Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương bằng HPLC

Như vậy, trong sản xuất và trên lâm sàng đều cần một phương pháp xác định được nồng độ của amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương.. Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về định lượng

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2018

AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới ThS Vũ Ngân Bình

và ThS Nguyễn Phương Nhung đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết, tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ, định hướng và đặc biệt luôn cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên ở

Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về amoxicilin và acid clavulanic 2

1.1.1 Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic 2

1.1.2 Các dạng bào chế 3

1.1.3 Đặc điểm dược động học 3

1.2 Một số phương pháp phân tích amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương 4

1.3 Kỹ thuật HPLC 4

1.4 Tổng quan về xử lý mẫu trong dịch sinh học 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 Đối tượng nghiên cứu 8

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 8

2.2.1 Nguyên vật liệu 8

2.2.2 Thiết bị 8

2.3 Nội dung nghiên cứu 10

2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu 10

2.3.2 Thẩm định phương pháp 10

2.4 Phương pháp nghiên cứu 10

2.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu 10

2.4.2 Thẩm định phương pháp 11

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu 14

3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký 14

3.1.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 15

3.1.3 Lựa chọn pha động 16

3.1.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện 20

3.1.5 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương 21

3.1.6 Điều kiện sắc ký xây dựng được 24

3.2 Thẩm định phương pháp 24

3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 24

3.2.2 Độ chọn lọc 25

3.2.3 Đường chuẩn 25

3.2.4 Độ chính xác, độ đúng trong ngày 28

3.2.5 Độ ổn định dài ngày của các mẫu huyết tương 29

BÀN LUẬN 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Mẫu chuẩn nồng độ cao

Mẫu chuẩn nồng độ trung bình

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic 2

Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng AMX và CLA trong dịch sinh học 5

Bảng 2.1 Bảng pha các dung dịch chuẩn 9

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống 24

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát đường chuẩn của CLA 26

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát đường chuẩn của AMX 27

Bảng 3.4 Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của acid clavulanic 28

Bảng 3.5 Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của amoxicilin 29

Bảng 3.6 Độ ổn định dài ngày của CLA trong mẫu huyết tương 30

Bảng 3.7 Độ ổn định dài ngày của AMX trong mẫu huyết tương 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Sắc ký đồ AMX trên cột C8 14

Hình 3.2 Sắc ký đồ AMX trên cột C18 14

Hình 3.3 Công thức cấu tạo của cefadroxil 15

Hình 3.4 Sắc ký đồ huyết tương trắng với đệm phosphat 50 mM pH 3,5 16

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu AMX, CLA, CEF trong HT với đệm phosphat 50 mM pH 3,5 17

Hình 3.6 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM, pH 2,5, tỷ lệ thể tích 93:7 18

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu HT AMX, CLA, CEF với pha động đệm phosphat 50 mM, pH 2,5, tỷ lệ thể tích 93:7 18

Hình 3.8 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM pH 2,5 18

Hình 3.9 Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF trong HT với pha động đệm phosphat 50 mM pH 2,5 19

Hình 3.10 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 100 mM pH 2,5 19

Hình 3.11 Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF trong HT với pha động đệm phosphat 100 mM pH 2,5 19

Hình 3.12 Phổ hấp thụ tử ngoại của AMOX 20

Hình 3.13 Phổ hấp thụ tử ngoại của CLA 20

Hình 3.14 Phổ hấp thụ tử ngoại của CEF 20

Hình 3 15 Chồng phổ CLA trong dung dịch chuẩn CLA và trong mẫu huyết tương 22 Hình 3 16 Hệ số chồng phổ của CLA 22

Hình 3.17 Quy trình xử lý mẫu amoxicilin và acid claculanic trong huyết tương 23

Hình 3.18 Sắc ký đồ huyết tương trắng 25

Hình 3.19 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn trong huyết tương 25

