Xây dựng phương pháp phân tích một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng điện di mao quản

Tách và xác định đồng thời kháng sinh cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản trong mẫu dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới.. Xây dựng được phương pháp định lượng một số kháng

ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn hóa phân tích, trường Đại học Dược Hà Nội với sự chỉ bảo tận tình của ThS.Nguyễn Thị Thùy Linh cùng các thầy

cô trong bộ môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới người cô, người đã tận tình hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và toàn thể cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên

và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Lê Thị Huệ

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh cephalosporin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại, phổ tác dụng 2

1.1.2.Công thức, tính chất của các cephalosporin và amoxicillin 5

1.1.3 Các phương pháp phân tích định lượng cephalosporin 7

1.2 Tổng quan về điện di mao quản 11

1.2.1 Khái niệm 11

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 12

1.2.3 Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu 13

1.2.4 Phân loại 14

1.3 Tổng quan về phương pháp chuẩn nội 16

1.3.1 Khái niệm 16

1.3.2 Yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội 16

1.3.3 Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.1.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu .19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch thử và các dung dịch làm việc.20 2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 21

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.3.4 Ứng dụng 23

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 25

3.1.1 Khảo sát dung dịch điện ly nền 25

3.1.2 Khảo sát bước sóng phát hiện 25

3.1.3 Mao quản và xử lý mao quản 26

3.1.4 Khảo sát pH dung dung dịch điện ly nền 27

3.1.5 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền 29

3.1.6 Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản 30

3.1.7 Khảo sát thời gian bơm mẫu 31

3.1.8 Tổng kết điều kiện tối ưu 33

3.1.9 Định tính các kháng sinh trên điện di đồ 33

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 35

3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 35

3.2.2 Độ đặc hiệu 37

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 39

3.2.4 Độ lặp lại 42

3.2.5 Độ đúng 44

3.3 Ứng dụng định lƣợng trong chế phẩm 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

HPLC-RP Sắc ký pha đảo

(Reversed-phase high-performance liquid chromatographic)

CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)

CZE Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis) EOF Dòng điện thẩm (electroosmotic flow)

UV-VIS Bước sóng tử ngoại –khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên

bảng

Nội dung Trang

1 1.1 Công thức, tính chất, chỉ định của CPN, CFR, CFM, AMOX 5

2 1.2 Một số nghiên cứu định lượng cephalosporin bằng HPLC 7

3 2.1 Thông tin và đặc điểm từng loại chế phẩm phân tích 18

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên

hình

Nội dung Trang

1 1.1 Công thức chung của các kháng sinh cephalosporin 2

2 1.2 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 11

3 3.1 Điện di đồ khi sử dụng dung dịch đệm photphat hoặc borat 25

5 3.3 Điện di đồ của các kháng sinh ở pH khác nhau 28

6 3.4 Điện di đồ tại nồng độ borat 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 30

7 3.5 Điện di đồ ở điện thế 10kV, 15kV, 20kV, 25kV 31

9 3.7 Điện di đồ của các kháng sinh cephalosporin ở điều kiện tối

12 3.10 Điện di đồ các kháng sinh chứng minh độ đặc hiệu 38

Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và định lượng đồng thời các kháng sinh cephalosporin trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm

và môi trường, phần lớn làm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là kỹ thuật tách chọn lọc, độ lặp lại tốt Tuy nhiên kỹ thuật phải sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giá thành phân tích cao Hiện nay, điện di mao quản là một kỹ thuật đang được phát triển với một số ưu điểm như: hiệu lực tách tốt, dung môi, hóa chất ít, an toàn, tiết kiệm chi phí

Kỹ thuật điện di mao quản (CE) đã được đưa vào phương pháp chung của DĐVN IV[3], nhưng các chuyên luận sử dụng CE chưa có nhiều Tách và xác định đồng thời kháng sinh cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản trong mẫu dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài

là “ Xây dựng phương pháp phân tích một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng

điện di mao quản” Với hai mục tiêu:

1 Xây dựng được phương pháp định lượng một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng điện di mao quản

2 Ứng dụng phương pháp này để định lượng một số kháng sinh nhóm cephalosporin trong chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh cephalosporin

1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại, phổ tác dụng

a) Công thức chung của cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc R[1]

