tạo cặp với các nhóm chức amin của IMI và CIL Sản phẩm tạo thành sau khi tạo cặp ion có

độ phân cực kém hơn so với IMI và CIL, do đó chúng được lưu giữ tốt hơn trên pha tĩnh kém phân cực Việc sử dụng kĩ thuật sắc kí tạo cặp ion có ưu điểm là sử dụng các loại cột pha đảo thông dụng hiện nay Tuy nhiên, nó có nhược điểm là chất tạo cặp ion lưu giữ rất tốt trong cột, do vậy thường không thể sử dụng cột để phân tích pha đảo HILIC là kĩ thuật mới hơn có khả năng phân tích trực tiếp IMI và CIL do có khả năng lưu giữ tốt các chất phân cực Bảng 1.2 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về phân tích đồng thời IMI và CIL bằng sắc kí lỏng

4

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng

pháp

Hỗn hợp ACN : amoni format (45 mM, pH 5,5) = 68:32 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút

254 nm 3,5 phút 4,8 phút

5

Trên thế giới hiện nay mới có một số ít nghiên cứu sử dựng HILIC để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm Nghiên cứu của N Nakov [16] sử dụng pha động gồm hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm amoni format 45 mM, pH 5,5 để phân tích IMI và CIL trong chế phẩm cho kết quả về thời gian lưu của các chất ngắn (dưới 5 phút) Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là hệ số kéo đuôi của cilastatin lớn (AS(CIL)= 1,6), hệ số chắn của đường chuẩn cao (Y-intercept của CIL và IMI lần lượt là -2,6% và -8,8%) Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC được công bố Vì vậy, tôi tiến hành đề tài với mục đích xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC và cải thiện được các hạn chế của nghiên cứu trên

1.2 Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước

HILIC là kĩ thuật sắc kí lỏng sử dụng pha tĩnh phân cực giống sắc kí lỏng pha thuận (NPLC) và pha động phân cực giống sắc kí lỏng pha đảo (RPLC) [7] So với RPLC, HILIC có khả năng lưu giữ tốt hơn các chất phân cực So với NPLC, HILIC sử dụng dung môi pha động ít độc hại hơn và tăng khả năng hòa tan các chất phân cực Đối tượng phân tích của HILIC thường là các hợp chất phân cực, như các acid amin [6], peptid [14], kháng sinh [21], carbohydrat [10]…

1.2.1 Pha tĩnh

Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica và dẫn xuất của nó Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC [7] Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số lượng cột polyme trên thị trường cũng như các nghiên cứu về HILIC trên cột polyme là không nhiều

Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia thành 2 loại là silica không dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa

- Silica không dẫn xuất:

Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động

có pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết So với RPLC, các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần khi tách các hợp chất phân cực [8] Nhược điểm của nó là có thể xảy ra hiện tượng quá tải cột

6

- Silica dẫn xuất hóa: Theo trạng thái tích điện, pha tĩnh silica dẫn xuất hóa được chia thành các nhóm sau:

+ Trung tính: amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin…

+ Lưỡng cực: sulfoalkyl betain…

+ Tích điện dương: amino propyl, silica bao latex…

+Tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic, poly hydroxyethyl A, poly sulfoethyl A

Pha tĩnh silica không dẫn xuất được sử dụng phổ biến hơn loại dẫn xuất hóa do rẻ hơn và khả năng lưu giữ tốt với nhiều chất

1.2.2 Pha động

HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril (ACN) cùng với một lượng nhỏ nước [7] Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ bay hơi thường được sử dụng Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3%

đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18] Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi không proton đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng làm pha động cho HILIC (ví dụ như dioxan hoặc tetrahydrofuran) Alcol cũng có thể được sử dụng, tuy nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích

so với các dung môi khác [11]

Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải:

Aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl formamid ~ methanol < nước [7]

Thông thường, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của chất phân tích

Đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động và lực ion Trong HILIC, chúng làm thay đổi sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích Đối với chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất [7] Đối với các chất phân tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động Nếu trong

cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion, nồng độ đệm tăng sẽ

7

làm giảm thời gian lưu Trong trường hợp tương tác ion không ảnh hưởng đến việc lưu giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém) Nồng độ đệm thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19] Các loại đệm hay được sử dụng là đệm acetat và đệm format do có khả năng bay hơi, thuận lợi trong việc kết nối với detector khối phổ Đệm phosphat ở nồng độ thấp cũng có thể được sử dụng trong trường hợp phân tích không sử dụng detector khối phổ Đệm phosphat có ưu điểm là có khoảng

pH đệm rộng do dó phân tách tốt nhiều chất, tuy nhiên lại dễ bị tủa trong ACN tỷ lệ cao Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như natri perclorat 100-300 mM) có thể được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong muốn Tuy nhiên do các muối này không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để

sử dụng trong sắc kí lỏng kết nối với khối phổ [7]

HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ

1.2.3 Cơ chế tách

Về cơ bản, có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách trong HILIC: thứ nhất là sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt của pha tĩnh; thứ ba pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, tiếp theo các chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [7] Hiện nay, cách mô phỏng thứ ba được thừa nhận rộng rãi Hình 1.2 minh họa cơ chế tách này:

Hình 1.2 Cơ chế tách trong HILIC

8

Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề mặt pha tĩnh Chất phân tích khi đi qua cột sắc kí sẽ được phân bố giữa pha động và lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này Như vậy, chất phân tích càng phân cực, nó sẽ được lưu giữ lâu hơn trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh Nói cách khác, quá trình phân tách phụ thuộc vào độ phân cực của chất phân tích và lớp solvat hoá trên bề mặt pha tĩnh Khi nồng độ ACN (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực Khi nồng độ của nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, và lượng nước hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi [7] Nói chung, thông thường khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động, hay nói cách khác là giảm độ phân cực của pha động thì thời gian lưu của chất phân tích trong HILIC cũng sẽ tăng theo [8] Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể có thêm các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh

1.2.4 Ưu điểm

HILIC có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sắc kí khác khi phân tích các chất phân cực Trong RPLC, do sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh kém phân cực nên các chất phân tích phân cực mạnh sẽ không được lưu giữ hoặc lưu giữ kém Trái lại, trong HILIC chất phân tích được phân bố ở cả lớp dung môi thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng lưu giữ các chất phân tích phân cực NPLC hoặc IPC hay được sử dụng trong việc phân tích các hợp chất phân cực Tuy nhiên, do NPLC sử dụng dung môi pha động độc hại và khả năng hòa tan chất phân tích phân cực [8] kém nên nó không phải là phương pháp tối ưu cho việc phân tích các chất phân cực Khác với NPLC, HILIC sử dụng các dung môi thân thiện hơn (như ACN, nước… ), và hòa tan tốt chất phân tích phân cực IPC có nhược điểm lớn là cột sau khi đã sử dụng bằng phương pháp này thường không thể sử dụng cho mục đích khác, tốn nhiều thời gian để ổn định hệ thống và rửa cột do chất tạo cặp ion

bị lưu giữ mạnh hoặc tạo liên kết với pha tĩnh Chính vì những lí do trên mà HILIC có

ưu diểm vượt trội khi phân tích các hợp chất phân cực

9

HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao có độ nhớt thấp nên có thể tiến hành được ở áp suất thấp hơn Độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian phân tích [7]

Với các chất phân cực hấp thụ UV kém như các acid amin, HILIC có thể định lượng trực tiếp các chất tại bước sóng thấp do sử dụng dung môi có bước sóng tới hạn thấp [6] Khi phân tích các hợp chất này bằng RPLC cần phải dẫn xuất hóa, vì vậy gây khó khăn cho việc định tính và định lượng chất Trong khi đó, pha động HILIC (thường sử dụng ACN có bước sóng tới hạn là 190 nm [1]) cho phép lưu giữ ở thời gian lưu thích hợp, xác định trực tiếp nhiều chất tại bước sóng thấp cỡ 200 nm, giảm bớt công đoạn tạo dẫn xuất trong định tính, định lượng chất

HILIC có khả năng kết nối với detector khối phổ [22] nhờ pha động có chứa lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, dễ hóa hơi, thích hợp với LC-MS Đối với RPLC, khi phân tích các hợp chất phân cực thường sử dụng pha động chứa tỷ lệ nước cao, khó hóa hơi nên không phù hợp với LC-MS Ngược lại, pha động không phân cực của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất phân cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [8] khi phân tích bằng LC-MS

1.2.5 Nhược điểm

Bên cạnh các ưu điểm đã trình bày ở trên, HILIC cũng có một số nhược điểm như:

- Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC

- Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion

- Tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC và NPLC

- Phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế

10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam của Merck Sharp & Dohme Corp Mỗi lọ chứa một lượng bột tương đương với 500 mg imipenem và 500

mg cilastatin Ngoài ra, chế phẩm còn chứa natri bicarbonat vô khuẩn là tá dược không

- Chuẩn imipenem: Hàm lượng 93,74% của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

- Chuẩn cilastatin natri: Hàm lượng 95,54% Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

- Tá dược natri bicarbonat: Nhà sản xuất CTCP DPDL PHARMEDIC – Việt Nam

- Acetonitril dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Methanol dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau – Tây Ban Nha

- Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Acid acetic băng dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Acid formic dùng cho MS: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Natri hydroxyd: Sản xuất bởi Merck – Đức

- Nước cất hai lần

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm chemstation

- Cột sắc kí: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Sigma Aldrich) và cột Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent)

- Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan)

- Máy lọc hút chân không Rocker 400

11

- Máy đo pH Mettler Tolero

- Pipet chính xác 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, 4,00 ml, 5,00ml, micro pipet

- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước vào bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa

đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40

- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat vào bình định mức 100,0 ml Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch natri bicarbonat 120 ppm Hút 0,50 ml dung dịch này vào bình định mức 10,00 ml,

bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách pha mẫu của DĐVN V [2])

- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI và 22,2 mg CIL natri vào hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI và CIL nồng độ 2000 ppm

Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 ppm vào bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất Từ dung dịch này, dùng pipet chính xác và bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm,

200 ppm, 150 ppm, 100 ppm và 75 ppm

- Dung dịch mẫu thử:

+ Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g) Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh khô và sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp Cân khối lượng vỏ được m2 (g) Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với

500 mg IMI và 500 mg CIL

+ Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam vào bình định mức 10,00 ml, hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có

12

nồng độ khoảng 500 ppm của IMI và CIL Hút 1,50 ml dung dịch thử trên vào bình định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm

- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 oC

2.2.4 Chuẩn bị dung môi pha động

- Dung dịch acid phosphoric 0,5% và 0,1 %: Hút 750 µl H3PO4 đặc pha vào 250 ml nước, khuấy đều, thu được dung dịch H3PO4 0,5% Pha loãng 50 ml dung dịch này bằng nước để được 250 ml dung dịch H3PO4 0,1%

- Dung dịch đệm phosphat 5 mM (pH 6,80): Cân chính xác khoảng 170,0 mg KH2PO4

vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước, thêm nước đến khoảng 200 ml, khuấy đều Chỉnh đến pH 6,80 bằng dung dịch NaOH 0,5 M Chuyển vào bình định mức 250,0 ml, thêm nước vừa đủ, lắc đều

- Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 vào cốc

có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần Rót vào bình định mức 500,0 ml, thêm nước vừa đủ Lắc đều Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H3PO4 20 mM (210 µl

H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức)

- Dung dịch HCOOH 0,05%; 0,1% và 0,2%: Hút 410 µl HCOOH pha trong 250 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,2% Pha loãng 100 ml dung dịch HCOOH 0,2% bằng nước để được 200 ml dung dịch HCOOH 0,1% Hút 100 µl HCOOH pha trong 250 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,05%

- Dung dịch CH3COOH 1% và 0,1%: Hút 2 ml CH3COOH băng pha trong 200 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch CH3COOH 1% Hút 240 µl CH3COOH băng pha trong nước vừa đủ 250 ml, khuấy đều

- Dung dịch đệm acetat 10 mM (pH 4,75): Hút 140 µl CH3COOH băng pha trong 200

ml nước, điều chỉnh đến pH 4,75 bằng dung dịch NaOH 0,5 M, thêm nước vừa đủ 250

ml

Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trước khi sử dụng

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong thuốc tiêm bằng HILIC

Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí sau:

+ Pha tĩnh

+ Pha động: thành phần, tỷ lệ, nồng độ, pH, tốc độ dòng

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên nghiên cứu của N Nakov [16] về phân tích IMI và CIL bằng HILIC trong chế phẩm thuốc tiêm, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, tôi tiến hành khảo sát các điều kiện chạy sắc kí như sau:

2.3.1.1 Khảo sát pha tĩnh

Cột silica có thể sử dụng làm pha tĩnh HILIC, loại cột này có giá thành rẻ, sẵn có,

vì vậy, tôi lựa chọn cột hai cột silica có độ dài khác nhau, cùng kích thước hạt nhồi cột