Hình 3.20 Đường chuẩn acid clavulanic theo chuẩn nội 26

Hình 3.21 Đường chuẩn amoxicilin theo chuẩn nội 27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Amoxicilin là kháng sinh nhóm β-lactam có phổ diệt khuẩn rộng đối với nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram dương Amoxicilin kém bền với β-lactamase, do đó thường được phối hợp với acid clavulanic là một chất ức chế β-lactamase để tăng khả năng kháng khuẩn Amoxicilin và acid clavulanic có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam, danh mục thuốc chủ yếu sử dụng tại các cơ sở khám chữa bệnh được quỹ bảo hiểm y tế thanh toán và được sử dụng rộng rãi trong điều trị…[3] Mô hình dược động học của thuốc trên từng cá thể bệnh nhân đặc biệt là bệnh nhân nặng như bệnh nhân suy giảm chức năng gan, thận có sự dao động lớn Đặc biệt khi sử dụng thuốc với liều cao

có thể có hiện tượng kết tủa cặn tinh thể trong nước tiểu [6] Vì vậy việc theo dõi nồng

độ thuốc trong máu trên bệnh nhân sử dụng thuốc amoxicilin và acid clavulanic ở nồng

độ cao quan trọng trong việc giám sát hiệu quả điều trị, hạn chế tác dụng không mong muốn trong quá trình sử dụng thuốc

Amoxicilin là một kháng sinh được sản xuất phổ biến ở Việt Nam Tính từ năm

2010 đến năm 2015 đã có 182 số đăng ký trong nước được cấp phép để sản xuất amoxicilin Để nâng cao chất lượng và khả năng cạnh tranh của các chế phẩm, một số nhà sản xuất hướng tới đánh giá tương đương sinh học giữa thuốc sản xuất trong nước

và thuốc generic Như vậy, trong sản xuất và trên lâm sàng đều cần một phương pháp xác định được nồng độ của amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương đã được công bố, phần lớn sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector tử ngoại khả kiến sau khi tạo dẫn xuất với imidazol [5] hoặc phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng khối phổ sau khi chiết pha rắn [14] Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ đắt tiền và chưa phổ biến, việc dẫn xuất hóa làm cho quá trình xử lý mẫu phức tạp hơn

Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương” với những mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp amoxiclin và acid clavulanic trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Thẩm định phương pháp trên theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học của FDA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về amoxicilin và acid clavulanic

1.1.1 Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic

• Công thức cấu tạo và một số đặc điểm của amoxicillin (AMX) (dưới dạng trihydrat)

và acid clavulanic (CLA) được tổng hợp trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc điểm của amoxicilin và acid clavulanic

amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-

(2R,3Z,5R)-3-(2-oxa-1-azabicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylic [17]

hydroxyethyliden)-7-oxo-4-Tính chất lý

hóa

• Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng Khó tan trong nước và ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform Tan trong các dung dịch acid và kiềm loãng [2]

• pka1=3,2 và pka2= 11,7 [15]

• lgP =0,87 [15]

• Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, rất khó tan trong aceton [4]

• Dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ và

độ ẩm [10]

• Acid clavulanic ổn định nhất ở khoảng pH trung tính [9] Kém bền trong dung dịch đệm phosphat, acetat và borat [11]

• Amoxicilin là kháng sinh aminopenicilin phổ rộng, bán tổng hợp có hoạt tính diệt khuẩn, cả vi khuẩn Gram (-), (+) Amoxicilin liên kết và khử hoạt tính protein gắn kết penicilin (PBP) 1A nằm trên màng trong của thành tế bào vi khuẩn, làm gián đoạn quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn và làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn và phân hủy tế bào [3]

• Acid clavulanic là chất ức chế β-lactamase, được bán tổng hợp từ Streptomyces Acid clavulanic chứa một vòng β -lactam và liên kết mạnh với β-lactamase tại hoặc gần vị trí hoạt động của nó, do đó làm giảm hoạt động của enzym β-lactamase, bảo vệ các kháng sinh β-lactam khác khỏi phản ứng xúc tác β-lactamase, qua đó tăng cường tác dụng kháng khuẩn của chúng [3][9]

• Amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi β-lactamase, acid clavulanic có khả năng kháng khuẩn yếu do đó phối hợp amoxicilin và acid clavulanic giúp cho amoxicilin không bị β-lactamase phá hủy và mở rộng phổ kháng khuẩn của amoxicilin (đối với nhiều loại vi khuẩn thông thường đã kháng amoxicilin, penicilin khác và cephalosporin) [3][9]

1.1.2 Các dạng bào chế

Amoxicilin và acid clavulanic được phối hợp trong một số dạng chế phẩm sau:

• Bột pha hỗn dịch uống hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 250/31,25 mg; 500/62,5