Hình 1.1 Công thức chung của các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R)

- Cephalosporin thế hệ 1 (cephalexin, cefadroxil, cefazolin ): Có hoạt tính mạnh trên các chủng vi khuẩn Gram-dương nhưng hoạt tính tương đối yếu trên các chủng

vi khuẩn Gram-âm Phần lớn cầu khuẩn Gram-dương nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 1 (trừ enterococci, S epidermidis và S aureus kháng methicilin) Hầu hết các vi khuẩn kỵ khí trong khoang miệng nhạy cảm, nhưng với B fragilis thuốc không có hiệu quả Hoạt tính tốt trên các chủng Moraxella catarrhalis, E.coli, K pneumoniae, và P mirabilis

- Cephalosporin thế hệ 2 (cefaclor, cefuroxim ): Các cephalosporin thế hệ 2 có hoạt tính mạnh hơn trên vi khuẩn Gram-âm so với thế hệ 1 (nhưng yếu hơn nhiều so với thế hệ 3) Một số thuốc như cefoxitin, cefotetan cũng có hoạt tính trên B Fragilis

- Cephalosporin thế hệ 3 (cefotaxim, cefdinir, cefixim ): Cephalosporin thế hệ 3 nói chung có hoạt tính chống cầu khuẩn Gram dương y ếu hơn thế hệ 1, nhưng có tác dụng tốt hơn nhiều đ ối với họ Enterobacteriaceae kể cả các chủng tiết beta - lactamase Một số các thuốc như ceftazidim, cefoperazon cũng có tác dụng chống Pseudomonas aeruginosa, nhưng ít có tác dụng chống cầu khuẩn Gram dương hơn các thuốc thế hê ̣ 3 khác

- Cephalosporin thế hệ 4 (Cefepim, cefpirom): Cephalosporin thế hệ 4, có phổ kháng khuẩn rô ̣ng so với thuốc thế hê ̣ 3 và có đô ̣ bền vững cao đối với sự thủy phân bởi các beta - lactamase qua trung gian thể nhiễm sắc và plasmid Kháng sinh thế hệ

4 được dùng để điều trị đặc hiệu nhiễm trực khuẩn Gram âm ưa khí đã kháng với cephalosporin thế hệ 3

Đối tượng mà đề tài nghiên cứu là các cephalosporin sau: cephalexin, cefdinir, cefixim Các cephalosporin này hiện đang được sử dụng nhiều trong điều trị và các công ty dược trong nước sản xuất rất nhiều Để tăng độ lặp lại của phương pháp điện di chúng tôi lựa chọn phương pháp chuẩn nội Vì vậy cần lựa chọn chất chuẩn nội cho phù hợp

1.1.2 Công thức, tính chất của các cephalosporin và amoxicillin

Bảng 1.1 Công thức, tính chất, chỉ định của CPN, CFR, CFM, AMOX

Công thức cấu tạo Tính chất Chỉ định

-Khó tan trong nước và trong ethanol 96%

-Tan trong các dung dịch acid loãng và dung dịch hydroxyd kiềm loãng

-Ít tan trong nước -Tan trong dung dịch kiềm loãng

Thực tế không tan trong ethanol 96%,ether

Cefalexin được chỉ định để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng da và

mô mềm, viêm tai giữa và nhiễm trùng khác

Nhận thấy amoxicillin có cấu trúc hóa học tương tự các chất nghiên cứu nên

- Nó ít hòa tan trong axit clohydric loãng

và ít hòa tan trong đệm phosphate 0,1M

pH 7,0

Điều trị nhiễm khuẩn mức độ nhẹ đến vừa do các chủng vi khuẩn nhạy cảm trong các trường hợp :Viêm phổi mắc tại cộng đồng, đợt cấp của viêm phế quản mãn, nhiễm khuẩn da không biến chứng

-Ít tan trong nước, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong ethyl acetat

Điều trị các bệnh nhiễm trùng cấp tính sau khi gây

ra bởi vi sinh vật: -Nhiễm trùng đường hô hấp -Nhiễm trùng đường tiết niệu : ví dụ như viêm bàng quang

1.1.3 Các phương pháp phân tích định lượng cephalosporin

Các nghiên cứu trên thế giới

a) Định lượng cephalosporin bằng phương pháp HPLC

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh cephalosporin trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng cephalosporin bằng HPLC