15

2.3.1.3 Khảo sát dung môi pha mẫu

Pha mẫu trong hỗn hợp dung môi ACN và nước như trong nghiên cứu N Nakov [16] nhưng với các tỷ lệ khác nhau gồm 75:25 và 60:40 (v/v) Tiến hành chạy sắc ký,

dựa vào hình dáng của pic sắc ký và chi phí để lựa chọn dung môi pha mẫu thích hợp

2.3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm

Tiến hành chạy sắc kí ở hai thể tích tiêm mẫu là 10 µl và 5 µl, dựa vào hình dạng pic và độ cân xứng của pic để lựa chọn thể tích tiêm mẫu thích hợp

2.3.1.5 Khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ trên pic sắc kí của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ

190 nm đến 400 nm Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất

- Tiến hành: Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 150 ppm Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của

các lần sắc ký

- Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0%[2]

2.3.2.2 Độ chọn lọc

- Chuẩn bị các mẫu sau:

+ Mẫu dung môi pha mẫu: Chuẩn bị như mục 2.2.3

16

+ Mẫu placebo tự tạo: Pha dung dịch natri bicarbonat 6 ppm như mục 2.2.3

+ Mẫu chuẩn đơn thành phần IMI, CIL 150 ppm: Hút 1,50 ml chuẩn đơn gốc vào bình định mức 20,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ Lắc đều

+ Mẫu chuẩn hỗn hợp gồm hai thành phần IMI và CIL nồng độ 150 ppm của mỗi chất: Hút 3,00 ml chuẩn hỗn hợp gốc vào bình 5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ Lắc đều + Mẫu thử nồng độ 150 ppm của mỗi chất: Hút 1,50 ml dung dịch mẫu thử vào bình 5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ Lắc đều

- Tiến hành: Chạy sắc ký các mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được

- Yêu cầu:

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu trắng và dung dịch placebo không được xuất hiện pic tại vị trí của hoạt chất chính Nếu có thì ảnh hưởng của mẫu placebo (AH%) ≤ 1% + Trên sắc kí đồ của dung dịch thử có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống

kê với thời gian lưu của chất chuẩn trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn Pic của chất cần phân tích phải tinh khiết (Độ tinh khiết của pic sắc kí > 0,995) Chồng phổ của chất phân tích với chất chuẩn cho hệ số Match ≥ 0,999 Nếu xuất hiện pic tạp chất, thì phải tách khỏi pic chất thử với độ phân giải Rs > 1,5

2.3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ IMI và CIL khoảng từ 75 ppm đến 250 ppm từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500 ppm Bảng 2.2 mô tả quy trình pha các mẫu dường chuẩn:

Bảng 2.2 Quy trình pha các mẫu đường chuẩn

17

- Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,995 và hệ số chắn tại nồng độ 100%: -2,0% ≤ intercept ≤ 2,0 %

Y-2.3.2.4 Độ lặp lại

- Độ lặp lại trong ngày

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt Pha mẫu thử như mục 2.2.3

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của IMI và CIL phải không lớn hơn 2,0%

- Độ lặp lại khác ngày

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt Pha mẫu thử như mục 2.2.3

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày và 12 lần thử trong

2 ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của IMI và CIL phải không lớn hơn 2,0%

+ Thêm các lượng chuẩn ở mức 30%, 50%, 70% vào mẫu thử 50% được 9 dung dịch dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100%, 120% (tương ứng với các dung dịch có nồng

độ khoảng 120 ppm, 150 ppm và 180 ppm) Bảng 2.3 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên:

V chuẩn 3 (ml)

Bình định mức (ml)

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 98% - 102% , RSD ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ

Công thức tính tỷ lệ thu hồi:

Tỷ lệ thu hồi (%) = lượng chất chuẩn thu hồi

lượng chất chuẩn thêm vào x 100%

2.3.2.6 Độ thô

Độ thô đánh giá độ ổn định của phương pháp khi có sự thay đổi nhỏ về các thông

số của phương pháp Trong nghiên cứu này, tôi khảo sát sự thay đổi của tỷ lệ dung môi pha động, nồng độ đệm và pH Dùng phần mềm Modde để xây dựng quy trình thẩm định độ thô Kết quả được đánh giá dựa vào giá trị RSD (%) của hai thông số là thời gian lưu và diện tích pic của IMI và CIL