• 55 - 70% amoxicilin và 30 - 40% acid clavulanic được thải qua nước tiểu dưới dạng hoạt động [3]

• Với viên nén có hàm lượng amoxicilin/acid clavulanic 875/125 mg sử dụng 2 lần/ ngày có thể đạt Cmax là 11,64 µg/mL (amoxicilin) và 2,18 µg/mL (acid clavulanic) Thời gian bán thải trong huyết tương của amoxicilin là 1,19 giờ và của acid clavulancic là 0,96 giờ [9]

• Chế phẩm tiêm tĩnh mạch có hàm lượng 1000/200 mg/mL có Cmax của amoxicilin là 105,4 µg/mL và acid clavulanic là 28,5 µg/mL Thời gian bán thải trong huyết tương của amoxicilin là 0,9 giờ và acid clavulanic là 0,9 giờ [9]

1.2 Một số phương pháp phân tích amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương

Ở Việt Nam và trên thế giới đã có nhiều công bố về phương pháp phân tích amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương người Mẫu huyết tương thường được

xử lý loại bỏ protein bằng nhiều tác nhân như acetonitril (ACN), methanol (MeOH), acid perclorid, hoặc chiết pha rắn [8][14] Acid clavulanic thường được tạo dẫn xuất với imidazol trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối với detector

tử ngoại khả kiến (UV-VIS) [5] Đối với các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) thì mẫu có thể phân tích trực tiếp sau khi loại bỏ protein bằng chiết pha rắn Điều này đã được giải thích do sự chuyển dạng của acid clavulanic thành methyl8-hydroxy-6-oxo-4-aza-2-octenoat trong các dung môi methanol, acetonitril [11] Những nghiên cứu sử dụng chiết pha rắn và rửa giửa giải bằng nước thì acid clavulanic không bị chuyển dạng và có thể tiến hành phân tích acid clavulanic mà không cần dẫn xuất hóa

Hầu hết các phương pháp định lượng trong huyết tương đều dùng chất chuẩn nội, thường là các kháng sinh trong cùng nhóm, có cấu trúc phân tử tương tự chất phân tích Một số phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong dịch sinh học được trình bày trong bảng 1.2

1.3 Kỹ thuật HPLC

HPLC là kỹ thuật tách các chất dựa trên tương tác khác nhau của các chất phân tích với pha tĩnh và pha động Chất phân tích được lưu giữ trên cột nhồi các hạt pha tĩnh theo các tương tác phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh và chất phân tích, sau đó được rửa giải ra ngoài theo dòng pha động Kỹ thuật hay gặp là sắc ký lỏng phân bố, sử dụng pha động là hỗn hợp các dung môi và pha tĩnh là silica được dẫn xuất hoá Sắc ký phân

bố được chia làm hai loại sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo Sắc ký phân bố pha đảo sử dụng pha tĩnh kém phân cực như C18, C8 và hỗn hợp dung môi phân cực như acetonitril, methanol, nước, dung dịch đệm pha trong nước Kỹ thuật sắc

ký này thường áp dụng với những chất kém phân cực hoặc phân cực trung bình và có phân tử lượng dưới 2000 Các nghiên cứu xác định AMX và CLA được liệt kê trong bảng 1.2 đều sử dụng sắc ký phân bố pha đảo

Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng AMX và CLA trong dịch sinh học

Tài liệu Pha tĩnh Xử lý mẫu Chuẩn nội Pha động Detector LOD, LOQ

[5] Zorbax SB C8 (150

x 4,6 mm, 5 μm);

Kết tủa bằng ACN, Dẫn xuất bằng imidazol

Terbutalin MeOH: dung dịch đệm

imidazol

MeOH: dung dịch đệm phosphat pH 3,2

2,5 mL/phút

227 nm LOD

AMX= 0,5 µg/mL CLA= 0,1 µg/mL [18] Cột C8 (250 × 4,6

mm, 5 μm)

Kết tủa protein bằng MeOH

ACN: dung dịch đệm phosphat chứa tetramethylamoni clorid

=93:7

1 ml/phút

220 nm LOD

AMX= 0,05 mg/L, CLA= 0,08 mg/L LOQ

AMX= 0,625 mg/L, CLA= 0,3125 mg/L [7] Cột C8 (150 x 4,6

mm, 5 μm)