Tên tác giả Chất phân

tích

Chương trình sắc ký (cột-pha động-tốc

độ dòng-bước sóng phát hiện)

Thời gian lưu

Srinivasa Rao

Narala và

K.Saraswa[21]

Cefditoren Pivoxil trong chế phẩm

Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm)-methanol : đệm kali dihydrogen photphat (75:25 v/v)-1ml/phút-231nm

2,75 phút

Cefdinir trong chế phẩm

Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5μm)-acetonitril : đệm kali dihydrogen photphat (70:30 v/v) - 1ml/phút - 285nm

Cột C18 (150 mm × 4,6 mm, 5μm)-đệm photphat 50mM (pH=5) : methanol (80:20 v/v)-1ml/phút-230nm

Tách trong vòng 7 phút

b) Phương pháp quang học

Rageh A.H và cộng sự đã đề xuất phương pháp quang phổ để xác định cefaclor monohydrat, cefadroxil monohydrat, cephalexin khan, cefradin khan, cefotaxime sodium, cefoperazone sodium, ceftriaxone sodium, ceftazidime penthydrate, natri cefazolin, cefixime và cefpodoximeproxetil trong công thức dược phẩm Phương pháp này dựa trên sự thủy phân của các loại thuốc được nghiên cứu trong NaOH 0,5M ở 100oC để tạo ra các ion sulfid và phản ứng tiếp theo của các ion sulfide hình thành với NBD-Cl (4-chloro-7-nitrobenzo-2-OXA-1, 3-diazole) để tạo thành sản phẩm màu vàng đo ở 390 nm [20]

Chavala A.K và cộng sự mô tả một phương pháp để xác định ceftazidim

và cefepim dựa trên phản ứng ngưng tụ của chúng với sulphonate (NQS) trong môi trường có tính kiềm để tạo thành sản phẩm có màu cam Kết quả cho thấy Ceftazidim và cefepim có độ hấp thụ tối đa ở 495 nm và

1-naphthoquinolone-4-475 nm và tuyến tính trong khoảng nồng độ tương ứng là 20-80 và 20-140 µg/mL Phương pháp đề xuất được áp dụng cho việc định lượng ceftazidim và cefepim trong các chế phẩm tiêm thương mại [14]

Elbashir và cộng sự đề xuất phương pháp quang phổ huỳnh quang cho việc phân tích cephalosporin trong công thức dược phẩm Phương pháp được dựa trên một phản ứng giữa các cephalosporin với 1-naphthoquinolone-4-sulphonate (NQS) trong môi trường kiềm, để tạo ra các dẫn chất có phát huỳnh quang chiết với chloroform và sau đó đo bằng máy quang phổ huỳnh quang Định luật Beer đúng trong khoảng nồng độ 10-60; 5-35 và 10-60 ng/mL tương ứng cho cefixim, cephalexin, và natri cefotaxim [15, 16, 17]

c) Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh cephalosporin trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Attila Gaspar và cộng sự đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH= 6,8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 µg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng

độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng [11]

A R Solangi, S Q Memon, M Y Khuhawar, and M I Bhanger đã xây dựng phương pháp để tách và định lượng hỗn hợp tám kháng sinh nhóm cephalosporins gồm: cefadroxil (CFL), cefixim (CIX), cefuroxim natri (CFR), ceftriaxon sodium (CTR), ceftizoxim (CFT), cefaclor (CFC), cefradin (CFD), và cefotoxim (CTA) Phương pháp này tách được các chất trong vòng chưa đầy 11 phút Quá trình tách dùng đệm natri tetraborat 50mM, pH=9, điện thế là 30 kV Giới hạn phát hiện nằm trong phạm vi 0,5-5 µg/mL Phát hiện là do hấp thụ UV 214 nm Phương pháp này được áp dụng để phân tích các cephalosporin trong dược phẩm

và trong nước tiểu, độ lệch chuẩn tương đối ( n = 4) là RSD trong khoảng 1,9%[12]