Kết tủa protein bằng MeOH

Amoxicilin và acid clavulanic

ACN: dd đệm phosphat

pH 3= 95:5 0.8 mL/phút

205 nm

[13] C18 (250 x 4,6 mm,

5 µm)

Cột chiết pha rắn Oasis HLB, rửa giải bằng nước

Ampicilin và amoxicilin D4

ACN: amoni acetat 2 mM= 80:20

MS LLOQ

AMX=50,43 ng/mL, CLA=25,28 ng/mL [14] Acquity HSS T3

(2,1 x 100 mm, 1,8

µm)

Cột chiết pha rắn Oasis HLB, rửa giải bằng nước

Ampicilin Hỗn hợp acid formic

0,2% trong ACN và acid formic 0,2% trong nước

MS LLOQ

AMX= 0,05 µg/mL CLA= 0,025 µg/mL

Sau khi các chất phân tích được tách ra bằng cột sắc ký, chúng được phát hiện bởi một bộ phân phát hiện phù hợp Hai loại detector hay được sử dụng là UV-VIS và khối phổ MS Detector UV- VIS thông dụng hiện nay là detector mảng iod (DAD) cho phép định lượng đồng thời tại nhiều bước sóng do đó có thể chọn các bước sóng tối ưu cho các chất phân tích Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn do đó có thể định lượng được ở nồng độ thấp hơn Tuy nhiên thiết bị LC-MS kém phổ biến và đắt tiền hơn

so với HPLC

Các chất phân tích được định lượng dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất cần phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của chất đó Dựa trên nguyên tắc này, ta có các kỹ thuật định lượng hay dùng trong phân tích dịch sinh học:

• Phương pháp ngoại chuẩn: Là phương pháp định lượng dựa trên cơ sở so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của một hoặc nhiều mẫu chuẩn đối chiếu và mẫu thử được phân tích trong cùng điều kiện sắc ký Chất chuẩn ngoại là chất có bản chất là chính chất phân tích, độ tinh khiết cao và đạt yêu cầu của chất chuẩn theo quy định Khi phân tích các chất trong dịch sinh học, nồng độ của các chất dao động lớn do đó phương pháp hay được sử dụng là phương pháp đường chuẩn Tuy nhiên phương pháp ngoại chuẩn chỉ được sử dụng khi hiệu suất xử lý mẫu có độ lặp lại cao

• Phương pháp nội chuẩn: thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng như nhau của một chất chuẩn thứ hai được gọi là chuẩn nội Các chất được định lượng dựa trên so sánh tỷ lệ diện tích giữa chất phân tích và chất chuẩn nội (Sx/SIS) với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn ngoại và chất chuẩn nội (SES/SIS) Chất chuẩn nội thường có cấu trúc, tính chất gần giống với chất cần phân tích và đảm bảo yêu cầu của một chất chuẩn Việc thêm chất chuẩn nội vào sẽ làm giảm sai số của quá trình xử lý mẫu trải qua nhiều bước, hiệu suất không lặp lại Các chất được định lượng theo đường chuẩn thiết lập dựa trên mối liên hệ giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn ngoại có nồng độ khác nhau và chuẩn nội với nồng độ của chất chuẩn ngoại [1]

1.4 Tổng quan về xử lý mẫu trong dịch sinh học

Dịch sinh học thường có nền mẫu rất phức tạp và các chất phân tích thường tồn tại

ở nồng độ rất thấp Các bước của quá trình phân tích trong dịch sinh học bao gồm: lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, tách, phát hiện, định tính và định lượng Mẫu huyết tương thường được sử dụng nhiều trong nghiên cứu HPLC

Chuẩn bị mẫu là giai đoạn rất quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần tạp không mong muốn và làm nhiễu nền phân tích Nếu protein trong huyết tương được tiêm vào cột sắc ký thì có thể bị tủa bởi pha động gây tắc đường dẫn, tăng áp suất hệ thống Phương pháp phổ biến để loại protein huyết tương là kết tủa protein bằng acid pecloric hoặc dung môi hữu cơ tan trong nước như acetonitril và methanol Sau đó có thể chiết ngược bằng dung môi hữu cơ kém phân cực hơn như dicloromethan hoặc cloroform để thu lớp chứa chất phân tích ở trên Cô nitơ dịch chiết có thể làm tăng tỷ lệ thu hồi các chất phân tích trong quá trình phân tích [5][7], Ngoài ra các phương pháp chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) trong LC-MS [13][14] cũng được dùng để làm sạch mẫu, làm giàu chất phân tích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dùng trong nghiên cứu là mẫu tự tạo của amoxicilin, acid clavulanic và cefadroxil trong huyết tương trắng