0,3-Mrestani Y, Neubert R, Hartl A, Wohlrab J đã xác định các kháng sinh cephalosporin (cephalexin, cefadroxil, cefaclor, Ceftazidim, cefsulodin, Cefotaxim,

cefamandol, Cefuroxim, cefodizim) trong nước tiểu và trong mật Việc xác định các cephalosporin đã được thực hiện như là một phương pháp trực tiếp Các mẫu chỉ được pha loãng trong đệm và được tiêm vào thiết bị mà không cần bất kỳ sự chuẩn

bị mẫu nào khác Việc xác định và tách các cephalosporin trong cả hai môi trường dùng đệm citrat 50mM, pH=6, điện thế 30kV Khoảng nồng độ tuyến tính nằm trong khoảng từ 10-500 µg / ml [19]

Yong–MinLi và cộng sự đã tiến hành phân tích kháng sinh cephalexin bằng phương pháp sắc ký điện động mixen (MEKC) Phương pháp đã tách biệt hoàn toàn cefadroxil từ mười chất có liên quan được biết trong vòng 15 phút (bao gồm cả quá trình rửa) Việc tách được thực hiện trong hệ đệm acetate (50 mM; pH 5,25) có chứa sodium dodecyl sulfate (SDS 110 mM) Mao quản silica dài 44 cm (chiều dài hiệu dụng 36 cm), điện áp 18 kV; nhiệt độ 15oC; và bước sóng phát hiện là 254 nm [22]

Nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích các kháng sinh nhóm cephalosporin Nguyễn Văn Yên và Nguyễn Thị Thanh Phương đã tách và xác định thành công hỗn hợp 5 kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin sử dụng nhiều ở Việt Nam: cephalexin, cephadroxil, cefixim, cefaclor, cefotaxim Qúa trình tách sử dụng đệm Na2HPO4 10mM:MeOH (8:2), điện thế 25 kV và bước sóng phát hiện là 283 nm[10]

Nhìn chung phương pháp quang học là đơn giản, dễ tiến hành nhưng thường

phải tạo phản ứng để tạo thành sản phẩm có màu Với phương pháp HPLC kết quả

tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn, tốn dung môi Khả năng phân giải của CE giúp cho việc tách các cephalosporin tương đối nhanh và đơn giản Phương pháp điện di mao quản (CE) ngày càng được

sử dụng nhiều do đặc điểm thuận lợi của nó (hiệu quả tách cao, tính linh hoạt lớn, phương pháp phát triển nhanh chóng và sử dụng ít mẫu và thuốc thử) Trong khóa

luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp để định lượng đồng thời cephalexin, cefixim, cefdinir bằng phương pháp điện di mao quản

1.2 Tổng quan về điện di mao quản

1.2.1 Khái niệm

Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua Cation di chuyển về phía cực âm (cathod), anion di chuyển về phía cực dương (anod) Các phần tử không tích điện không bị hút về phía hai điện cực

Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện

áp cao thế (10 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản

Hình 1.2 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận sau:

 Mao quản tách: thường làm bằng vật liệu silic (gọi là mao quản silica, là loại mao quản phổ biến nhất), teflon, PEEK, với đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường kính trong (ID) từ 10 đến 150 μm (phổ biến nhất là 50 μm) Tổng chiều dài mao

tính từ đầu bơm mẫu của mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ 25 –

50 cm đối với mao quản dài 60 cm Trong quá trình điện di, mao quản được nạp đầy dung dịch đệm điện di

 Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di Lưu ý: Hai lọ đựng dung dịch đệm tại hai đầu mao quản phải ở độ cao ngang bằng nhau

 Nguồn điện thế cao: thường dao động từ 10 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra

 Detector (cảm biến): bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình phân tách điện di mao quản, do đó thường được đặt ở phần cuối (gần cuối hoặc cuối) của mao quản tuỳ theo loại cảm biến Các loại cảm biến thông dụng trong phương pháp CE bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế và đo độ dẫn

 Bộ phận tiêm mẫu tự động

 Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp,

để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích Hiện nay, bộ phận này còn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản

 Bộ phận điều nhiệt cho mao quản

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản

Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản mà mặt trong thành mao quản không có lớp bao và mao quản chứa dung dịch đệm làm việc, thì nhóm silanol hiện diện trên thành phía trong của mao quản thủy tinh sẽ giải phóng ion hydrogen vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện âm ngay cả ở

pH rất thấp Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp điện tích kép

Quá trình điện di bắt đầu bằng cách đặt thế trên chiều dài cột mao quản làm cho phần dung dịch của lớp điện tích kép di chuyển về phía đầu cathod của mao quản kéo theo khối dung dịch Sự chuyển động của khối dung dịch dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (electroosmotic flow - EOF) Mức