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

• Acid clavulanic: Chuẩn nguyên liệu, hàm lượng 40,9%

• Huyết tương trắng (Viện Huyết học và truyền máu Trung ương)

• Kali dihydrophotphat (Merck)

• Natri hydroxyd (Merck)

• Acid phosphoric (Merck)

• Máy ly tâm Kubota 6500

• Cân phân tích Satorius d= 0,1 mg

• Tủ lạnh âm sâu - 80oC Model panasonic MDF-594-PB

• Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H

• Máy lắc xoáy Labinco L46

• Máy đo pH Cyberscan Eutech Instruments

• Micropipet 10-100 µL ABMATE pro, 100-1000 µL Nichipet EX

Dung dịch đệm phosphat 100 mM pH 2,5: Cân chính xác khoảng 13,6 g KH2PO4

vào cốc có mỏ thể tích 1 L với khoảng 980 mL nước cất hai lần Chuẩn dung dịch trên bằng H3PO4 đặc đến pH 2,5, thêm nước vừa đủ bình định mức 1 L Lọc qua màng lọc 0,45 µm

• Pha các dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuẩn đơn amoxicilin, acid clavulanic và cefadroxil: Cân chính xác khoảng 10 mg amoxicillin, 20 mg acid clavulanic và 10 mg cefadroxilvào 3 bình định mức 10 mL để được các dung dịch gốc amoxicilin 1000 ppm, acid clavulanic 818 ppm,

và cefadroxil 1000 ppm Với dung dịch gốc acid clavulanic cần lọc qua giấy lọc để loại avicel

Từ dung dịch gốc của amoxicilin và acid clavulanic dùng micropipet pha loãng với nước để thu được hỗn hợp amoxicilin/acid clavulanic có nồng độ 9/2,454 ppm; 15/4,09 ppm; 30/8,18 ppm; 60/16,36 ppm; 180/49,08 ppm; 300/81,8 ppm (bảng 2.1)

Pha dung dịch chuẩn nội: Từ dung dịch gốc cefadroxil 1000 ppm sử dụng micropipet pha loãng với nước để được dụng dịch nồng độ 30 ppm (dung dịch A)

Bảng 2.1 Bảng pha các dung dịch chuẩn

Sau đó mỗi ống cho 50

µL dung dịch hỗn hợp và

100 µL dung dịch A và 250

µL huyết tương trắng

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu

• Lựa chọn cột sắc ký

• Lựa chọn pha động

• Lựa chọn chất chuẩn nội

• Lựa chọn bước sóng phát hiện

• Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương

2.3.2 Thẩm định phương pháp

Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn thẩm định các phương pháp phân tích trong dịch sinh học của Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) theo các tiêu chí sau:

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và xử lý mẫu

Dựa trên đặc điểm về độ phân cực của AMX và CLA, một số tài liệu tham khảo trong và ngoài nước tôi quyết định sử dụng sắc ký lỏng pha đảo để phân tích hai chất này trong huyết tương Tôi tiến hành khảo sát các điều kiện xử lý mẫu và sắc ký sau:

• Lựa chọn cột sắc ký: Dựa trên điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm và tham khảo các tài liệu [5][12], chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai loại cột sắc ký pha đảo hay được sử dụng dụng là cột Supelco C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) và cột Inertsil® ODS-

3 C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Xác định cột có khả năng lưu giữ AMX và CLA với thời gian phù hợp, khả năng tách các chất phân tích ra khỏi nhau và độ cân xứng của pic sắc

chất được lựa chọn khi tách hoàn toàn khỏi nền huyết tương trắng, tách hoàn toàn với AMX và CLA, có thời gian lưu gần với các chất phân tích

• Lựa chọn pha động: Dựa trên tài liệu tham khảo [18] tôi lựa chọn hỗn hợp dung dịch đệm phosphat và ACN làm dung môi pha động và cố định tốc độ dòng pha động 1ml/phút Khảo sát pH pha động (2,5; 3; 3,5; 6,8) và các nồng độ đệm 10 mM, 50 mM,