độ ion hóa của nhóm silanol trên thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của dung dịch đệm làm việc và các chất điều chỉnh được thêm vào chất điện giải Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ Ở pH cao hơn, nhóm silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng

Ngoài pH của dung dịch đệm dòng EOF sẽ thay đổi khi :

 Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế zeta nên dòng EOF giảm

 Trong một số trường hợp, các dung môi hữu cơ như methanol hay acetonitril được cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan của các chất hòa tan và các chất phụ gia hay để ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của mẫu Nói chung, việc thêm các chất điều chỉnh hữu cơ sẽ làm giảm dòng EOF

Detector được đặt về phía đầu cathod của mao quản Dòng EOF thường lớn hơn linh độ điện di Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía cathod và detector Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và các anion

1.2.3 Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu

Cách đưa mẫu vào trong mao quản bao gồm tiêm kiểu di chuyển điện (kiểu điện động), và tiêm áp suất âm và tiêm áp suất dương (kiểu thủy tĩnh)

Để tiêm kiểu di chuyển điện, dung dịch mẫu được đưa vào mao quản bằng cách nhúng mao quản và điện cực vào trong lọ mẫu và đặt lên đó một điện thế cao trong thời gian ngắn Mẫu đi vào mao quản bằng sự phối hợp của điện di và dòng EOF Bởi vậy, các chất phân tích có linh độ khác nhau đi vào trong mao quản

ở mức độ khác nhau Độ dẫn của mẫu thử và chất chuẩn cũng ảnh hưởng đến dòng EOF và thể tích tiêm

Tiêm áp suất âm là đặt áp suất âm ở đầu mao quản có detector và hút dung dịch mẫu vào đầu tiêm của mao quản Tiêm áp suất dương là tạo áp suất lên lọ chứa mẫu, đẩy mẫu vào trong mao quản Tiêm áp suất có thể đưa tất cả các thành phần của mẫu vào trong mao quản ở cùng một mức độ, nói chung là cho độ tái lặp tốt nhất và là cách tiêm thường được áp dụng nhất Thể tích mẫu phụ thuộc vào chiều dài và đường kính trong của mao quản và điện thế hay áp suất áp đặt Thể tích mẫu đặc trưng được tiêm vào trong mao quản khoảng từ 1 -20 nL

Mỗi một phương pháp tiêm mẫu có những ưu và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào thành phần của mẫu, kiểu tách và áp dụng phương pháp Không có kiểu tiêm mẫu nào nói trên có độ tái lặp như bộ tiêm mẫu của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đang có mặt trên thị trường Tùy theo hoàn cảnh cụ thể, cần thiết phải sử dụng chất chuẩn nội cho các phương pháp cụ thể khi cần sự tiêm mẫu chính xác

1.2.4 Phân loại

Hiện nay, có 5 loại chủ yếu của điện di mao quản:

 Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do

 Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar electrokinetic chromatography - MEKC)

 Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE)

 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)

 Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP)

Nguyên lý của điện di mao quản vùng

Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của phương pháp Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần của đệm, pH và lực ion

Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách các tiểu phân tích điện Linh độ điện di của ion (uEP), được biễu diễn bằng phương trình:

uEP=q/(6𝝅ηr)

Trong đó q là điện tích của ion, η là độ nhớt dung dịch và r là bán kính của ion hydrat hóa Từ mối liên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn

có linh độ lớn Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp

Tốc độ di chuyển (vEP), tính bằng cm/s, được biểu thị bằng phương trình:

VEP=uEP(V/L) Trong đó uEP là linh độ điện di, V là điện thế đặt và L là chiều dài (cm) tổng cộng của mao quản

Tốc độ của EOF (vEO), tính bằng cm/s, được biễu diễn bằng phươ ng trình:

VEO=uEO(V/L) Thời gian (t), tính bằng giây, cần thiết cho chất tan di chuyển trên toàn bộ chiều dài hiệu dụng (l) của mao quản (từ đầu vào đến detector), t được biểu thị bằng hệ thức sau:

t = l / E( uEP + uEO ) = lL /V( uEP +uEO )