100 mM, tỷ lệ thể tích dung dịch đệm phosphat: ACN (97:3, 96:4, 95:5, 93:7) Căn cứ lựa chọn pha động là khả năng tách AMX và CLA hoàn toàn ra khỏi nhau và tách hoàn toàn ra khỏi nền huyết tương

• Lựa chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-VIS tại vị trí pic của các chất phân tích và chuẩn nội, tìm bước sóng phù hợp để có thể phát hiện được các chất ở nồng độ thấp và tách được khỏi nền huyết tương

• Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương: Dựa trên các nghiên cứu trước [5][18], tôi xử lý mẫu bằng dung môi MeOH hoặc ACN để loại bỏ protein huyết tương Mẫu huyết tương sau đó được chiết ngược bằng dung môi kém phân cực như cloroform

Để khắc phục việc CLA bị chuyển dạng trong các dung môi hữu cơ tôi tiến hành cô mẫu đến cắn và hoà tan lại bằng nước

- Trên SKĐ của mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và IS phải được nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác (S/N ≥ 3)

- Tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất

5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng, tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS,

đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng

2.4.2.2 Tính tuyến tính

Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của thiết bị

và nồng độ chất phân tích trong mẫu

Các điều kiện đường chuẩn xây dựng cần đáp ứng:

• Đường chuẩn xây dựng bao gồm từ 6 đến 8 mẫu chuẩn bao phủ khoảng nồng độ tuyến tính, bao gồm LLOQ Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r ≥ 0,98 (xác định bằng phương pháp bình phương tối thiểu)

• Độ lệch so với nồng độ định lượng phải nhỏ hơn 20% ở LLOQ và nhỏ hơn 15%

ở các nồng độ khác

• Ít nhất 4 trên 6 điểm chuẩn phải thỏa mãn tiêu chí trên, bao gồm điểm thấp nhất

và cao nhất của đường chuẩn

2.4.2.3 Độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ thu hồi

• Độ đúng là giá trị phản ánh độ gần sát của nồng độ chất phân tích định lượng được so với giá trị thực, độ đúng được xác định trên tối thiểu 3 mức nồng độ trong khoảng nồng độ làm việc dự kiến, mỗi nồng độ thực hiện trên ít nhất 5 mẫu Độ đúng phải nằm trong khoảng 85- 115% so với giá trị thực, riêng với LLOQ yêu cầu trong khoảng 80- 120%

• Độ chính xác của phương pháp phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị hệ số biến thiên CV (%) Yêu cầu giá trị CV ≤ 15%, riêng với LLOQ yêu cầu CV ≤ 20%

Độ chính xác có thể đánh giá trên độ chính xác trong ngày, độ chính xác khác ngày

và độ tái lặp

• Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá trình xử lý mẫu Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của các mẫu chuẩn thêm vào nền mẫu và xử lý mẫu với nồng độ thực của chất chuẩn tinh khiết không qua xử lý mẫu Tiến hành trên 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ 3 mẫu riêng biệt

Tỷ lệ thu hồi không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải chính xác, ổn định và lặp lại

2.4.2.4 Độ ổn định

Các mẫu phân tích trong dịch sinh học trải qua quá trình lấy mẫu, xử lý mẫu, bảo quản mẫu (ngắn hạn, dài ngày), qua chu kỳ đông lạnh - rã đông và quá trình phân tích mẫu nên cần đánh giá độ ổn định của chất phân tích Độ ổn định được đánh giá bằng cách so sánh kết quả phân tích các mẫu sau bảo quản với các mẫu mới chuẩn bị ít nhất

3 lần lặp lại ở mỗi mức nồng độ khác nhau (LQC, MQC và HQC) Trong thẩm định

phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:

• Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc sau thời gian ngắn và/hoặc thời gian dài

Yêu cầu: Nồng độ của dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%

• Độ ổn định qua ba chu kỳ đông rã

Được tiến hành ở các nồng độ LQC, MQC, HQC, mỗi nồng độ ít nhất ba mẫu Các mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ đự kiến bảo quản trong 24 giờ và để tự rã đông ở nhiệt độ phòng Khi hoàn toàn rã đông, các mẫu được tái đông ở cùng điều kiện trong 12- 24 giờ Các mẫu được xử lý và phân tích ở chu kỳ thứ ba