Trong đó E là cường độ điện trường và các ký hiệu khác được định nghĩa như ở trên

Hiệu lực của hệ thống điện di có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF và được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:

N = ( uEP + uEO ) V/ 2D Trong đó D là hệ số khuếch tán của chất hòa tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên

Độ phân giải (R) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác định bằng phương trình:

R=0,18 ( uEP1- uEP2 )[V/D( ūEP + uEO )]1/2 Trong đó uEP1 và uEP2 độ của hai chất hòa tan, ūEP là linh độ trung bình của hai chất tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên

1.3 Tổng quan về phương pháp chuẩn nội

1.3.1 Khái niệm

Kỹ thuật chuẩn nội có thể được tóm tắt như sau: Người ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành

chạy trong cùng điều kiện Chất được thêm này được gọi là chất chuẩn nội

Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác

1.3.2 Yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội

- Trong cùng điều kiện, chất chuẩn nội phải tách được hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ của chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

1.3.3 Phương pháp chuẩn nội nhiều điểm

Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lượng (hoặc nồng độ) chất chuẩn

khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chuẩn nội Sau khi

điện di và thu được các dữ kiện về diện tích, tiến hành vẽ đường chuẩn biểu diễn sự

tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất chuẩn trên chuẩn nội

(SC/SIS) với nồng độ chất chuẩn (CC)

Song song tiến hành điện di mẫu thử cũng được thêm chất chuẩn nội với

lượng (hoặc nồng độ) như thang chuẩn

Tính tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử trên diện tích (hoặc

chiều cao) pic chuẩn nội (ST/SIS) rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng độ của

chất thử

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Xác định hàm lượng kháng sinh trong chế phẩm là một mảng đề tài rất thực

tế và quan trọng Trong đề tài này đối tượng mà tôi chọn để phân tích là một số kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin: cephalexin, cefixim, cefdinir Đây là những kháng sinh được sử dụng phổ biến hiện nay

Bảng 2.1 Thông tin và đặc điểm từng loại chế phẩm phân tích

lượng ghi trên nhãn

Số lô Hạn dùng

Cefalexin

(cephalexin)

Viên nang cứng , đóng

vỉ, 10 viên/1

vỉ

Công ty XNK y tế Domesco

5 viên/1 vỉ

Chi nhánh công

ty CPDP TW Vidipha tại Bình Dương

vỉ , 10 viên/1 vỉ

Maxim Pharmaceuticals Pvt Ltd

VD-23688-15

17/6/2018

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị

a) Hóa chất, chất chuẩn

- Các chất chuẩn: amoxicillin (87,17% - QT 010110614) do viện kiểm nghiệm TP.Hồ Chí Minh cung cấp, cephalexin (93,16% - 0509016), cefixim (95% - 0314192.03), cefdinir (96,15% - WS 0114305.05) do viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp (amoxicillin được sử dụng làm chất chuẩn nội )

- Nước loại ion được lọc qua màng lọc 0,2 µm

- Natri hydroxyd, natri tetraborat, acid boric, methanol

- Placebo tự tạo: là các tá dược phổ biến hay sử dụng trong viên nén, viên nang Gồm các thành phần sau được trộn đồng nhất: tinh bột mỳ: 70mg; lactose: 45mg; avicel: 140mg; natri croscarmellose: 25mg; natri laurylsulfat: 5mg; PVP-K30: 8mg; aerosil: 3mg

- Một số dụng cụ thủy tinh thông dụng trong phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện tách các kháng sinh nhóm cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản

- Thẩm định phương pháp

- Ứng dụng: Định lượng một số kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin (cephalexin, cefixim, cefdinir) trong một số chế phẩm có mặt trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch thử và các dung dịch làm việc

- Dung dịch natri dihydrophotphat 10mM: cân chính xác 0,039g NaH2PO4 cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 25ml nước loại ion, lắc đều

- Dung dịch natri tetraborat 10mM; 20mM; 30mM; 40mM: cân chính xác lần lượt 0,0954g; 0,1907g; 0,2806g; 0,3814g natri tetraborat vào các cốc có mỏ, hòa tan trong 25ml nước loại ion, lắc đều

- Dung dịch đệm borat 10mM, pH 7,5: pha dung dịch đệm borat 10mM, điều chỉnh bằng acid boric tới pH 7,5

- Dung dịch NaOH 0,1N: cân khoảng 0,45 g NaOH cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 100ml nước loại ion, lắc đều

- Dung dịch chuẩn gốc :

 Amoxicillin 1000 µg/ml: cân chính xác một lượng amoxicillin chuẩn tương ứng cho vào bình định mức 10ml (± 0,025 ml) Thêm khoảng 0,5 ml methanol lắc nhẹ trong 2 phút và thêm khoảng 6ml nước loại ion Đem siêu

âm 15 phút, sau đó bổ sung nước loại ion tới vạch

 Cephalexin, cefdinir, cefixim 1000 µg/ml: chuẩn bị tương tự

Các dung dịch chuẩn phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch gốc đến nồng độ yêu cầu

- Dung dịch thử :

 Cephalexin 1000 µg/ml: cân chính xác một lượng chế phẩm cephalexin tương ứng cho vào bình định mức 10ml (± 0,025 ml) Thêm khoảng 0,5 ml

methanol lắc nhẹ trong 2 phút và thêm khoảng 6ml nước loại ion Đem siêu

âm 15 phút, sau đó bổ sung nước loại ion tới vạch Lắc đều, sau đó lọc qua giấy lọc

 Cefdinir, cefixim 1000 µg/ml: chuẩn bị tương tự

Các dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch gốc đến nồng độ yêu cầu

- Dung dịch placebo: cân chính xác khoảng 0,01g placebo cho vào bình định mức 10ml Thêm 0,5 ml methanol và nước loại ion Đem siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung nước loại ion tới vạch Đem pha loãng 10 lần

Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2µm trước khi chạy điện di

2.3.2 Khảo sát điều kiện điện di

- Khảo sát loại dung dịch điện ly nền

- Khảo sát bước sóng phát hiện

- Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền

- Khảo sát pH dung dịch điện ly nền

- Khảo sát hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản

- Khảo sát thời gian bơm mẫu

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát điều kiện điện di tối ưu tiến hành thẩm định để đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp Theo AOAC các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại

và độ đúng

 Tính đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu placebo, placebo+amoxicillin, mẫu thử, mẫu chuẩn, tiến hành chạy ở điều kiện đã chọn Yêu cầu trên điện di đồ pic của các kháng sinh phải tách hoàn toàn so với pic của tạp Trên điện di đồ của mẫu placebo, placebo+amoxicillin tại thời điểm ứng với pic của các kháng sinh không được có pic xuất hiện Thời gian

di chuyển và hình dáng của pic trên sắc ký đồ phải tương tự nhau

 Khảo sát khoảng tuyến tính

Để đảm bảo phương pháp định lượng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng nồng độ mà ở đó có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ chất phân tích

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan hồi quy Đường hồi quy

có dạng gần như đường thẳng và hệ số tương quan hồi quy xấp xỉ 1

 Độ lặp lại

Tiến hành xác định nồng độ của các kháng sinh trong 6 mẫu thử độc lập Đánh giá độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD< 2%

 Độ đúng

Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Độ đúng của phương pháp còn được biểu thị bằng tỷ lệ thu hồi (R%)

R%=Ct+m−Ct

Cm x 100% =

Cm x 100%

Trong đó: R%: Độ thu hồi, %

Cm: Nồng độ chất chuẩn thêm vào (lý thuyết)

Ct: Nồng độ chất thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm vào (thực tế)

Ct+m: Nồng độ sau khi thêm chất chuẩn (chất thử + chất chuẩn) Tiến hành: Thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng

độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Tính đến cả hàm lượng hoạt chất có sẵn trong nền mẫu chế phẩm thực, các mức thêm chuẩn được tính toán để tổng nồng độ hoạt chất trong mẫu thêm chuẩn ở ba mức đánh giá độ đúng vào khoảng 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng thường quy của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Mỗi nồng độ phân tích 3 lần, xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với lượng thêm vào

Độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại Tỉ lệ thu hồi phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%

2.3.4 Ứng dụng

Định lượng hàm lượng ba kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin (cephalexin, cefixim, cefdinir) trong chế phẩm có mặt trên thị trường

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Tính toán và xử lý thống số liệu trên phần mềm Microsolf Excel 2007 Một

số công thức tính toán giá trị thống kê như sau :